全 文 ：图 2　鸡血藤聚类树状图
F ig. 2　Cluster ing analysis of Caulis Sp a tholobi
H PL C 指纹图谱分析, 结果表明正品鸡血藤中有 11
个峰, 和已知对照品相比较, 其中, 峰 1, 2, 5, 7, 8 和
9 分别是原儿茶酸、对羟基苯甲酸、大豆黄素、刺芒
柄花素、樱黄素和大黄素。
412　11 个峰中, 其中非共有峰 6 个, 共有峰 5 个:
分别是峰 1 (原儿茶酸)、峰 5 (大豆黄素)、峰 7 (刺芒
柄花素)、峰 8 (樱黄素)、峰 10 (大黄素) ; 共有峰的相
对保留时间分别为: 01046, 01664, 11000, 11198,
11383, 相对峰面积分别为: 01819, 01221, 11000,
01331, 01458。11 个色谱峰作为鸡血藤色谱峰的共
性, 可作为鸡血藤的H PL C 指纹图谱的特征。
413　鸡血藤及其混淆品的H PL C 指纹图谱特征有
一定差别, 5 个共有峰在各混淆品中是缺失的, 故各
自相对保留时间和相对峰面积都有不同, 从而达到
鉴别的目的。如厚果鸡血藤和大血藤 5 个共有峰都
没有, 白花油麻藤缺峰 5, 亮叶崖豆藤缺峰 1, 光叶崖
豆藤缺峰 1 和峰 10, 香花崖豆藤缺峰 8 和 10, 红鸡
血藤、昆明鸡血藤均缺峰 5 和峰 8。
414　以 11 个色谱峰为特征峰, 运用模糊聚类对其
进行分析, 结果表明 18 个样品能较好地分成两大
类, 很明显地区分鸡血藤的正品及其混淆品种。
415　聚类方法曾采用了系统聚类方法, 数据运用对
数转换、平方根、标准化等, 聚类距离运用了欧氏距
离、马氏距离、兰氏距离、卡方; 运算方法采用离差平
方和等多种方法, 其结果均不理想。后采用模糊聚类
分析方法, 以中心化转换数据, 绝对指数计算聚类距
离。其结果较好, 与经典形态鉴定具有一致性, 能达
到鉴定的目的。
References:
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牛膝的 rD NA ITS 序列分析
王淑美1, 梁生旺13 , 周开亚2, 刘忠权2, 冯卫生1, 吴明侠1Ξ
(11 河南中医学院 药物分析学科, 河南 郑州　450008; 21 南京师范大学遗传资源研究所, 江苏 南京　210097)
摘　要: 目的　探讨不同产地牛膝的 IT S 的序列变异, 为鉴别牛膝提供DNA 分子标记。方法　利用特异性 PCR 技
术对牛膝的 rDNA IT S 区碱基序列进行测定, 报道了牛膝的 rDNA IT S 区的碱基序列。结果　得到核糖体DNA 中
的 IT S 及 518 S rDNA 完全序列, 18 S 和 26 S rDNA 部分序列, 共约 650 bp。牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明
显差异, 不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。结论　此法可用于牛膝种间及真伪品鉴别。
关键词: 分子鉴定; 牛膝; PCR; 序列分析
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 05 0559 04
R ibosoma l rD NA ITS sequence ana lysis of root of A chyran thes biden ta ta
W AN G Shu2m ei1, L IAN G Sheng2w ang1, ZHOU Kai2ya2, L IU Zhong2quan2,
FEN G W ei2sheng1, W U M ing2x ia1
(1. D epartm ent of Pharm aceu tical A nalysis, H enan Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, Zhengzhou 450008, Ch ina;
2. Inst itu te of Genetic R esources, N an jing N o rm al U niversity, N an jing 210097, Ch ina)
Abstract: Object　To study the co rrela t ion betw een IT S sequence varia t ion of roo t of A chy ran thes
·955·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
Ξ 收稿日期: 2003208211
基金项目:“九五”国家科技攻关项目 (992929201206)
作者简介: 王淑美 (1966—) , 女, 山东省海阳市人, 1990 年毕业于上海医科大学药化专业, 2001 年获硕士学位, 河南中医学院药物分析学
科副教授, 硕士生导师, 主要从事药物质量控制研究。T el: (0371) 5680562　E2m ail: ShmW ang@Sina. Com3 通讯作者　T el: (0371) 5961380　E2m ial: SwL iang371@ 163. com
bid en ta ta B lum e from differen t hab ita t to p rovide their DNA mo lecu lar m arker fo r iden t if ica t ion of A .
bid en ta ta. M ethods　To determ ine rDNA IT S base sequence by pecu liar PCR techno logy. Results　T he
comp leted sequence of IT S and 518 S rDNA , and the part ia l sequence of 18 S rDNA and 26 S rDNA of roo t
of A . bid en ta ta w ere ob ta ined. T hey are abou t 650 bp. T here is obviou s diversity among the roo ts of A .
bid en ta ta , Cy a thu la of f icina lis Kuan, and A . asp era , w h ile there is no difference among the roo ts of A .
bid en ta ta from differen t hab ita t and by differen t cu lt ivacat ion b reeds. Conclusion 　T he m ethod can be
u sed to iden t ify the roo t of A . bid en ta ta among differen t species and to differen t ia te its fakes.
Key words: mo lecu lar iden t if ica t ion; the roo t of A chy ran thes bid en ta ta B lum e; PCR; sequence analy2
sis
　　牛膝为苋科植物牛膝属牛膝 A chy ran thes
bid en ta ta B lum e 的根, 具有补肝肾, 强筋骨, 活血通
瘀, 引血下行之功效[1 ]。关于牛膝的化学成分及药理
研究报道颇多。由于高等植物核糖体 rDNA IT S 区
的DNA 序列的进化速率较快[2 ] , 且与植物生活型
呈相关性, 近年已被广泛用于种内变异和种间、近缘
属间的分子系统学研究[3～ 5 ]。尽管苋科很多植物用
于分子系统学研究, 但到目前为止仍没有牛膝的
DNA 序列的报道。本实验对牛膝的 rDNA IT S 区序
列进行了测定, 为鉴别牛膝提供DNA 分子标记。
1　材料
111　牛膝药材采自河南、安徽、山东、河北、内蒙古
等地, 经河南中医学院陈随清博士鉴定为苋科植物
牛膝属牛膝A . bid en ta ta B lum e 的根, 符合《中华人
民共和国药典》2000 年版一部规定。
112　仪器与试药: 水浴恒温箱; 电泳装置; 微量离心
机; 紫外线观察装置及照相设备; PTC—200 型 PCR
仪; AB É 310 全自动测序仪 (PE 公司)。脱皮甾酮
对照品 (含量> 9810% , 由本实验室自制) ; DL 2000
(T akara 公司) ; CTAB 抽提液 [ 50 mmo löL T ris2
HC l pH 8, 017 mo löL N aC l, 10 mmo löL ED TA pH
8, 2% CTAB , 40 mmo löL 22巯基乙醇 (使用前迅
速加入) ]; T E 缓冲液: T ris2HC l pH 810, 10 mmo lö
L ED TA ; 1 mmo löL T aq 酶; 其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
211　总DNA 提取: 取牛膝药材粉末约 5 g, 用液氮
于研钵中研磨成粉末状, 将研磨好的组织粉末装入
2 个 5 mL 的离心管中 (以便重复实验)。向离心管中
加入 3 mL 65 ℃预热的CTAB 抽提液, 65 ℃水浴加
热 45 m in, 其间上下颠混 2～ 3 次。取出离心 (10 000
röm in) , 取上清液, 加入等体积氯仿2异戊醇 (24∶1)
温和颠倒 5 m in 后, 离心 10 m in, 取上清液, 再用氯
仿2异戊醇重复抽提一次。小心吸取上清液, 加入
215 倍体积的无水乙醇和 1ö10 体积的 3 mo löL
N aA c, 混匀, 置入 - 20 ℃冰箱中约 1 h, 以沉淀
DNA。10 000 röm in 离心 15 m in, 轻轻倒掉乙醇。用
70% 乙醇清洗 2 次, 每次清洗后 10 000 röm in 离心
2 m in, 轻轻倒掉残留的乙醇, 自然晾干管内的
DNA , 加入适量的 T E 或 ddH 2O 溶解DNA , 最后用
DNA 纯化试剂盒纯化 DNA , 4 ℃贮存备用。用
1%～ 018% 的琼脂糖进行电泳检测 (TBE 系统)。见
图 1。从图中可见, 所有样品均提取出DNA , 且量较
大 (样品 1～ 16 见表 1)。
M 2DNA M arker DL 2000
图 1　D NA 提取物电泳图谱
F ig. 1　Agarose gel electrophoresis of D NA
extracted from var ious A. biden ta tas
212　PCR 扩增及产物纯化: 根据东川芎 Cn id ium
of f icina le M ak ino 18 S rDNA [6 ] 及 菊 科 (H ypo2
cho reris) 属 26 S rDNA 的序列设计出 IT S 的扩增
引 物 P 1, P 2。 P 1 ∶ 5’2CGTAA CAA GGT T TCCG
TA GGT GAA C23’, 位于 18S 上; P 2 ∶5’2T TA T T
GA TA T GCT TAAA CTCA GCGGG23’, 位 于 26S
上; 由上海生物工程有限公司合成, 用 ddH 2O 配成
10 pmo löL 溶液待用。
　　PCR 反应体积 30 ΛL , 反应液含 10 mmo löL
T ris2HC l pH 813, 50 mmo löL KC l, 115 mmo löL
M gC l2, 011% T riton · X2100, 210 mmo löL
dN T PS, 引物 P 1, P 2 各 10 mmo löL , 1 U T aq 酶和模
板DNA 约 100～ 150 ng, 用 ddH 2O 补足体积。反应
物在 PTC2200 型 PCR 仪上进行, 循环参数为 95
·065· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
℃, 预变性 4 m in, 然后经 95 ℃变性 40 s, 52 ℃退火
40 s, 72 ℃复性 2 m in, 完成 30 个循环后, 72 ℃延伸
7 m in 补齐。以 dd H 2O 代替模板DNA 作空白对照。
扩增完后, PCR 产物用W atson 试剂盒纯化, 按试剂
盒操作指南进行。取 PCR 反应液 5 ΛL 于 110% 琼
脂糖凝胶上用 1×TBE 电泳缓冲液电泳; 溴化乙锭
显色后在紫外灯下拍照, 见图 2。从图中检测结果
看, 所有样品 PCR 扩增产物效果良好。
表 1　不同产地牛膝样品
Table 1　Samples of A. biden ta ta from differen t habita t
样品 样品名称及品种 产地
1 土牛膝 四川
2 川牛膝 四川
3 牛膝 安徽亳州
4 牛膝 山东泰安岱庙区六郎坟
5 牛膝 山东泰安宁阳县
6 白牛膝 河南武陟大封驾部村
7 牛膝 (风筝棵) 河南武陟大封驾部村
8 牛膝 (园叶) 河南武陟大封驾部村
9 牛膝 内蒙赤峰
10 牛膝 河北安国市郑章乡新安村
11 牛膝 (黑桃纹) 河南武陟大封驾部村
12 牛膝 (特肥) 河南武陟大封驾部村
13 牛膝 河南武陟大封唐廊村
14 牛膝 河南武陟大封东宋村
15 牛膝 河南武陟大封驾部村
16 牛膝 河南武陟大封驾部村
M 2DNA M arker DL 2000 (T akara)
图 2　PCR 产物电泳图谱
F ig. 2　Agarose gel electrophoresis of PCR products
213 　DNA 序列测定: 用 B igD yeTM 测序试剂盒
(PE· A pp lid·B io system s) 进行测序反应, 测序参
数为: M ix 1 ΛL , 纯化后的DNA 片段 15～ 45 ng,
P rim er 116 pmo l, 缓冲液 112 ΛL , ddH 2O 适量。测序
反应条件为: 95 ℃预变性 5 m in, 95 ℃ 30 s, 50 ℃
20 s, 60 ℃ 4 m in, 共 30 个循环。扩增产物纯化后用
10 ΛL T SR 溶解。热循环仪上变性 2 m in, 移入全自
动测序专用管, 用AB I310 全自动测序仪进行序列
测定。操作过程按产品说明书。
214　DNA 序列数据分析: 不同产地牛膝样品见表
1, 序列分析结果见图 3。IT S21 和 IT S22 的起止范围
图 3　不同产地牛膝的碱基序列图
F ig. 3　A l ignmen t of ITS-1, 518 S rD NA and ITS-2
nucleotide sequence of 16 samples of A.
biden ta ta from diffren t habita ts
·165·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
参照苋科植物 rRNA 基因 IT S 片段序列确定, 所得
DNA 序列输入计算机后, 用C lu sta lW 软件对序列
进行对位排列, 并输以人工校对。以尽量减少排列所
需缺失的数目。得到的序列用M EGA (M o lecu lar
Evo lu t ionary Genet ics A nalysis V ersion 1102)软件
进行系统发生分析。在图中 18 S, 26 S 及 518 S 用阴
影部分所示,“·”表示具相同碱基,“- ”表示缺失,
序列上方的数字为排序后的各碱基的位置编号。
215　碱基序列大小: 共测得 16 个牛膝样品 IT S21,
518 S rDNA 和 IT S22 全序列 18 S rDNA 基因 3’端
和 26S rDNA 基因 5’端部分碱基序列, 共约 630
bp。其中 IT S21 约为 230 bp , 518 S rDNA 约为 160
bp , IT S22 约为 209 bp (见表 2)。
表 2　ITS-1, 518 S rD NA , ITS-2
的碱基大小及 G+ C 的含量
Table 2　Size and G+ C con ten ts of ITS-1,
518 S rD NA , and ITS-2 sequence
样品
IT S21öbp G+ Cö% 5. 8 S rDNAöbp G+ Cö% IT S- 2öbp G+ Cö% 总计öbp
1 231 51. 3 160 50. 6 209 52. 6 600
2 231 5113 160 50. 6 206 56. 8 597
3～ 16 231 5113 160 50. 6 206 56. 8 597
3　讨论
311　通过对 16 个牛膝样品序列分析可知, 不同产
地牛膝基因变异不大, 种间有明显差异, 且差异均在
IT S2区内, 川牛膝 IT S21 有差异, 土牛膝 IT S21 及
IT S22 均有差异, 说明 IT S 区易变异。此方法可用于
牛膝种间及真伪品鉴别, 不能用于鉴别道地药材。
312　牛膝属苋科植物牛膝含大量牛膝多糖, 在提取
DNA 时与DNA 一起沉淀, 常常像凝胶一样, 很难
去除, 并抑制随后 PCR 中DNA 多聚酶的活性。通
过DNA 纯化的方法可以去除这些物质。其药用部
位为根茎类且多糖含量高, 故药材提取量要大, 用 5
mL 离心管, 大体积抽提。
313　实验过程中发现, 提取的DNA 用 5 ΛL 点样
电泳检测, 有时并不能看到DNA , 但并不意味着没
有抽提到DNA。可以继续 PCR 扩增。将DNA 模板
适当增多, 有时同样可得到好的 PCR 扩增产物。只
有检测不到 PCR 扩增产物才能确定没有抽提到
DNA。
314　PCR 扩增产物用试剂盒纯化后, 如果电泳检
测产物仍不纯, 一般可采取提高反应条件 (如退火温
度) , 切胶纯化、克隆纯化等措施。本实验的 3 号样品
即采用克隆技术才达到良好的测定效果。
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盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期薯蓣皂苷元含量的差异性研究
曹玉芳1, 2, 王太霞1, 3, 胡正海1Ξ
(11 西北大学植物研究所, 陕西 西安　710069; 21 莱阳农学院生命科学学院, 山东 莱阳　265200;
31 河南师范大学生命科学学院, 河南 新乡　453002)
摘　要: 目的　揭示盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期中皂苷的积累与分布以及薯蓣皂苷元含量的差异。方
法　组织化学和高效液相色谱法 (H PL C)。结果　皂苷主要分布在基本组织内, 有小维管束分布的区域皂苷积累最
丰富, 薯蓣皂苷元的含量也最高; 其次是无维管束分布的区域; 有大维管束分布的区域皂苷积累最少, 薯蓣皂苷元
的含量最低。结论　雄株 3 个区域的皂苷元含量均明显的高于雌株, 雌雄同株其含量界于雄株和雌株之间。
·265· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
Ξ 收稿日期: 2003208230
作者简介: 曹玉芳 (1963—) , 男, 山东莱西市人, 博士生, 副研究员, 主要从事植物学、药用植物学和结构植物学的教学与科研工作, 已发
表论文 30 余篇。T el: (0535) 29221453 通讯作者　E2m ail: zhenghaihu@yahoo. com. cn