全 文 ：·1864· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
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茛菪发根培养体系的建立
陆倍倍1，张磊-，开国银z，张汉明1，丁如贤1，陈万生3’
(1．第二军医大学药学院生药教研室，上海200433；2，上海交通大学植物生物技术研究中心农业与生物学院复旦
交大一诺丁汉植物生物技术研发中心生命科学技术学院。上海200030；3．第二军医大学长征医院，上海200003)
摘 要：目的 建立莨菪Hyoscyamusniger的发根培养体系。方法分别用A4、LBA9402和C58C1三种发根农杆
菌菌株转化莨菪子叶受体，获得发根-测定发根的生长酋线和比较不同因素对发根生长量的影响；PCR鉴定转化发
根；莨菪发根中生物碱类含量的测定，结果首次利用发根农杆菌A4、LBA9402、C58C1三种菌株成功从莨菪中诱
导出发根，并建立了莨菪发根摄优的培养体系；经PCR鉴定证明Ri质粒的T—DNA已转化进莨菪的发根中。结论
莨菪发根培养体系的建立为利用遗传代谢工程手段调节莨菪次生代谢物含量和进行药用活性成分的工业化生产
奠定了基础。
关键词：莨菪；发根农杆菌；发根
中图分类号：R282．02 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12186405
Establishmentof airyootcultureofHyoscyamusniger
LUBeibeil，ZHANGLeil，KAIGuo—yin2，ZHANGHanmin91，DINGRu—xianl，CHENWan—shen91
(1．DepartmentofPharmacognosy，SehoolofPharmacy，TheSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433·
China：2．PlantBioteehnologyResearchCenterofShanghaiJi oTongUniversity．SchoolofAgricultureandBiology，
FudanSJTU—NottinghamPlantBiotechnologyReaearchandDevelopmentCenter．SchoolofLifeScienceandTechnology，
Shanghai200030，China；3．ChangzhengHospitaloft eSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China)
Abstract：ObjectiveToestablishthecuhuralsystemforhairyootofHyoscyamusniger．Methods
HairyootofH．nigerwasobtainedfromcotyledonxplantsafterinfectedwithAgrobacteriumrhizogenes
strainsA4，LBA9402，andC58C1，respectively．Thegrowthcurvesweredeterminedandtheffectsof
differentfactorsnthegrowthof airyootwerecompared．ThetransformationofRiT—DNAwas
examinedbyPCR．Andthecontentsofalkaloidsinhairyootweredetermined．ResultsThehairyootof
H．nigerwasuccessfullyinducedbyusingA．rhizogenesstrainsA4，LBA9402，andC58C1forthefirst
timeandthebestsystemofhairyootculturewasestablished．ThetransformationofT—DNAfromRi
plasmidtothehairyootwasconfirmedbyPCRanalysis．ConelusionThestablishmentofcultural
systemforhairyootofH．nigerlaysfoundationforegulatingthesecondarymetabolismofH．nigerby
geneticengineeringtechniqueandforthelarge—scaleproductionofactivedrugcomponents．
Keywords：HyoscyamusnigerL．；Agrobacteriumrhizogenes；hairyroots
自从发根农杆菌Ri质粒被人们发现和认识以 来，它在许多领域都显示出极其广泛的应用前景。药
鉴釜品留：翌蒙薯写诗植物生物技术重点实验室开放基金(KJs03080)
尊翥摹器擎雉黯坚8。之：{爵器亏磊景鸯芋。譬恶毒：}耋恙：璺烹萼暑著烹薏兽工程方面的研究
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万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 865·
用植物转化天然的发根农杆菌Agrobacteriura
rhizogenes载体系统可以为提高其次生代谢物的产
量提供新的途径[1]。因此利用发根农杆菌转化药用
植物建立发根培养体系，实现次生代谢物质的工业
化生产以解决中药资源的短缺问题越来越受到人们
的重视。相对于常规细胞培养，发根培养体系具有生
长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力
强而且稳定及向培养液释放部分代谢产物等优
点o]。另外，Ri质粒还是植物基因工程理想的载体，
以Ri质粒为载体可将抗虫、抗病基因或植物次生代
谢物合成关键酶基因整合到植物基因组并得到表
达，从而达到改良植物性状、提高次生代谢物含量的
目的‘3～“。
莨菪l-IyoscyamusnigerL．，又名横唐《本经》、
行唐《别录》，为常用中药，以种子、根、叶入药，具解
痉镇痛、安心定痫之功效。其主要的药用化学成分是
莨菪烷生物碱莨菪碱(其外消旋体阿托品)和东茛菪
碱⋯。在医用方面这两种成分是作用于副交感神经
系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛的功能””]。
由于两者对中枢神经系统有不同的作用，目前在商用
市场东莨菪碱的需求量是(一)莨菪碱的10倍。一些
茄科植物已经作为商业化生产莨菪烷生物碱的来源。
笔者利用发根农杆菌Ri质粒首次成功地从莨
菪H．nigerL．诱导出毛状根，筛选出了各自的生
长快速的优质株系，建立了发根培养体系，为进一步
利用遗传代谢工程手段调节莨菪次生代谢物含量和
进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。
1材料与方法
1．1发根农杆菌菌株：A4，LBA9402，C58C1。
1．2植物材料：选取胚率50％～90％的莨菪种子，
先用75％乙醇浸泡1min后用无菌水洗一次；然后
在0．1％HgCI：溶液中浸泡10min，最后用无菌水
冲洗3～5次，以达到种子表面灭菌的目的。将经过
灭菌处理的种子在无菌操作条件下播种到MS空白
培养基上，置于4000ix×12h日光照，28℃条件下
发芽。大约两周后种子发芽长出实生苗。
1．3 叶盘法转化莨菪：用无菌牙签挑取YEB选择
平板上的阳性菌落，接种于2mLYEB液体于28
℃，200r／rain振荡培养24～36h；室温下4000×
g，离心10min；弃上清，菌体用1／zMS液体培养基
悬浮，稀释到原体积的5～20倍，使菌液的Am。。一
1．0左右；取生长两周左右的莨菪无菌叶片，去掉其
主叶脉，将其剪成约0．8cm2的小叶盘；将叶盘放入
制备好的菌液中，浸泡10～15min，在无菌滤纸上
吸干菌液(无须进一步吸干)}经浸染的叶片放于不
含激素的MS固体培养基(可覆盖一层无菌滤纸)
上，28℃暗培养48h；叶片转到除菌培养基(B5+
Cef50(3mg／L)上，25～28℃光照下培养，7～15d
可以看到叶盘边缘伤口处有发根长出。待发根长到
2～3am时从叶盘边缘切下，不同部位长出的发根
独立编号，在相同培养基上继续培养，25～30d继
代1次。
1．4发根离体培养体系的建立和液体振荡扩大培
养：挑选平板上快速生长、除菌完全的发根建立发根
系。大约100mg鲜质量(15mg干质量)的新鲜发根
放入150mL灭菌三角瓶，加入40ml。1／2B5液体
培养基，置于摇床上25℃，i00r／rain振荡暗培养。
每2周继代1次。
1．5分别用A4、LBA9402和C58C1三种发根农杆
菌菌株转化莨菪子叶受体，并在共培养和除菌培养
基中添加100pmol／L的乙酰丁香酮和烟草浸出液，
统计不同转化事件的发根转化率，比较不同农杆菌
菌株及活化因子诱导莨菪子叶外植体发根情况。
1．6液培的第1、7、14、21、28、35d分别记录1次
鲜物质和干物质量，以平均质量为指标绘制生长曲
线。鲜物质量系用布氏漏斗抽滤至无水淌下时测定，
干物质量系60℃烘干后测得。绘制不同菌株转化系
的生长速率曲线，比较其形态上的差异。
1。7挑选生长旺盛的株系LBA9402进行以下实
验，分别考察不同外源激素、培养基、pH和不同碳
源对发根生长量的影响。1)配制MSo、1／285、N6、
White4种培养液培养发根，置于摇床上25℃，100
r／min振荡暗培养。每2周继代一次。28d后称质
量，测定不同培养液对发根生长的影响；2)以1／285
为基本培养基，分别添加1mg／I。的外源植物生长
激素NAA、IAA、IBA、2，4一D培养发根，方法同上，
测定不同激素对发根生长量的影响；3)配制pH值
分别为4．4、4．6、5．2、5．6四种1／2B5培养基培养
发根，方法同上，测定不同pH值对发根生长的影
响；4)在1／285液体培养基中附加质量浓度为30
g／L的蔗糖、果糖和葡萄糖，测定不同碳源对发根生
长量的影响。
1．8发根的鉴定：CTAB法提取总DNA为模板，
PCR鉴定rol基因：1)primersfor olB：5-GCT
CTTGCAGTGCTAGATT一37，5’一GAAGT
GCAGCTACTCTC一37。2)primersforolC：
5’一TAACATGGCTGAGACGACC3’，57一
AAACTTGCACTCGCCATGCC一3’。3)反应体
万方数据
·1866· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
系(25pL)：ddH2018pL，10×PCRbuffer2．5txL，
25mmol／LMgCl，2．0“l，，10mmol／LdNTPmix
0．25MI。，10mmol／Lprimer1 0．25rtL，10mmol／
Lprimer2 0．25“L，TaqDNApolymerase0．25
pL(1．25U)，Template基因组DNA1．5pL。4)
PCR程序：95℃5min，30个循环(94℃1min，53
℃1rain，72℃1．5rain)，72℃5rain。
1．9莨菪发根中生物碱类物质的测定：准确称取
60c干燥4h的干粉0．05g，置20mL具塞试管
中，加入乙醇一浓氨水一乙醚的混合液(5；4：10)数
滴，使粉末湿润，放置过夜后，再加入乙醚10mL，涡
旋振荡使粉末松动悬浮，置水浴(33～34℃)微沸，
提取3h，倾出上层液，用脱脂棉滤过，滤液置小烧
杯中，管中药渣再分别以10、10、5mL乙醚提取3
次，每次10min，滤过，滤液并人小烧杯中，将小烧
杯置水浴上蒸干，加入0．25mol／L硫酸1mL，洗涤
烧杯后倒人5mL容量瓶中，再用蒸馏水适量洗烧
杯数次，洗液并入容量瓶中，加入0．5mol／LNaOH
溶液o．9mI。，用蒸馏水定容至刻度，高速离心
(1000r／min)10min，取上清用HPLC测定生物
碱含量。标准品购自Sigma公司。
2结果与讨论
2．1不同发根农杆菌菌株转化莨菪及其影响转化
效率的因素
2．1．1发根农杆菌转化莨菪子叶外植体后诱导发
根及其生长情况：见图1。
A农杆菌A4感染10d后从莨菪子叶伤口处诱导出的发根B_在固体培养基(1／aB5和30mg／L蔗糖)上生长7d的第1代莨菪单克隆发
根系；c，D一在相同培养条件下分别生长了15和28d的继代单克隆发根系 E一1／eB5液体培养基大规模培养3周后的发根
A—hairyootinducedfromwoundsofcotyledonxplantofH．nigerwhichwasinfectedbyA4for10d B—firstgenerationofm oclonal
hairyootafterg owingoilsolidmedium(1／ZB5and30mg／Lsucrose)for7 d C，D—passagegen rationofm oclonalhairyrootafter
growingonsameconditionfor15and28d，respectivelyEalargescalehairyootcultureinliquidmedium(1／2B5)for3weeks
图1发根农杆菌藤染蓖菪子叶外植体后诱导的发根
Fig．1HairyootinducedfromwoundsofcotyledonxplantofH．nigerInfectedbyA．rhigogenes
2．1．2不同农杆菌菌株转化莨菪及活化因子对转 裹1不同农杆菌菌株及活化园子诱导的蓖菪
化效率的影响：用发根农杆菌LBA9402转化莨菪，
100％长出了发根，说明LBA9402菌株有很强的“致
病性”。用A4菌株诱导发根，只有不到80％的外植
体长出了发根。诱导发根具有明显的发根形态，固体
培养基上呈现明显的非向地性，生长迅速，2周内发
根质量增加了4倍，而对照的莨菪非转化根质量却
没有明显增加。说明Ri质粒中TDNA区的rol基
因已经转化进了发根并得到了表达。PCR鉴定转化
发根的结果见图2。本实验还考察了乙酰丁香酮和
烟草浸出液两种活化因子对农杆菌转化效率的影
响，从表1可以看出，乙酰丁香酮和烟草浸出液均可
显著提高农杆菌的转化率，其中以前者的效果更佳。
不同菌株诱导发根系液体扩大培养生长速率测定结
果见图3。
2．1．3菌液浓度对转化效率的影响：在农杆菌介导
的遗传转化中，适当的菌液浓度是转化成败的关键
问题之一。菌液浓度过低，会使农杆菌细胞数目不足
导致转化效率较低；菌液浓度过高，则由于营养不足
造成菌液中死菌数目过多，实际有感染能力的农杆
子叶外植体发根
Table1 HairyootofcotyledonxplantofHniger
inducedbyvariousA·rhizogenesstrains
andactivationfactors
’乙酰丁香酮一烟草授出掖
。acetosyringone。。extractionoftobac o
菌数目减少；此外，菌体产生的某些有害代谢产物对
植物细胞造成伤害，引起转化效率下降；农杆菌的浓
度太高，生长过盛就会造成外植体死亡；并且如果农
杆菌在共培养培养基上生长过旺，即使用500rag／
I一甚至l000mg／L的头孢菌素也不能将其杀死。
选用适当菌液浓度的原则是能够达到最大转化效率
的最小菌液浓度。因此在实验中，我们发现当菌液浓
度在A。。。值为1．o～1．6时，转化频率会维持在一
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 867·
柙憎 柙fC
MI’N广—bMPN厂—卜
tt删o／C8e6￡236蹦
M。DL一2000DNA分子质量标准(1oo～2000bp)
PpRiA4阳性对照N阴性对照
MDNAMarkerofDI，一2000(100～2000bp)
P—poslti妃controlofpRiA4N—negstivecontrol
圈2转化发根中rolB和rolC基因的PCR检测结果
Fig．2PCRdetectionofrolBandrolC
intransformedhairyoot
掣
咖
蚶
掣
型
担
7 14 2l
培养时间，d
图3不同菌株诱导发根系液体扩大培养生长曲线
Fig．3Growthcurvesofhairyootinliquidculture
inducedbyvariousA·rhizogenesstrains
个相对稳定的值，不会随着菌液浓度的提高而增加；
当菌液浓度过高时，转化频率反而会下降。
2．1．4共培养的时间对转化效率的影响：共培养的
时间以3天为好，此时转化效率达到最高值，进一步
增加共培养时间，转化效率会急剧下降。究其原因可
能是由于在共培养基上不含任何抗生素，植物细胞
和细菌细胞都可以生长。而细菌细胞生长较快，其生
长周期要比植物细胞的短。如果培养时间过长，过度
生长的细菌细胞就会抑制植物细胞的正常生长，甚
至会造成植物细胞的死亡。
2．1．5共培养的温度、pH对转化效率的影响：共
培养的温度在22℃时发根农杆菌的转化频率较高，
因为它具有2个优点：1．不容易发生质粒的丢失；
2．比较容易控制细菌的过度生长。缺点是植物细胞
的生长也同时会受到一定程度的抑制。出于上述考
虑，一般选择25℃。在农杆菌与植物细胞进行共培
养时，使用较低pH的培养基有利于转化频率的提
高。原因可能是在偏酸的培养条件下，有利于农杆菌
vir区基因的表达，但较低pH条件下，培养基的凝
固状态较差，不利于试验操作，容易污染。pH在
4．8～6．2的范围内，对转化效率的负面影响较小。
所以共培养时一般选择pH5．2的条件。
2．2不同激素、培养基、pH和不同碳源对发根生
长量的影响：本实验考察了不同激素、培养基、pH
和不同碳源对发根生长量的影响。从图4可以看出，
在经过28d的生长后，培养基以1／285和MS为
佳{激素以NAA为最佳，lmg／L的2，4一D反而有
抑制发根生长的作用{pH为5．2时最适宜发根生
长；蔗糖、果糖作为碳源具有相近的效果，而葡萄糖
稍差。
鍪“I．L
蚓tLLL
窭蚣1L蛩t．L．L．L
l；6rlLl LI-FWL2-DW
田4不同激素，培养基．pH和碳诼对发根生长量的影响
Fig．4Influenceofvar|ousa xin，mediumpHvalue，
andcarbonsourcesongrowthof airyoot
2．3莨菪发根中生物碱类物质的量的测定结果：见
表2。其中转化发根的莨菪碱、东莨菪碱的量均要高
于野生型的，这提示利用转化发根来大规模生产莨
菪药用活性成分具有潜在的可行性。
衰2蓖菪发根中生牺碱娄物质
Table2 Alkaloidsinhairyootof日．nor
3结论
随着对茛菪烷生物碱代谢途径了解的深人，基
因克隆和高效遗传转化系统的发展，利用遗传代谢
工程手段在植物细胞工厂大量生产有用的次生代谢
物成为研究的热点，主要目的是将莨菪碱转变为更
有价值的东莨菪碱。将催化速率限制步骤的关键酶
基因转入植物宿主中超量表达可以提高目标产物的
含量。莨菪类生物碱的基本代谢途径已经研究得较
为清楚，合成过程中第一个关键酶PMT
(putrescineN—methyltransferase)1，4-丁二胺一Ⅳ一
甲基转移酶催化腐胺变成Ⅳ一甲基腐胺；最后一个关
键酶H6H(hyoscyamine6hydroxylase)莨菪碱6一
羟化酶两步催化莨菪碱变成东莨菪碱““。
Hashimoto等o”已经从莨菪日．niger的根的
cDNA文库中克隆到h6h基因。Jouhikainen等在
H．muticus发根中转入h6h东茛菪碱的量比对照
提高了100倍，莨菪碱的量与对照相近o“。笔者尝
万方数据
·1868· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期8005年12月
试将PMT和H6H构建到双价载体上，通过发根农
杆菌转化莨菪，增加发根提高酶的表达活力，使东莨
菪碱量最高的转化发根系比野生型(43mg)提高了
9倍，据了解这是目前利用遗传代谢工程在莨菪中
获得的最大东莨菪碱的量““。
本实验利用发根农杆菌Ri质粒首次成功地从
莨菪H．nigerL．中诱导出毛状根。筛选出了各自
的生长快速的优质株系，建立了发根培养体系，为进
一步利用遗传代谢工程手段调节莨菪次生代谢物的
量和进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。
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甘草药材HPLC指纹图谱研究
吴昭晖1，罗佳波1，游文玮2
(1．南方医科大学中药新药研究重点实验室，广东广州510515；2．南方医科大学化学系，广东广州510515)
摘 要：目的建立甘草药材的HPLC指纹图谱。方法采用反相高效液相色谱法，选用ZorbaxSB—Cla柱(250
mm×4．6mm，5pm)色谱柱；流动相为乙腈一1．2％醋酸溶液(梯度洗脱)；分析时间70rain{检测波长为254nm。结
果建立了甘草药材的HPLC指纹图谱，标定了甘草药材38个共有指纹峰，方法学考察结果符合指纹图谱技术要
求。结论方法稳定、可靠、重复性好，可为甘草药材质控标准的制定和含甘草的中药方剂的物质基础研究提供
参考。
美键词：甘草；指纹图谱}HPLC
中图分类号：R282．02 文献标识码：A 文章编号：02532670(2005)121868—05
FingerprintsofRadixGlycyrrhizaebyHPLC
WUZhao—huil。LU0Jim_b01，YOUWen—wet2
(1．KevLaboratoryofTraditionalChineseMedicineandNewDrugofSouthernMedicalUniversity，Guangzhou
510515．China}2．DepartmentofChemistryofSou hernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China)
Abstract．ObjectiveToestablishtheHPLCfingerprintsofRadixGlycyrrhizae．MethodsThRP—
HPLCmethodwasused，ZorbaxSBClecolumn(250mm×4．6mm，5pm)wagemployed；the
收稿日期：2005—02—1
荐妻磊界!霎蠢扉嚣黧差考鲁妻霜耋譬嚣届需贸：：j嚣)年厦门大学化学系毕业，现为南方医科大学分析测试中心高级工程师，研究方向
为现代仪器分析。Tel：(020)61648172Email；youww@fimmu．corn
万方数据
莨菪发根培养体系的建立
作者： 陆倍倍， 张磊， 开国银， 张汉明， 丁如贤， 陈万生， LU Bei-bei， ZHANG Lei，
KAI Guo-yin， ZHANG Han-ming， DING Ru-xian， CHEN Wan-sheng
作者单位： 陆倍倍,张磊,张汉明,丁如贤,LU Bei-bei,ZHANG Lei,ZHANG Han-ming,DING Ru-xian(第二
军医大学药学院,生药教研室,上海,200433)， 开国银,KAI Guo-yin(上海交通大学植物生物
技术研究中心,农业与生物学院复旦-交大-诺丁汉植物生物技术研发中心,生命科学技术学院
,上海,200030)， 陈万生,CHEN Wan-sheng(第二军医大学长征医院,上海,200003)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 5次

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