全 文 ：△2Fus 诱导子　○2对照品　□2A sp 诱导子
△2Fus elicito r　○2reference substance　□2A sp elicito r
图 5　真菌诱导子对长春质碱含量的影响
F ig. 5　Effect of fungal el ic itors on catharan th ine con ten t
对吲哚总碱及其中阿玛碱、长春质碱的积累均有不
同程度的正向调节作用, 并且不同的真菌诱导子对
不同的吲哚生物碱的最佳处理时间不同。Fu s 诱导
子对长春质碱的诱导效果最好, 最佳处理时间 16
h, 可使其含量比对照增加近 3 倍。有关 Fu s 诱导子
提高长春花愈伤组织中长春质碱含量的研究, 国外
已有报道[6 ] , 但国内尚未见到相关报道。长春质碱不
仅本身具有治疗糖尿病及抗菌、止血的功效, 而且还
是抗癌药物长春碱、长春新碱的合成前体, 因此, 长春
质碱的增产研究具有很高的应用价值。
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盐生肉苁蓉愈伤组织培养与苯乙醇苷类化合物合成的研究
郭志刚, 于金梅, 刘瑞芝, 巨　勇3 , 肖　强Ξ
(清华大学 化工系, 北京　100084)
摘　要: 目的　利用肉苁蓉组织培养技术生产苯乙醇苷类活性成分。方法　研究碳源、生长素和培养条件对细胞中
松果菊苷、洋丁香酚苷 (类叶升麻苷)和 2′2乙酰基洋丁香酚苷 3 种苯乙醇苷类化合物合成的影响。结果　葡萄糖有
利于上述 3 种成分的合成, 62BA 1 m göL 与 IAA 1 m göL 或 62BA 1 m göL 与 2, 42D 2 m göL 的激素配比有利于松
果菊苷和洋丁香酚苷 (类叶升麻苷)的积累。15 ℃ 黑暗和 25 ℃ 光照处理可以促进松果菊苷和洋丁香酚苷 (类叶升
麻苷)的积累。其中 IAA 2 m göL 与 62BA 1 m göL、25 ℃ 黑暗条件下培养时 3 种苯乙醇苷类的总产量达到 1 93717
m göL。盐生肉苁蓉愈伤组织中的主要成分与天然肉苁蓉基本相同, 而且愈伤组织中的松果菊苷、洋丁香酚苷 (类叶
升麻苷)和 2′2乙酰基洋丁香酚苷含量高于天然肉苁蓉。结论　盐生肉苁蓉的愈伤组织或细胞可以代替肉苁蓉生产
苯乙醇苷类活性成分。
关键词: 盐生肉苁蓉; 愈伤组织培养; 苯乙醇苷
中图分类号: R 282113　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 02 0204 04
Stud ies on culture of C is tanche sa lsa ca llus and syn thesis of phenylethano id glycosides
GUO Zh i2gang, YU J in2m ei, L IU R u i2zh i, JU Yong, X IAO Q iang
(D epartm ent of Chem ical Engineering, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina)
Key words: C istanche sa la (C. A. M ey. ) Ben th. et Hook. f. ; ca llu s cu ltu re; phenylethano id glyco sides
　　肉苁蓉是一味传统中草药, 具有补肾、益精、强 筋健髓之功效, 主治下部虚损、老年血液枯槁, 也常
·402· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
Ξ 收稿日期: 2003206220
作者简介: 郭志刚 (1958—) , 男, 内蒙古赤峰市人, 1993 年获日本爱媛大学生物资源生产学博士学位, 现任清华大学化工系副教授, 从事
药用植物细胞工程教学和研究工作。先后在国内外学术杂志和学会上发表论文 50 余篇, 出版书籍 4 册近百万字。获得国家发
明专利 2 项, 公开专利 1 项, 正在申请发明专利 2 项。T el: (010) 62785603　E2m ail: guozh ig@ tsinghua. edu. cn3 本校化学系
被作为增强体质的保健品[1 ]。近年来分离肉苁蓉活
性成分的研究十分活跃, 到目前为止已经分离到数
10 种化学成分[2～ 6 ]。其中松果菊苷和洋丁香酚苷
(类叶升麻苷)对抗衰老和增强记忆功能具有显著疗
效[7, 8 ]。由于其具有特殊的保健作用, 在保健品市场
上被广泛应用。但随之而来的是野生肉苁蓉资源遭
到严重破坏。为了保护野生肉苁蓉资源, 必须尽快找
到其代用资源。
人工栽培肉苁蓉虽然可以获得野生肉苁蓉的替
代产品, 但是由于其生产周期较长, 容易受自然环境
的限制。利用植物细胞培养技术生产肉苁蓉的有效
成分也是一种有效方法。植物细胞培养技术可以将
肉苁蓉的自然生产转变为工业化生产, 并且可以通
过代谢调控等手段大幅度提高其特定有效成分的含
量。本研究以盐生肉苁蓉 C istanche sa lsa (C. A.
M ey. ) Ben th. et Hook. f. 作为实验材料, 重点探讨
细胞培养与苯乙醇苷类化合物合成的关系。
1　材料
　　盐生肉苁蓉 C. sa lsa (C. A. M ey. ) Ben th. et
Hook. f. 植株采自宁夏盐池县, 利用其茎韧皮部组
织作为外殖体, 经过杀菌消毒后接种在改良的M S
培养基上, 经过近一个月的脱分化培养诱导出愈伤
组织。经过 5 个世代的驯化筛选培养, 获得 CS2001
株系并以此为实验材料用于优化碳源、筛选生长素
种类以及优化培养条件等研究。
2　方法
211　碳源实验: 在改良的M S 培养基中添加吲哚
乙酸 ( IAA ) 2 m göL , 62卞氨基嘌呤 (62BA ) 1 m gö
L , Gellan gum 2 göL。碳源有葡萄糖和蔗糖两种, 其
添加浓度分别为 20, 30 和 40 göL , 每个处理为 150
mL 培养基, 分装在 5 个 100 mL 的锥形瓶中, 即重
复 5 次。选择浅黄色盐生肉苁蓉愈伤组织接种, 接
种量为 (1105±011) gö瓶。25 ℃ 暗培养 30 d, 收获
称鲜重和干重, 并测其苯乙醇苷的含量。
212　生长素实验: 以改良的M iller 培养基为基本
培养基, 在添加 62BA 1 m göL 的基础上, 分别添加
吲哚乙酸 ( IAA ) 1, 2 m göL ; 2, 42二氯苯氧乙酸 (2,
42D ) 1, 2 m göL ; 对照实验添加了 2 m göL 的NAA。
然后再加入 30 göL 的蔗糖和 6 göL 的琼脂做成平
板培养基。每个处理接种 5 瓶, 每瓶接种 6 块愈伤
组织, 愈伤组织鲜重 (140±40) m gö块 (干重 1216
m gö块)。然后在 25 ℃ 黑暗条件下培养 25 d 收获,
测定生物量及苯乙醇苷的积累情况。
213　环境优化: 为了优化适宜的培养温度我们设计
了在黑暗条件下 15 ℃, 20 ℃ 和 25 ℃ 3 个处理, 同
时设计了 25 ℃ 黑暗和光照两个处理。基本培养基为
改良M iller 培养基, 添加 IAA 2 m göL , 62BA 1 m gö
L , 蔗糖 30 göL , 琼脂 6 göL 后做成固体培养基。每瓶
接种 6 块愈伤组织, 每块愈伤组织鲜重 (120±20)
m g (干重 1115 m g) , 每个处理重复 3 次。培养 25 d
后收获, 测定生物量及苯乙醇苷的积累情况。
214　分析方法: 苯乙醇苷类化合物的标准样品为本
实验室分离纯化并通过质谱 (B ruker E squ ire2L C)
和核磁共振 (B ruker AM 400 M H z) 鉴定的松果菊
苷、洋丁香酚苷和 2′2乙酰基洋丁香酚苷。将实验样
品经真空冷冻干燥、研磨, 称取 015 g, 以甲醇 10
mL 浸泡 24 h 后再移至超声条件下萃取 20 m in。溶
液以微孔滤膜 (0145 Λm ) 滤过。采用岛津 SPD—
10A vp 型高效液相色谱 (H PL C) 分析系统, 检测波
长 335 nm , 色谱柱为 C18柱 (250 mm ×4. 6 mm , 5Λm ) , 进样量均为 2 ΛL , 流动相为甲醇2水 (水相含
115% 乙酸) , 流速: 018 mL öm in; 洗脱梯度: 8% 2 m in
34%
30 m in
60%
10 m in
8%。
3　结果
311　碳源的影响: 结果表明, 葡萄糖比蔗糖更有利
于 3 种苯乙醇苷类化合物的合成, 其中 40 göL 葡
萄糖处理的松果菊苷含量是同浓度蔗糖处理的
140% 左右 (图 1, 2)。从 3 种苯乙醇苷类成分的含
量来看, 松果菊苷的含量最高, 洋丁香酚苷次之, 2′2
乙酰基洋丁香酚苷的含量较低。从糖的浓度处理来
看, 各处理之间的每种苯乙醇苷类化合物的含量没
有显著性差异。
12松果菊苷　22洋丁香酚苷　322′2乙酰基洋丁香酚苷
12ech inaco side　22acteo side　322′2acetylacteo side
图 1　葡萄糖对于苯乙醇苷化合物合成的影响
F ig. 1　Effect of glucose on syn thesis
of phenylethano id glycosides
·502·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
12松果菊苷　22洋丁香酚苷　322′2乙酰基洋丁香酚苷
12ech inaco side　22acteo side　322′2acetylacteo side
图 2　蔗糖对苯乙醇苷化合物合成的影响
F ig. 2　Effect of sucrose on syn thesis
of phenylethano id glycosides
　　结合生物量的积累计算其产量 (干细胞产量
göL ×苯乙醇苷含量m gög) 时会发现, 虽然葡萄糖
有利于松果菊苷和洋丁香酚苷的合成, 但是不利于
细胞增殖, 这样其产量反而低于蔗糖处理。从表 1 可
以看到, 40 m göL 蔗糖处理细胞中的 3 种苯乙醇苷
的产量均高于葡萄糖处理。
312　生长素的影响: 结果见图 3。IAA 和 2, 42D 可
以促进松果菊苷和洋丁香酚苷的合成, 其中 1 m gö
L 的 IAA 和 2 m göL 的 2, 42D 的促进效果较好。
NAA 与 2, 42D 的效果基本相同。此外, 3 种生长素
对 2′2乙酰基洋丁香酚苷的合成没有显著影响。如果
加上生长素对生物量积累的影响进行综合考察,
IAA 可以显著提高松果菊苷和洋丁香酚苷的产量
( 表1)。2, 42D 虽然也可以促进松果菊苷和洋丁香
12松果菊苷　22洋丁香酚苷　322′2乙酰基洋丁香酚苷
12ech inaco side　22acteo side　322′2acetylacteo side
图 3　生长素对苯乙醇苷类化合物合成的影响
F ig. 3　Effect of aux in on syn thesis
of phenylethano id glycosides
酚苷的合成, 但是由于其不利于生物量积累, 所以其
3 种苯乙醇苷类成分的总产量与NAA 处理基本相
同 (表 1)。
313　环境影响: 图 4 温度和光照对苯乙醇苷类物质
合成的影响。在黑暗条件下, 15 ℃ 低温有利于松果
菊苷和洋丁香酚苷的合成, 20 ℃ 和 25 ℃ 的结果基
本相同。温度变化对 2′2乙酰基洋丁香酚苷的合成几
乎没有影响。此外, 光照有利于松果菊苷的合成, 但
是对洋丁香酚苷的合成稍有抑制。虽然在黑暗条件
下 15 ℃ 低温均有利于 3 种苯乙醇苷类化合物的合
成 (图 4) , 但是由于 15 ℃ 低温不利于生物量积累,
所以从 3 种化合物的产量来看, 却随着培养温度的
12松果菊苷　22洋丁香酚苷　322′2乙酰基洋丁香酚苷
12ech inaco side　22acteo side　322′2acetylacteo side
图 4　温度和光照对苯乙醇苷类化合物合成的影响
F ig. 4　Effect of temperature and illum ination
on syn thesis of phenylethano id glycosides
表 1　各种处理对松果菊苷、洋丁香酚苷和
2′-乙酰基洋丁香酚苷产量的影响
Table 1　Effect on y ield of ech inacoside, acetylacteoside,
and 2’-acetylacteoside for d ifferen t treatmen t
实验处理
松果菊苷ö(m g·L - 1) 洋丁香酚苷ö(m g·L - 1) 2′2乙酰基洋丁香酚苷ö(m g·L - 1) 产量ö(m g·L - 1)
蔗糖 20 göL 41217 18213 　　2718 62218
蔗糖 30 göL 37713 15914 2714 56411
蔗糖 40 göL 53310 22217 3414 79011
葡萄糖 20 göL 34212 17214 2819 54315
葡萄糖 30 göL 34614 15917 2919 53610
葡萄糖 40 göL 36812 16219 3410 56511
IAA 1 m göL 65512 37512 5811 1 08815
IAA 2 m göL 63417 36616 7816 10719
2, 42D 1 m göL 47011 25715 6619 79415
2, 42D 2 m göL 55010 28014 6619 89713
NAA 2 m göL 49014 26017 6611 81712
15 ℃ö黑暗 85910 47117 7117 1 40214
20 ℃ö黑暗 94012 49818 7312 1 51212
25 ℃ö黑暗 1 17618 65614 10415 1 93717
25 ℃ö光照 1 05112 53419 6919 1 65610
·602· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
升高而增加。其中 25 ℃ 暗培养的 3 种化合物总产
量达到了 119 göL。同样光照也可以促进松果菊苷
和洋丁香酚苷的合成, 但是由于光照不利于愈伤组
织增殖, 所以 25 ℃ 光照培养的 3 种苯乙醇苷类化
合物的产量却低于 25 ℃ 黑暗培养 (表 1)。
　　根据以上试验结果得知, 盐生肉苁蓉愈伤组织
的生长条件与其苯乙醇苷类化合物的合成条件有所
不同, 因此为了提高苯乙醇苷类活性成分的产量, 必
须采取两步培养法, 即首先给以蔗糖、IAA、25 ℃ 黑
暗培养促进生物量的积累, 再改变培养条件以葡萄
糖、IAA、15 ℃、光照培养促进苯乙醇苷类化合物的
合成。
此外, 我们还把在药店购买的生苁蓉、熟苁蓉、
野外采摘的天然盐生肉苁蓉和盐生肉苁蓉细胞以及
荒漠肉苁蓉细胞的 3 种苯乙醇苷类化合物的含量
进行了分析比较 (表 2) , 其中荒漠肉苁蓉的培养细
胞的松果菊苷含量达到 15119 m gög, 是熟苁蓉或生
苁蓉的 40～ 70 倍, 3 种化合物的总量为 15817 m gö
g, 是药店销售苁蓉的 20～ 50 倍。而盐生肉苁蓉培
养细胞的松果菊苷含量是药店销售的 25～ 50 倍,
洋丁香酚苷含量是药店的 25～ 40 倍, 2′2乙酰基洋
丁香酚苷的含量是药店的 6～ 13 倍, 总产量是药店
的 25～ 60 倍。与冷冻干燥处理的新鲜盐生肉苁蓉相
比, 培养细胞的松果菊苷、洋丁香酚苷和 2′2乙酰基洋
丁香酚苷含量也远远高于冷冻干燥处理。结果表明培
养细胞的苯乙醇苷类成分含量较高, 不良的干燥处理
方法会造成苯乙醇苷类化合物的严重衰变。
表 2　药用苁蓉与肉苁蓉细胞的苯乙醇苷类
物质含量比较 mg·g- 1
Table 2　Compar ison of con ten t in phenylethano id gly-
cosides of C. sa lsa and C. sa lsa cell　mg·g- 1
样品 松果菊苷含量
洋丁香
酚苷含量
2′2乙酰基洋丁
香酚苷含量
合计
生苁蓉 　 　1191 　　0194 　　01097 　　21947
熟苁蓉 3164 1139 2105 7108
天然盐生肉苁蓉 49183 40144 11199 102126
盐生肉苁蓉细胞 105160 60199 13107 179166
荒漠肉苁蓉细胞 151189 5105 1178 158172
　　图 52A ,B 分别是天然盐生肉苁蓉与盐生肉苁蓉
细胞的苯乙醇苷类物质 H PL C 分析图谱, 可以看到
其主要成分的出峰时间和顺序基本相同。表明采取肉
苁蓉细胞培养法可以生产苯乙醇苷类活性物质。
A 2天然盐生肉苁蓉　B2盐生肉苁蓉培养细胞
A 2C. sa lsa　B2cell in C. sa lsa
图 5　HPLC 图谱
F ig. 5　HPLC chromatogram
4　讨论
　　以上实验结果表明, 添加葡萄糖比蔗糖更有利
于苯乙醇苷类化合物的合成, 添加 2, 42D 可以促进
松果菊苷和洋丁香酚苷的合成, 15 ℃ 黑暗和 25 ℃
光照处理可以促进松果菊苷和洋丁香酚苷的合成。
盐生肉苁蓉愈伤组织中的主要成分与肉苁蓉药材基
本相同, 只是盐生肉苁蓉愈伤组织中的松果菊苷、洋
丁香酚苷和 2′2乙酰基洋丁香酚苷的含量远远高于
药用肉苁蓉。因此采用盐生肉苁蓉的愈伤组织或细
胞大规模培养技术可以生产出肉苁蓉的有效成分。
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保 护 环 境 　 保 护 植 被
·702·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月