全 文 ：石形成 ,同时泽泻水提液组对草酸及钙的代谢没有
影响 ,其抑制结石的形成 ,可能是通过抑制草酸钙结
晶的生长和聚集 ,减少肾小管内草酸钙晶体的形成
和沉积从而抑制实验性大鼠尿草酸钙结石的形成。
本实验采用 1% 乙二醇和 2% 氯化铵水溶液 ig诱
导大鼠肾草酸钙结石形成。实验表明 B组大鼠的血
清 BUNM , Cr含量 , 24 h尿 Ox , Ca2+ 分泌量和肾
Ca
2+含量显著高于 A组 ,这与肾组织病理切片观察
到的结果是一致的。而泽泻的乙酸乙酯浸膏高、低剂
量组体内均能明显降低实验性草酸钙结石大鼠 24
h尿 Ca2+ 分泌量和减轻肾小管损伤的程度 ,而且泽
泻的乙酸乙酯浸膏高剂量组也显著降低大鼠肾组织
Ca
2+的含量 ,因此能抑制体内尿草酸钙结石的形成。
但泽泻正丁醇浸膏和水浸膏对体内草酸钙结石的形
成影响较小。同时本研究显示 ,泽泻的各实验组体内
均不能降低尿 Ox的排泄 ,这与以往的研究结果是
一致的 ,进一步证实泽泻的乙酸乙酯浸膏主要是通
过阻止草酸钙结晶生长和聚集作用而抑制结石形
成 ,是泽泻抑制尿草酸钙结石形成的有效活性部位。
川村等 [6 ]对泽泻具有体外抑制草酸钙结晶生长
和聚集的有效成分进行了研究 ,发现主要是相对分
子质量 > 1× 104的物质 ,并不含葡胺聚糖类物质。
Honda等 [ 7]发现 ,泽泻煮沸提取的成分中相对分子质
量小于 1× 105及 5× 104～ 3× 105的成分有抑制草酸
钙结晶生长的作用 ,因此 ,有必要对泽泻抑制草酸钙
结晶生长和聚集的有效活性成分作进一步的研究。
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苦参碱诱导 K562细胞酪氨酸激酶与磷酸酶的活性改变
刘北忠 1 ,蒋纪恺 1 ,何於娟 1 ,张　彦 1 ,刘小珊 2
( 1. 重庆医科大学 临床生化教研室 ,重庆　 400016; 2. 重庆医科大学临床学院 血液科 ,重庆　 400016)
摘　要: 目的　研究苦参碱诱导 K562细胞分化的信号转导机制。 方法　运用链亲和素 -生物素放大系统结合的酶
联免疫法 ,动态检测苦参碱作用于 K562细胞后 , K562细胞膜相与胞浆内的酪氨酸激酶与磷酸酶的变化。结果　结
合特异性激酶抑制剂的使用 ,首次证实了在苦参碱对 K562细胞的诱导分化过程中 ,有广泛性的蛋白酪氨酸激酶活
性的短暂下降 ,同时伴有蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化。结论　在苦参碱诱导 K562细胞分化的信号转导过程中 ,
涉及到蛋白酪氨酸激酶的活性改变 ,膜相中蛋白酪氨酸激酶的活性改变先于胞浆内的改变 ,提示有一个信号的跨
膜转运过程。 同时伴有蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化 ,反映了胞内的蛋白酪氨酸残基磷酸化与去磷酸化的即时调
节机制。
关键词: 苦参碱 ; K562细胞 ;细胞分化 ;信号转导 ;酪氨酸激酶 ;酪氨酸磷酸酶
中图分类号: R735. 7　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0048 04
Change of tyrosine kinase and phosphatase activity in K562 cells induced by matrine
LIU Bei-zhong
1
, JIAN G Ji-kai
1
, HE Yu-juan
1
, ZHANG Yan
1
, LIU Xiao-shan
2
·48· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
收稿日期: 2002-06-05基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39670881, 30171150)作者简介:刘北忠 ( 1970— ) ,男 ,重庆人 ,博士 ,重庆医科大学临床生化教研室副主任 ,主要从事中药抗肿瘤的分子机制研究。
Tel: ( 023) 68894666　 E-mail: lb z2753@ hotmail. com
( 1. Depa rtment o f Clinical Biochemist ry , Chongqing Univ er sity o f Medical Sciences, Chongqing
400016, China; 2. Depa rtment o f Hema tolog y , Colleg e of Clinical Medicine,
Chongqing Univ er sity o f Medical Sciences, Chongqing 400016, China)
Abstract: Object　 To study the mechanism o f signal t ransduction in K562 cell dif ferentiation induced
by matrine. Methods　 The method of ELISA coupled w ith streptav iding-biotin system w as used to detect
the activi ty of pro tein ty rosine kinase and pho spha tase respectiv ely in cy toplasm and membrane of K562
cells t reated by matrine a t di fferent time. Results　 Using specific kinase inhibito r, i t wa s demonst rated in
the fi rst time that the activi ty o f pro tein tyro sine kinase decreased transiently accompanying the change of
pro tein tyrosine phosphatase activity. Conclusion　 The change o f protein ty rosine kinase activi ty w as in-
vo lv ed in the course of K562 cell di fferentia tion induced by matrine. The ty rosine kinase activ ity in cell
membrane decreases mo re rapidly than that in cell cy toplasm , suggesting that there be a signal transmem-
brane t ranspo rt pro cess. The change of ty ro sine phosphatase activi ty following the kinase reflects the real
time regula tion o f phosphory lation and depho spho rylation.
Key words: matrine; K562 cel l; cell di fferentia tion; signal t ransduction; ty rosine kinase; ty rosine
phospha tase
　　传统的肿瘤疗法对人体细胞进行非选择性杀
伤 ,有较大的毒副作用。无创伤性的生物学疗法具有
广阔的应用前景。苦参碱是苦参的主要生物碱 ,一定
浓度的苦参碱能诱导红白血病细胞株 K562细胞向
红细胞系分化 [1 ]。为探讨其诱导分化的机制 ,本研究
从蛋白的磷酸化与去磷酸化的调节入手 ,动态检测
了与细胞的增殖和分化密切相关的膜相与胞浆内的
蛋白酪氨酸激酶活性 ,同时检测了相应的蛋白酪氨
酸磷酸酶的活性变化。
1　材料与方法
1. 1　主要仪器: CO2培养箱 ( Sheldon Manufactur-
ing , Inc. , U SA) ,低温高速离心机 ( Hi tachi Himac
CF15, Japan) ,酶标仪 ( BIO-RAD Model 3550-UV
M ICRO PLAT E READER, USA)。
1. 2　主要试剂:苦参碱标准品 (纯度> 99. 9% ,日本
大正制药惠赠 ) ,细胞培养基 RPM I 1640 ( GIBCO,
U SA) ,蛋白酶抑制剂 PM SF, apro tinin, leupeptin
(均购自 Sigma Inc. , USA) , Ty rosine Kinase As-
say Ki t( BOEHRINGER MANNHEIM , Germany) ,
Ty ro sine Phospha tase Assay Ki t ( BOEHRIN GER
MANNHEIM , Germany)。
1. 3　样品准备 [ 1～ 3]
1. 3. 1　细胞培养: 取对数生长期的 K562细胞 ,用
RPM I1640细胞培养液 (含 10% 新生小牛血清 )调
整细胞浓度为 1× 107 /m L,加入苦参碱标准储备
液 ,使终浓度为 100μg /mL。 然后置 CO2培养箱
37℃ , 5% CO2培养 ,在不同时间准确收集细胞。
1. 3. 2　总蛋白提取:细胞经 PBS洗涤后 ,用冰预冷
的含 100μg /mL PM SF, 1μg /mL Apro tinin和 2
μg /mL Leuppetin的 RIPA三去污剂裂解缓冲液裂
解细胞 ,然后经冰预冷的微型匀浆器匀浆后 , 4℃ ,
1 000 g离心 10 min,收集上清液作为总蛋白提取
物。 用于蛋白酪氨酸激酶的活性测定时 ,尚须加入
100μg /mL钒酸钠 ,以抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的活
性 (以下同 )。
1. 3. 3　胞浆蛋白提取:细胞经 PBS洗涤后 ,用冰预
冷的低渗裂解液 (见试剂盒说明书 ) 裂解细胞 ,后
同总蛋白的提取 ,收集上清液作为胞浆蛋白提取物。
1. 3. 4　膜相蛋白提取: 收集低渗裂解液裂解细胞
后 ,经离心得到的沉淀 ,再以 RIPA三去污剂裂解
缓冲液作用 30 min,经匀浆离心后 ,收集上清液作
为膜相蛋白提取物。
1. 4　活性测定 [2, 4 ]
1. 4. 1　蛋白酪氨酸激酶的活性测定:经样品处理过
程提取的各种蛋白质提取物 (含蛋白酪氨酸激酶 ) ,
分别与生物素标记的含酪氨酸残基的激酶底物
( Bio tin-EGPW LEEEEEAYGWMDF-NH2 ) 作 用
后 ,使部分底物的酪氨酸残基磷酸化 ;借助于标记的
生物素 ,底物与链亲和素包被的酶标板微孔结合 ;洗
去未结合的底物后 ,加入过氧化物酶标记的高度特
异性的抗磷酸化酪氨酸残基的抗体 ,与磷酸化的酪
氨酸残基结合 ;洗去未结合的抗体 ,最后加入过氧化
物酶的催化底物 ABTS进行比色。 测定波长 405
nm,参考波长 490 nm。通过蛋白酪氨酸激酶活性—
吸光度 ( A405 - A490 )的标准曲线进行定量。其中 ,蛋
白酪氨酸激酶活性以酪氨酸磷酸化肽的生成量
表示。
1. 4. 2　蛋白酪氨酸磷酸酶的活性测定:测定原理与
蛋白酪氨酸激酶的活性测定相似 ,只是改用相应的
酪 氨酸 残 基 已磷 酸 化的 底 物 ( Bio tin-EGP-
·49·中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
WLEEEEEAY～ PO4GWMDF-NH2 )。 蛋白酪氨酸
磷酸酶的活性的定量则是以阴性对照的吸光度
( A405 - A490 ) 为 100% ,通过公式: ( A对照 - A测定 ) /
A对照× 100% 来计算其相对活性 PTPase (% )。
2　结果
2. 1　不同浓度的苦参碱作用 K562细胞 5 min后 ,
总的蛋白酪氨酸激酶活性 (以磷酸化肽的生成量 PP
表示 )变化 ,见图 1。
浓度 C / ( mg· mL- 1 )
图 1　苦参碱浓度-磷酸化肽曲线
Fig. 1　 Curve of matrine concentration-phosphopeptide
2. 2　苦参碱 ( 0. 1 mg /mL)作用于 K562细胞后的
蛋白酪氨酸激酶活性变化: 见图 2。
时间 t / min
1-总蛋白提取物　 2-膜相蛋白提取物　 3-胞浆蛋白提取物
1-total protein ex t ract　 2-cel l mem bran e protein ex t ract
3-cel l cytoplasm protein ext ract
图 2　磷酸化肽-时间曲线
Fig. 2　 Curve of phosphopeptide-time
2. 3　不同浓度的苦参碱作用于 K562细胞后 ,总的
蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化: 见图 3。
2. 4　苦参碱作用于 K562细胞后蛋白酪氨酸磷酸
酶活性的变化:见图 4。
3　讨论
　　 K562细胞的诱导增殖与分化 ,涉及到多条信
号转导途径。其中 ,蛋白酪氨酸激酶受体途径与蛋白
酪氨酸激酶偶联受体途径是重要的信号转导通
路 [5 ]。 由于信号的传递是一个多分子参与的、迅速
的、级联放大的过程 ,并且具有非线性的特点。 而一
般的研究是以 RT-PCR技术扩增信号分子的 m R-
NA,通过定性或定量分析来反映信号分子的表达情
对数浓度 logC / ( mg· mL- 1)
图 3　苦参碱浓度的自然对数值-蛋白酪
氨酸磷酸酶活性曲线
Fig. 3　 Curve of log ( matrine concentration)-
activity of PTPase (% )
时间 t / min
图 4　蛋白酪氨酸磷酸酶活性-时间曲线
Fig. 4　 Curve of activity of PTPase (% )-time
况。 但 mRNA的量并不能完全代表信号蛋白的表
达量 ,更不能反映其活性的大小 ,很难满足信号转导
研究的需要。因此为深入研究苦参碱对 K562细胞
的诱导分化机制 ,本实验选择蛋白酪氨酸激酶的活
性作为研究对象 ,通过多时间点检测 ,反映其动态变
化 ;同时检测蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化 ,反映其
体内的调节。实验结果 (图 1)表明 ,不同浓度的苦
参碱对蛋白酪氨酸激酶的活性均有抑制作用 ,而且
在 0. 1 mg /mL的浓度范围内 ,抑制作用具有浓度
依赖性 , 0. 1 mg /m L 苦参碱的抑制率最大 ,达
26. 8%。 如图 2所示 , K562细胞经 0. 1 mg /mL苦
参碱处理后 ,总蛋白提取物中的蛋白酪氨酸激酶活
性有一个短暂的下降 ,在 1～ 5 min时的下降幅度最
大 ,达 56% 以上。随后激酶活性反弹 ,恢复正常。胞
浆蛋白提取物中的蛋白酪氨酸激酶活性则同样有一
个短暂的下降 ,在 5 min时的下降幅度达 30%。 膜
相蛋白提取物中的蛋白酪氨酸激酶活性亦有短暂的
下降 ,并于 1 min时降至正常时的 31%。 从激酶活
性下降的时相看 ,膜相蛋白提取物中的蛋白酪氨酸
激酶活性变化先于胞浆蛋白提取物中的蛋白酪氨酸
激酶活性的变化。提示有一个信号从外入内的跨膜
·50· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
传递过程。
为探讨蛋白酪氨酸激酶活性的胞内调节 ,我们
检测了不同浓度的苦参碱作用于 K562细胞后 ,总
的蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化。实验结果 (图 3)
表明 ,在 0. 001～ 1. 0 mg /mL浓度内 ,苦参碱对蛋
白酪氨酸磷酸酶活性的影响没有显著性差异。同时 ,
蛋白酪氨酸磷酸酶的活性有一个显著的先降后升 ,
然后逐渐恢复的过程 ,正好紧随蛋白酪氨酸激酶活
性的变化时相 ,提示为一个反应性的调节性增高。进
一步用蛋白酪氨酸激酶活性抑制剂预处理 K562细
胞后 ,蛋白酪氨酸磷酸酶的活性不受苦参碱的影响 ;
而经蛋白酪氨酸磷酸酶活性的抑制剂预处理后 ,蛋
白酪氨酸激酶的活性仍受到苦参碱的抑制。表明苦
参碱作用 K562细胞后 ,可引起广泛性的蛋白酪氨
酸激酶的活性变化 ,同时伴随有蛋白酪氨酸磷酸酶
活性的相应改变。
在苦参碱诱导 K562细胞的增殖抑制与红系分
化过程中 ,除上述改变外 ,尚有 G蛋白偶联受体信
号通路、磷脂酶 A2及钙信号等的变化 (有关内容将
另文发表 ) ;许相儒等的研究还发现 K562细胞膜上
有与苦参碱特异性结合的蛋白 [6 ];与诱导分化有关
的立早基因也正在积极研究之中。 随着对苦参碱等
诱导分化剂抗肿瘤机制的研究深入 ,无创伤性的生
物学疗法将逐渐走入临床 ,造福人类。
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聪圣胶囊对小鼠脑缺血再灌注损伤后自由基变化的影响
赵　玲 1 ,徐秋萍 2 ,李　林 1
( 1. 首都医科大学宣武医院 药理研究室、北京脑老化重点实验室 ,北京　 100053; 2. 北京中医药大学 药理教研室 ,北京　
100029)
摘　要: 目的　研究聪圣胶囊对小鼠脑缺血再灌后脑组织自由基变化的影响 ,分析聪圣胶囊抗脑缺血损伤的作用
机制。 方法　采用早老龄小鼠双侧颈总动脉反复缺血再灌合并尾部放血降压模型 ,应用分光光度法观察小鼠脑组
织自由基的变化及聪圣胶囊对其影响。 结果　聪圣胶囊可拮抗脑缺血再灌注引起的 SOD活力的下降及 MDA含
量的升高 ,明显降低脑缺血再灌注引起的 NO水平及 NOS活性的升高。结论　聪圣胶囊可通过减轻脑缺血损伤后
自由基产生 ,降低升高的 NOS活性来发挥抗脑缺血作用。
关键词: 聪圣胶囊 ;脑缺血 ;自由基 ;一氧化氮
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0051 04
Effect of Congsheng Capsule on free radical change
after cerebral ischemia-reperfusion in mice
ZHAO Ling
1
, X U Qiu-ping
2
, LI Lin
1
( 1. Depar tment of Pha rmaco lo gy , Beijing Key Labo rato ry fo r Brain Aging, Xuanwu Hospital of Capita l Univ er sity o f Medi-
cal Sciences, Beijing 100053, China; 2. Depar tment of Pha rmacolog y , Beijing Univ ersity of TCM , Beijing 100029, China )
Abstract: Object　 To investiga te the effects o f Congsheng Capsule ( CSC) on free radical change af ter
cerebral ischemia-reperfusion, and analy ze the mechanisms o f CSC anti cerebral i schemia action.
·51·中草药　 Chinese T raditional and Herba l Drugs　第 34卷第 1期　 2003年 1月
收稿日期: 2002-04-27基金项目: “九五”国家攻关课题 ( 96-906-09-03)作者简介:赵　玲 ( 1972— ) ,女 ,辽宁沈阳人 ,助理研究员 ,博士。 1996年毕业于辽宁中医学院中医系 ,获医学学士学位 ;同年考入北京中医药大学 ,攻读硕士学位 ,导师为徐秋萍教授。在读期间获准硕博连读 , 2001年获医学博士学位。研究方向为脑缺血的发病机制和脑缺血与 AD的相关因素分析及中药的影响。