全 文 ：·药理与临床·
白藜芦醇对鼻咽癌细胞株 CNE-2Z 增殖和凋亡的影响
唐旭东1, 周克元1, 赵　南2Ξ
(11 广东医学院生物化学与分子生物学研究所, 广东 湛江　524023; 21 湛江市职业病防治所, 广东 湛江　524018)
摘　要: 目的　探讨白藜芦醇 ( resveratro l, R es) 对鼻咽癌细胞株 CN E22Z 增殖和凋亡的影响。方法　采用M T T
法检测 IC50值, 流式细胞术、Hoech st 33258öP I 荧光染色和 DNA 琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡。结果　不同浓度
R es 分别处理细胞 24, 48 和 72 h, 其 IC50值分别为 (10912±715) , (8316±610) , (5413±218) Λmo löL , 各 IC50值间
比较差异显著 (P < 0101)。25, 50, 100 和 200 Λmo löL R es 分别处理细胞 24 h 后, 50, 100, 200 Λmo löL R es 处理组经
流式细胞术和荧光染色检测出的细胞凋亡率均明显高于对照组 (P < 0101) , 荧光染色可见典型的凋亡形态学改变,
100, 200 Λmo löL R es 处理组可见明显的 DNA 梯带。结论　R es 可通过诱导 CN E22Z 细胞株凋亡而抑制其增殖。
关键词: 白藜芦醇; 鼻咽癌; 增殖; 凋亡
中图分类号: R 97911; R 739163; R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0287 04
Effects of resvera trol on prol ifera tion and apoptosis of na sopharyngea l
carc inoma cell l ine CNE-2Z
TAN G Xu2dong1, ZHOU Ke2yuan1, ZHAO N an2
(11 Inst itu te of B iochem istry and M o lecu lar B io logy, Guangdong M edical Co llege, Zhan jiang 524023, Ch ina;
2. Zhan jiang Inst itu te of O ccupational D iseases P reven tion, Zhan jiang 524018, Ch ina)
Abstract: Object　To invest iga te the effects of resvera tro l (R es) on the p ro lifera t ion and apop to sis of
nasopharyngeal carcinom a cell line CN E22Z. M ethods　 IC 50 values w ere detected by M T T assay. T he
apop to sis w as analyzed by flow cytom etry (FCM ) , Hoech st 33258öP I fluo rescence sta in ing, and DNA
agaro se gel electropho resis. Results　A fter CN E22Z cells w ere trea ted w ith differen t concen tra t ion s of R es
fo r 24, 48, and 72 h, their IC 50 values w ere (109. 2±7. 5) , (83. 6±6. 0) , and (54. 3±2. 8) Λmo löL re2
spect ively (P < 0101). A fter CN E22Z cells w ere trea ted w ith 25, 50, 100, and 200 Λmo löL R es fo r 24 h,
the apop to t ic ra tes by bo th flow cytom etry and fluo rescence sta in ing at 50, 100 and 200 Λmo löL R es2t rea t2
ed group s w ere sign if ican t ly h igher than tho se in con tro l group s (P < 0101). T he typ ica l mo rpho logica l
changes in apop to sis w ere found by fluo rescence sta in ing. T he resu lts of DNA agaro se gel electropho resis
show ed that DNA ladder appeared obviou sly at 100 and 200 Λmo löL R es2t rea ted group s. Conclusion　R es
can inh ib it the p ro lifera t ion of cell line CN E22Z th rough the induct ion of apop to sis.
Key words: resvera t ro l (R es) ; nasopharyngeal carcinom a; p ro lifera t ion; apop to sis
　　白藜芦醇 ( resvera tro l, R es) 化学名为　三酚
(3, 4, 52t rihydroxyst ibene) , 是一种天然活性成分,
目前已在葡萄、决明、藜芦、虎杖等 21 个科、31 个属
的 72 种植物中发现, 较早证实其有抗菌、抗炎、抗
血栓、抗脂质过氧化等功效, 近年还发现其有抗癌活
性。在对其抗癌机制研究中, 已发现 R es 可通过诱
导多种肿瘤细胞株凋亡而抑制其增殖[1～ 6 ] , 但 R es
对人鼻咽癌低分化上皮细胞株 CN E22Z 增殖和凋
亡的影响尚未见报道。本实验对此进行探讨。
1　材料与方法
111　药物、试剂和仪器: 白藜芦醇 (R es, 反式) 购
自南京学子医化研发中心, 纯度> 98% , 用 DM SO
溶解, 配成 200 mmo löL 贮存液, 煮沸 30 m in 消毒
后, 分装, - 20 ℃ 冻存备用。处理细胞时,DM SO 浓
度≤011% (实验证实该浓度对细胞生长无影响)。
Hoech st 33258 由 CN I 公司生产, P I 由 Sigm a 公司
生产;M T T 和DM SO 均为Am resco 公司产品。流
式细胞仪 (美国 Cou ter 生产, Ep ics—XL 型) , 酶标
·782·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003206213
基金项目: 广东省中医药局重点资助项目 (200002) ; 湛江市科委资助项目 (200106)
作者简介: 唐旭东 (1968—) , 女, 四川省富顺人, 硕士, 副教授, 主要从事肿瘤药理学研究。
T el: (0759) 238858122　E2m ail: tangxudong2599@ sina. com
免疫测定仪 (B io—T ek 公司生产, EL x800 型)。
112　细胞培养: CN E22Z 细胞株本所保存, 在 5%
CO 2, 37 ℃ 条件下, 用含 10% 小牛血清、100 U ömL
青霉素、100 ΛgömL 链霉素的R PM I 1640 培养液传
代培养, 实验用细胞均处于对数生长期。
113　细胞增殖抑制实验 (M T T 法) : 取对数生长期
细胞, 按每孔 5×103于 180 ΛL 培养液中接种于 96
孔板, 37 ℃, 5% CO 2过夜, 加入不同浓度的 R es (0,
12. 5, 25, 50, 100, 200, 400 Λmo löL ) , 每组设 8 个
平行孔。用药后分别培养 24, 48, 72 h, 每孔加入 20ΛL M T T (5 m gömL ) , 继续培养 4 h。倾去培养液,
每孔加 100 ΛL DM SO 溶解, 待完全溶解后, 于酶标
免疫测定仪测定其吸光度 (A ) 值, 测定波长为 570
nm , 参考波长为 450 nm。重复 3 次。计算细胞增殖
抑制率及 IC 50值, 绘制浓度2抑制率曲线。
细胞增殖抑制率= (1- A 处理组öA 对照组)×100%
114　流式细胞术检测: 分别收集对照, 25, 50, 100,
200 Λmo löL R es 处理 24 h 的细胞, D 2hank s 液洗
涤, 加预冷 70% 乙醇固定过夜。次日, 完全去除乙
醇后, 将细胞重悬于 40 ΛL 磷酸2枸橼酸缓冲液
(192 份 012 mo löL N a2H PO 4, 8 份 011 mo löL 枸橼
酸, pH 7. 8) 中, 用 50 ΛgömL P I (含 100 ΛgömL
RN ase A , 无 DN ase) 0. 5 mL 4 ℃ 避光染色 30
m in, 于流式细胞仪检测凋亡率。每组均设 3 个复
管, 并重复 3 次。
115　Hoech st 33258öP I 荧光染色: 收集对照, 25,
50, 100, 200 Λmo löL R es 处理 24 h 的细胞, 分别加
入 Hoech st 33258 和 P I, 使其终浓度分别为 10, 20ΛgömL , 37 ℃ 避光染色 30 m in 后, 在荧光显微镜下
随机计数 200 个细胞, 区分出坏死、凋亡和活细胞,
并计算细胞凋亡率、坏死率。每组均设 3 个复管, 并
重复 3 次。
116　DNA 琼脂糖凝胶电泳: 收集对照, 25, 50,
100, 200 Λmo löL R es 处理 24 h 的细胞, 参照文献[7 ]
进行实验, 结果经紫外透射仪观察并拍照。
117 　统计学处理: 数据用 x ± s 表示, 采用
SPSS1010 统计软件包 O ne2w ay ANOVA 与 Bon2
ferron i (方差齐) 或 T am hane’s T 2 (方差不齐) 检
验进行统计学处理。
2　结果
211　生长增殖抑制实验结果: 不同浓度的 R es 处
理 CN E22Z 细胞 24, 48, 72 h 的浓度2抑制率曲线见
图 1。用不同浓度的 R es 处理 CN E22Z 细胞 24, 48,
72 h 后, 抑制率均随浓度的增加而增加, 具有剂量
依赖性 (P < 0101) , 处理 24, 48, 72 h 的 IC 50值分别
为 ( 10912 ± 715 ) , ( 8316 ± 610 ) , ( 5413 ± 218 )Λmo löL , 各 IC 50值间比较差异显著 (P < 0101)。
1272 h　2248 h　3224 h
图 1　Res 对 CNE-2Z 的浓度-抑制率曲线 (n= 3)
F ig. 1　Concen tration - inh ibitory rate curves
of Res on CNE-2Z (n= 3)
212 　流式细胞术检测结果: 25, 50, 100, 200Λmo löL R es 处理 CN E22Z 细胞 24 h, 流式细胞术
检测结果见图 2。用 50 Λmo löL R es 处理 CN E22Z
细胞 24 h 后即可诱导其凋亡, 50, 100, 200 Λmo löL
处理组的凋亡率显著高于对照组 (P < 0101)。
与对照组比较: 3 3 P < 01013 3 P < 0101 vs con tro l group
图 2　流式细胞术检测 CNE-2Z 凋亡率 (n= 3)
F ig. 2　Apoptotic rate of CNE-2Z detected
by f low cytometry (n= 3)
213　Hoech st 33258öP I 荧光染色结果: 50, 100, 200Λmo löL R es 处理细胞 24 h 后, 出现典型的凋亡形
态学改变, 可见胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、
核固缩、核碎裂, 还可见膜包裹的凋亡小体。各处理
组的凋亡率和坏死率结果见表 1。 50, 100, 200Λmo löL R es 各处理组的凋亡率均显著高于对照组
(P < 0101) , 100, 200 Λmo löL R es 处理组的坏死率
也显著高于对照组 (P < 0101)。
214 　DNA 琼脂糖凝胶电泳结果: 用 100, 200Λmo löL R es 处理 CN E22Z 细胞 24 h, 可见明显的
DNA 梯带, 见图 3。
3　讨论
·882· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
表 1　CNE-2Z 凋亡率和坏死率 (x±s, n= 3)
Table 1　Apoptotic rate and necrotic rate
of CNE-2Z (x±s, n= 3)
组　别 Res 浓度ö(Λmo l·L - 1) 凋亡率ö% 坏死率ö%
对照 - 312±016 213±014
Res 25 516±017 216±013
50 1515±2143 3 310±017
100 2918±1123 3 413±0163 3
200 3517±1133 3 613±0173 3
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
12100 bp DNA m arker　22con tro l　3225 Λmo löL Res
4250 Λmo löL Res　52100 Λmo löL Res　62200 Λmo löL Res
图 3　Res 处理 24 h 后CNE-2Z 的D NA 琼脂糖凝胶电泳图
F ig. 3　Agarose gel electrophoresis of D NA
in CNE-2Z treated with Res for 24 h
　　肿瘤一直被认为是由于细胞分裂、增殖失控所
致。因此, 人们不断探索这种生长失控的原因, 寻找
治疗方法, 但仍未能取得理想结果。近年来通过对细
胞凋亡及其机制的深入研究发现, 一些化疗药物可
通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。
R es 是存在于多种食用、药用植物中的一种多酚类
化合物, 近年发现 R es 有抗癌活性, 对癌的起始、促
进、发展 3 个阶段均起作用。在对其抗癌机制的研
究中发现, R es 可通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制其
增殖, 从而达到抗癌目的。Sun 等[1 ]发现 R es 可剂量
和时间依赖性地抑制肝细胞瘤细胞株 H 22 生长增
殖, 其 IC 50值为 6175 m göL , 用普通显微镜和电子显
微镜观察均发现药物处理组出现典型凋亡小体, 因
而 R es 可经凋亡途径抑制 H 22 细胞生长增殖。L in
等[2 ]用 R es 处理人前列腺癌细胞株DU 145, 通过核
小体含量检测证实有凋亡发生。Gao 等[3 ]用 25～ 50Λmo löL R es 在体外处理鼠髓细胞样白血病细胞株
32Dp 210, 发现 R es 不可逆地抑制 32Dp 210 细胞克
隆生长, 这种由 R es 引起的克隆生长抑制同大量细
胞死亡有关; 通过亚二倍体 (亚2G1) 细胞的增多、
DNA 碎片的产生, 可推测凋亡是 32Dp 210 细胞的
死亡方式。Joe 等[4 ]用 R es 处理 6 种人癌细胞株
(M CF27, SW 480, HCM 7, Seg21, B ic21 和 HL 260) ,
发现除 B ic21 细胞外, R es 对其余 5 种癌细胞株均
有明显增殖抑制作用, IC 50值在 70～ 150 Λmo löL , 且
根据亚 G1峰及 annex in V 分析证实有凋亡发生。
Rom an 等[5 ]报道 R es 对来源于慢性B 2细胞恶性瘤
(W SV 2CU 和 ESKOL ) 的人 B 2细胞株显示抗增殖
活性, 且经 annex in V 结合、caspase 活性、DNA 碎
片的增加和线粒体跨膜电位的减少, 证实 R es 可诱
导这两株细胞凋亡。N akagaw a 等[6 ] 报道高于 44Λmo löL 的 R es 可抑制 3 种人乳腺癌细胞株 (雌激
素受体 ER 阳性细胞株 KPL 21,M CF27 和 ER 阴性
细胞株M KL 2F) 增殖, 且由于亚 G1峰的出现, 证实
此增殖抑制与诱导细胞凋亡有关。
以上研究证实 R es 可通过诱导细胞凋亡来抑
制一些肿瘤细胞的增殖。但也有报道[8 ] , R es 能抑制
人肝癌细胞株 H epG2增殖, 并未有证据显示凋亡的
发生。M anna 等[9 ]报道 R es 可阻止 TN F 对U 2937
细胞的毒性作用, 并抑制 caspase22, caspase23, cas2
pase27 的活化, 因而抑制 TN F 诱导的凋亡。N ico lin i
等[10 ]还发现反式 R es 通过抑制 caspase27 的活化和
PA R P 的裂解, 来抑制一种抗癌药 Paclitaxel 诱导
人神经母细胞瘤细胞株 SH 2SY5Y 凋亡。因而 R es
除可诱导肿瘤细胞凋亡外, 可能还有抑制凋亡作用。
为探讨 R es 对鼻咽癌细胞株 CN E22Z 凋亡的影响,
本实验用不同浓度的 R es 分别处理 CN E22Z 细胞
24, 48 和 72 h 后, 用M T T 法检测增殖抑制率, 发
现各时间点的抑制率随浓度的升高而增加 (P <
0101) , 不同时间 IC 50值间的差异具有统计学意义
(P < 0101)。这说明 R es 剂量与时间依赖性地抑制
CN E22Z 细胞的增殖。用流式细胞术、Hoech st
33258öP I 荧光染色及 DNA 琼脂糖凝胶电泳均证
实有凋亡的发生, 随浓度增加, 凋亡率也增加 (但同
时也有少部分以坏死的形式死亡)。因此推测 R es
可通过诱导凋亡的途径抑制 CN E22Z 细胞增殖, 因
而 R es 可望发展成为一种抗鼻咽癌的药物。
References:
[ 1 ]　Sun Z J , Pan C E, L iu H S, et a l. A n tihepatom a activity of
resveratro l in v itro [J ]1 W orld J Gastroen terol, 2002, 8 (1) :
792811
[ 2 ]　L in H Y, Sh ih A , D avis F B, et a l. Resveratro l induced ser2
ine pho spho rylation of p53 causes apop to sis in a m utan t p53
p ro state cancer cell line [J ]1 J U rol, 2002, 168 (2) : 7482
7551
[ 3 ]　Gao X, Xu Y X, D ivine G, et a l. D isparate in v itro and in v i2
·982·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
vo an tileukem ic effects of resveratro l, a natu ral po lypheno lic
compound found in grapes [J ]1 J N u tr, 2002, 132 ( 7 ) :
2076220811
[ 4 ]　Joe A K, L iu H , Suzu iM , et a l. Resveratro l induces grow th
inh ib it ion, S2phase arrest, apop to sis, and changes in b io2
m arker exp ression in several hum an cancer cell lines [J ]1
C lin Cancer R es, 2002, 8 (3) : 89329031
[ 5 ]　Rom an V , B illard C, Kern C, et a l. A nalysis of resveratro l2
induced apop to sis in hum an B2cell ch ron ic leukaem ia [J ]1 B r
J H aem a tol, 2002, 117 (4) : 84228511
[ 6 ]　N akagaw a H , Kiyozuka Y, V em ura Y, et a l. Resveratro l in2
h ib its hum an breast cancer cell grow th and m ay m itigate the
effect of lino leic acid, a po ten t b reast cancer cell st im ulato r
[J ]1 J Cancer R es C lin O ncol, 2001, 127 (4) : 25822641
[ 7 ]　Peng L M , W ang Z L 1 B asis and C lin ic of A p op tosis (细胞凋 亡的基础与临床) [M ]1 Beijing: Peop le’sM edical Pub lish ingHouse, 20001[ 8 ]　D eL edinghen V , M onvo isin A , N eaud V , et a l. T rans2resveratro l, a grapevine2derived po lypheno l, b lock s hepato2cyte grow th facto r2induced invasion of hepatocellu lar carcino2m a cells [J ]1 In t J O ncol, 2001, 19 (1) : 832881[ 9 ]　M anna S K, M ukhopadhyay A , A ggarw al B B1 Resveratro lsupp resses TN F2induced activation of nuclear transcrip tionfacto rs N F2ϑB, activato r p ro tein21, and apop to sis: po ten tialro le of reactive oxygen in term ediates and lip id perox idation[J ]1 J Imm unol, 2000, 164 (12) : 6509265191[ 10 ]　N ico lin i G, R igo lio R , M ilo so M , et a l. A n tiapop to tic effectof trans2resveratro l on paclitaxel2induced apop to sis in the hu2m an neurob lastom a SH 2SY5Y cell line [J ]1 N eu rosci L ett,2001, 302 (1) : 412441
阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究
汪　泱1, 邓志锋2, 赖贤良2, 王共先1, 李　明2, 宋书欣2Ξ
(11 江西医学院第一附属医院泌尿外科研究所, 江西 南昌　330006;
21 江西医学院第二附属医院 神经外科, 江西 南昌　330006)
摘　要: 目的　探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法　分离培养大鼠骨髓
间充质干细胞, 采用阿魏酸钠对其进行诱导培养, 倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化, 并应用
免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白 (N F) 及神经元特异性烯醇化酶
(N SE) 的表达。结果　阿魏酸钠诱导培养 6 h 后即可见细胞形态发生明显变化, 24 h 后表现为典型的神经细胞样
形态,N F 和 N SE 神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论　初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间
充质干细胞向神经细胞分化的作用。
关键词: 骨髓间充质干细胞; 阿魏酸钠; 神经细胞
中图分类号: R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0290 03
D ifferen tia tion of ra t bone marrow m esenchyma l stem
cells in to neuron s induced by sod ium ferula te
W AN G Yang1, D EN G Zh i2feng2, LA I X ian2liang2, W AN G Gong2x ian1, L IM ing2, SON G Shu2x in2
(11 Inst itu te of U rinary Surgery, F irst A ffilia ted Ho sp ita l; 2. D epartm ent of N euro surgery,
Second A ffilia ted Ho sp ita l, J iangx iM edical Co llege, N anchang 330006, Ch ina)
Abstract: Object　To study the po ssib ility that sodium feru la te induced differen t ia t ion of adu lt ra t
bone m arrow m esenchym al stem cells (BM SC) in to neu ron s. M ethods　BM SC from adu lt ra t w ere iso la ted
and cu ltu red. T hen BM SC w ere induced by sodium feru la te in serum 2free m edium fo r d ifferen t period. T he
mo rpho logica l changes of the cells w ere ob served under phase con trast m icro scope. T he neu ronal specif ic
m arkers, neu rofilem en t (N F) , and neu ron specif ic eno lase (N SE) w ere evaluated by indirect imm unocy2
tochem isty sta in ing. Results　A fter induct ion fo r 6 h, som e BM SC show ed mo rpho logica l changes obvi2
ou sly. Tw en ty2fou r hou rs la ter, the differen t ia ted cells show ed typ ia l neu ronal mo rpho logy, and exp ressed
neu ron2specif ic m arkers, such as N F and N SE. Conclusion　Sodium feru la te has induct ive effect on differ2
en t ia t ion of BM SC in to neu ron s of adu lt ra t in v itro.
Key words: bone m arrow m esenchym al stem cell; sodium feru la te; neu ron s
·092· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
收稿日期: 2003208227
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30160084) ; 江西省自然科学基金项目 (0240047)
作者简介: 汪　泱 (1963—) , 女, 江西省南昌市人, 博士, 研究员, 主要从事细胞免疫及组织工程的基础研究。
T el: (0791) 8872366　E2m ail: w angy63@yahoo. com