全 文 ：根注射液、清开灵注射液、穿琥宁注射液、抗腮腺炎
注射液和双黄连贮液等按 1∶ 5, 1∶ 25, 1∶ 125,
1∶ 625, 1∶ 2500, 0稀释 ,各浓度药品 0. 2 mL与
1 EU /mL的内毒素 0. 2 mL 37℃ 温浴 60 min,各
种药品均设药物对照 ,为弥补药品本身的颜色对结
果的影响 ,有颜色的药品每个浓度设一个药物对照。
1. 2. 2　内毒素测定:分别取各管反应液 0. 1 mL,与
鲎试剂 0. 05 mL混匀 ,置于 37℃ 水浴 25 min,再
加入鲎三肽 0. 05 mL,置于 37℃ 水浴 3 min,取出
后加入亚硝酸钠溶液 0. 5 mL,混匀后加入氨基磺酸
胺 0. 5 mL混匀 ,加入萘乙二胺 0. 5 mL混匀 ,于波
长 545 nm测定 A值 (分光光度计 ,北京瑞利分析仪
器公司 , UV 9100)。 用标准曲线的回归方程计算反
应液中的内毒素含量。 以药物清除的内毒素占总内
毒素的百分比表示清除率: 清除率= (总内毒素量-
剩余内毒素量 ) /总内毒素量× 100% 。
2　结果
8种药物中 ,双黄连、板蓝根和清开灵注射液抗
内毒素效果最好 ,在稀释 2 500倍后仍然能够中和
70%～ 90% 的内毒素 ;穿琥宁、鱼金和鱼腥草注射
液也有一定的抗内毒素作用 ;大青叶和抗腮腺炎注
射液的抗内毒素效果较差 (表 1)。
3　讨论
　　中草药用来治疗各种感染性疾病的研究由来已
表 1　 8种中药注射剂的体外抗内毒素作用
药物 稀释度 清除率 (% ) 药物 稀释度 清除率 (% )
双黄连 2 500 72. 7 清开灵 2 500 87. 3
鱼金 125 57. 1 板兰根 2 500 94. 5
穿琥宁 625 85. 3 大青叶 25 31. 3
抗腮腺炎 5 21. 0 鱼腥草 125 69. 1
　　注:稀释度为该作用的最大稀释倍数。
久 ,以往多是从抑菌、杀菌等方面进行研究 ,其效果
往往不及抗菌素。研究表明多种清热解毒药物如黄
连、黄芩、白头翁、板蓝根等都具有抗内毒素功
效 [1, 2 ]。此次实验所选用的药物 ,多属于清热解毒中
药注射剂 ,结果表明 ,这些药物在体外均有抗内毒素
的作用。 对 8种中药注射剂的抗内毒素作用进行比
较 ,双黄连、板蓝根和清开灵注射液抗内毒素效果最
好 ,稀释 2 500倍仍能中和大部分内毒素。穿琥宁、
鱼金和鱼腥草注射液也有较好的抗内毒素作用 ,稀
释 125倍能中和 50%以上内毒素。大青叶和抗腮腺
炎注射液抗内毒素效果较差 ,稀释 25倍的大青叶
注射液仅能中和 31. 3% 的内毒素。结果提示 ,在中
药中筛选抗内毒素药物有着广阔的前景。
参考文献:
[1 ]　谭毓治 ,彭旦明 ,龙舜玲 ,等 . 九个方剂对大鼠实验性发热的影
响 [ J] . 中国中药杂志 , 1989, 14( 5): 50-51.
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药 , 1993, 24( 8): 413-414.
小檗胺类化合物对黑色瘤细胞内钙调蛋白水平的影响
段江燕 1 ,张金红 2
( 1. 山西师范大学 生物系 ,山西 临汾　 041000; 2. 南开大学分子生物学研究所 ,天津　 300071)
摘　要:目的　研究 5种小檗胺类化合物对恶性黑色瘤细胞内钙调蛋白 Calmodulin ( CaM )水平的影响。方法　收
集不同浓度不同药物作用后的细胞 ,通过反复冻融法破碎细胞 ,并用磷酸二酯酶 ( PDE)法测 CaM含量。结果　 5种
化合物均能不同程度地降低细胞内 CaM的水平 , IC50 (μmol / L) 值分别为: B0= 10. 73, B2= 9. 1, B4= 7. 4, BB=
6. 15, EBB= 1. 55。 结论　小檗胺衍生物降低细胞内 CaM 的能力大于小檗胺 ,其中 EBB的效果最为突出。
关键词: 小檗胺 ;衍生物 ;拮抗剂
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0059 03
·59·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-06-18作者简介:段江燕 ( 1966-) ,女 ,山西省临汾市人 , 1987年毕业于吉林大学化学系生化专业 ,获理学学士学位 , 1996年毕业于南开大学生命科学院分子生物学研究所 ,获理学硕士学位。现为山西师范大学生物系副教授 ,从事生物化学的教学和科研工作 ,曾参加过多项国家或省部级科研项目 ,发表研究论文 10余篇。 　 Tel: 0357-2051796(宅 )　 0357-2051196(办 )　 E-mail: D2051796
@ public. l f. s x. cn.
Effects of berbamine compounds on calmodulin content in bowes cells
DUAN Jiang-yan
1 , ZHANG Jin-hong
2
( 1. Depar tment of Bio lo gy , Shanxi No rmal Unive rsity , Linfen Shanx i 041000, China;
2. Institute fo r Mo lecula r Bio lo gy , Nankai Univ ersity, Tianjin 300071, China)
Key words: berbamine; deriv ativ e; antag onist
　　 CaM作为细胞内诸多酶系统的激活因子 ,其浓
度水平的改变往往影响细胞增殖的过程。 某些肿瘤
的发生、发展与 CaM密切相关 ;许多实验结果证
明 [1 ] ,细胞内 CaM的水平升高常常与细胞的无序增
殖 ,特别是恶性肿瘤细胞增殖呈正相关 ,如 CaM水
平与肝癌生长速度呈正相关 ,齿类及鸟类肿瘤中含
量为正常的 2～ 4倍 ,牛皮癣患者病变区域浓度比
正常的区域高 30倍 [2 ]。CaM拮抗剂在拮抗 CaM活
性的同时 ,对细胞的增殖也有一定的抑制作用。人们
预言 CaM拮抗剂对于抗肿瘤具有很大的潜力 [2 ]。
小檗胺是一种新型的天然钙调蛋白拮抗剂 ,对
其结构进行化学修饰 ,合成了一系列小檗胺衍生物 ,
酶学实验证明改性后的小檗胺衍生物拮抗的能力超
过其母体小檗胺几倍到几十倍之多 ,且专一性系数
高 [3 ]。先期的细胞学实验结果表明小檗胺衍生物对
脑恶性胶质瘤细胞 [4 ] ,人宫颈癌细胞 [5 ] ,腹水癌细胞
以及黑色素瘤细胞等都有明显的抑制作用 [ 6] ,且抑
制肿瘤细胞增殖的作用比小檗胺强 [7 ]。 此结果与酶
学基本一致 ,说明这些化合物抑制细胞增殖与拮抗
CaM的活性有关。
为了研究小檗胺类化合物对细胞内 CaM水平
的影响 ,本研究以恶性黑色素瘤 ( bow es)细胞为实
验材料 ,观察了 5种小檗胺类化合物对细胞生长增
殖的影响及其 CaM含量的变化 ,其目的在于进一
步探讨 CaM与肿瘤的生长关系以及 CaM拮抗剂
作为抗肿瘤药物的可行性提供科学依据。
1　材料
1. 1　 bow es细胞:天津市肿瘤研究所生化室提供。
1. 2　药物与试剂:小檗胺 ( B0 ):北京东升制药厂 (分
析纯 )。 小檗胺衍生物 ( B2、 B4、 BB、 EBB): 南开大学
分子生物学研究所生化室合成 (分析纯 )。 磷酸二酯
酶 ( PDE):南开大学分子生物学研究所生化室制备。
钙调蛋白 ( CaM ): 南开大学分子生物学研究所制
备 ,电泳均一纯。 其他试剂为国产或进口分析纯。
2　方法
2. 1　细胞培养: 细胞在含有 10% 新生牛血清的
DEME培养液中 ,置 5% CO2、 37℃ 的培养箱中培
养 , 3～ 4 d后传代。
2. 2　细胞样品处理: 将接种量一定细胞 ( 104 cfu /
mL)于 24孔细胞培养板培养 ,分为实验组和对照
组。 培养 24 h后对实验组加入不同浓度的不同药
物 ,继续培养 ,每 24 h进行活细胞计数 ,并收集细
胞 ,连续 4 d,将收集的细胞用 1 mL匀浆液垂悬 ,反
复冻融 ,使其细胞破碎 ,取出 100 m L样品用于总蛋
白测定 ,其余部分 100℃ , 4 min灭活杂蛋白及酶 ,
15 000 r /min, 4℃ 离心 40 min,取上清 ,调 Ca2+ 浓
度为 2 mmol /L,用于 CaM含量测定。
2. 3　样品中 CaM含量测定 [8 ]: 根据 PDE可特异
地把环核苷酸水解为 5-核苷酸 ,并在蛇毒中的核苷
酸水解酶作用下 ,进一步水解成腺苷和磷酸 ,用孔雀
石绿法测定水解的最终产物无机磷 ,计算出酶活力。
以已知牛脑 CaM作标准曲线 ,同时用 PDE法测细
胞样品中的 CaM ,以 PDE达最大激活的一半时所
需 CaM量为一个 CaM活性单位 ,计算细胞样品中
CaM的含量。
CaM含量 = 2× (样品 A660-基础酶活 A660 )最大激活 A660- 基础酶活 A660 1个 CaM活性单位
2. 4　蛋白含量测定:染料结合法测定总蛋白 [9 ] ,以
BSA为标准蛋白 ,绘制标准曲线。
3　结果与讨论
在本实验条件下 ( PDE法 ): 对照组的 CaM水
平 (以总蛋白中 CaM含量计算 )高于实验组 ,其抑
制的程度与加药的浓度成正相关 ,即随药物浓度的
增加 ,抑制能力增加 (图 1～ 4) ,就小檗胺衍生物而
言 ,由于取代基的不同表现出抑制作用的不同 ,药物
作用 bow es细胞 48 h使细胞内 CaM降低 50% 时
所需的药物浓度 (μmol /L ) 分别为: EBB= 1. 55,
B0= 10. 73, BB= 6. 15, B2= 9. 1, B4= 7. 6,结果说明
这几种化合物不仅具有抑制细胞增殖的作用 ,而且
对细胞内 CaM的水平也有明显的影响 ,随化合物
浓度的升高 ,细胞内可溶性 CaM降低程度增强 ,随
化合物作用 bow es细胞时间的延长 , CaM 水平回
升 ;化合物与细胞接触在 48 h内 ,对细胞内 CaM浓
度影响最大。
经改性后的小檗胺 ,无论是烷氧基化的小檗胺
( EBB、 B2、 B4 ) ,还是酰基化的小檗胺 ( BB) ,其降低细
胞内 CaM水平的能力均强于未修饰的母体小檗
·60· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
胺 ,其中烷氧基的小檗胺表现出随碳原子数目的增
多抑制作用增强 ( EBB> B4> B2> B0 ) ,这有可能是
疏水性的增强以及空间结构的复杂 ,使拮抗 CaM
的性能增强。在本实验测定条件下 ,同浓度的药物作
用 bow es细胞后 CaM 含量降低率分别为: B0=
17. 5% ; B2= 23. 5% ; B4= 37. 1% ; EBB= 43% ;这一
结果与抑制生长曲线及集落实验的结果相吻合 [7 ]。
刘树人等在钙调蛋白拮抗剂对长春花碱抗癌作用的
影响的实验中 [10 ] ,采用胃癌细胞系 MGC803研究
钙调蛋白拮抗剂 W7和 CaM含量的影响 ,结果发现
培养 24 h 25μmol /L W7可使细胞 CaM含量降低
33. 2% ;我们的实验中 , 1μmol /L EBB培养 24 h的
bow es细胞可使 CaM降低 46. 3% ,相差 25倍 ,虽
细胞不同 ,但仍能间接地看出 EBB的效果之强。
在本实验中发现 CaM 拮抗剂的浓度与拮抗
CaM 的能力成正比关系 ,如加入药物 24 h 0. 2
μmol /L使 CaM含量降低 12% ; 1μmo l /L使 CaM
含量降低 46. 3% ; 2. 5μmol /L使 CaM 含量降低
51. 2% ,但随培养时间的延长 ,相对的 CaM降低率
有所升高 ,推测细胞在增殖过程中需要一定的药物
浓度 ,才能使增殖的细胞受到抑制 ,但随培养时间的
延长 ,随药物被代谢分解 ,药物浓度相对降低 ,从而
降低拮抗 CaM活性 ,使细胞增殖继续 ,因此表现出
拮抗 CaM的性能降低 ,使 CaM相对抑制率升高。
参考文献:
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中华医学杂志 , 1994, 7( 4): 11-14.
《中草药》杂志 2001年增刊征订启事
为了促进中药现代化的研究进程 ,加强中药新药研究与开发的信息交流 ,商讨我国入关后中药产业的发展新对策 ,推动
西部药用植物资源的保护、开发和利用 ,《中草药》杂志编辑部拟于 2001年 10月中旬在四川省成都市召开“第三届中药新药研
究与开发信息交流会暨《中草药》杂志第七届编委会”。为了配合此次会议的召开 ,经国家科技部国科财便字 ( 2001) 066号文批
准 ,我们编辑出版了《中草药》杂志 2001年第 32卷增刊。本增刊共收载论文 150篇 ,特邀中国工程院院士和国内十多位知名专
家和中青年学科带头人就中药新药研究的热点问题撰写综述文章 (文题见《中草药》杂志 2001年第 7期 )。另外 ,还有反映国内
近年来中药植化、药理、分析、制剂、药材及临床等方面的新理论、新方法和新成就的科研论文和综述性文章 140余篇。
增刊为大 16开本 , 200页 (约 50万字 ) ,天津市报刊增刊特许准印证 ( 2001)第 098号 ,定价 65元 ,另加包装费、邮费 5元。
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