全 文 ：西北植物学报 2000, 20( 5): 772— 777
Acta Bot . Boreal .-Occident. Sin.
文章编号: 1000-4025-( 2000) 05-0772-06
怀山药零余子愈伤组织诱导及
植株再生的研究①
李明军 ,张嘉宝 ,张海波
(河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453002)
摘　要 :对怀山药 (Dioscorea opposita)零余子愈伤组织的诱导、分化、再生苗的生根和移栽进
行了研究。 结果表明: ( 1)在不同激素组合的培养基上怀山药零余子均能产生愈伤组织 ,而且
具有一次成苗的能力。 BA 2 mg /L+ N AA 2 mg /L的培养基对诱导愈伤组织最有利 ,其出愈
率达 100% ; ( 2)在愈伤组织的分化中 , BA 1 mg /L+ NAA 1mg /L的激素组合是最佳的 ,其分
化率为 63. 6% ,且多形成丛生芽 ; ( 3)再生植株生根和壮苗的最好激素组合为 KT 2 mg /L+
N AA 0. 02 mg /L+ PP333 0. 1 mg /L,生根率为 91. 2% ,且根系发达 ,叶色浓绿 ,生长健壮。再
生植株移栽后生长健壮 ,对环境具有较好的适应性。
关键词: 怀山药 ;零余子 ;愈伤组织 ;再生植株 ;移栽
中图分类号: Q944. 6　　　文献标识码: A
Study on the callus induction and plantlet regeneration
from the bulbil of Dioscorea opposita
LI Ming-jun, ZHANG Jia-bao, ZHANG Hai-bo
( Col leg e of Life Science, Henan No rm al Univ ersi ty, Xinxiang, Henan 453002, China)
Abstract: This paper deals wi th studies on in vitro culture o f bulbil of Dioscorea opposita ,
including callus induction and di fferentia tion, plantlet roo t development and transplanta-
tion. Results show ed: ( 1) Calli w ere obtained from bulbil on media containing di fferent
kinds o f aux in and cytokinin, also the plant lets could be developed at the same time. It
w as advantag eous to callus induction on M S basal medium supplemented wi th BA 2 mg /
L and N AA 2 mg /L. The f requency of callus induction was 100% ; ( 2) The combination
① 收稿日期: 1999-05-04;修改稿收到日期: 1999-08-20
基金项目:河南省科委、教委自然科学基金和河南省科技攻关资助项目。
作者简介:李明军 ( 1962— ) ,男 (汉族 ) ,硕士 ,副教授。
o f BA 1 mg /L and N AA 1 mg /L w as the best to cal lus dif ferentiation of w hich ratio w as
63. 6% . Most of calli fo rmed multiple buds; ( 3) 91. 2% of the regenerated plant lets
t reated w ith KT 2 mg /L+ N AA 0. 02 mg /L+ PP333 0. 1 mg /L could develop thei r
roots, g rew robust ly and robusted g reen leaves; after the regenerated plant lets w ere
t ransplanted to soi l, they grew robust ly and robusted g reen leaves, moreover could adapt
to envi roment.
Key words: Dioscorea opposita; bulbi l; callus; plant regenera tion; t ransplant
怀山药 (Dioscorea opposita)为薯蓣科薯蓣属植物 ,是我国著名的“四大怀药”之一 ,主
产于河南温县、武陟等地 ,其块茎入药具有健脾、补肺、固肾、益精之功效 ,是我国地道的药
材和传统出口商品 ,其产品畅销东南亚和日本等国 [1, 2 ]。但由于怀山药长期采用营养繁殖 ,
致使其产量下降、品质退化 ,甚至某些优良品种也被药农放弃种植。
近年来 ,迅速发展的植物组织培养技术和基因工程技术为提高农作物产量和质量提
供了有效的措施。 怀山药组织培养的研究国内外均有报道 [3～ 6 ] ,但多以茎段、茎尖或叶片
为外植体 ,而利用零余子作为外植体进行离体培养的研究还无人开展。零余子是怀山药叶
腋间形成的珠芽 ,又名小块茎 ,俗称山药蛋 ,它含有皂苷、胆碱、淀粉、自由氨基酸和糖蛋白
以及大量的维生素 C等有效成分 ,是怀山药入药的重要部位之一 [2, 7 ]。本实验以零余子为
材料 ,通过愈伤组织的诱导和器官发生途径建立了良好的再生体系 ,为怀山药优良品种的
快速繁殖以及在细胞和分子水平上改良和创建怀山药新品种奠定了良好的基础。
1　材料和方法
1. 1　材　料
　　供试材料为怀山药优良品种“铁棍山药”试管苗形成的零余子。
1. 2　方　法
1. 2. 1　零余子的形成　按文献 [3]的方法获取无菌苗 ,并将无菌苗转移到 MS基本培养
基上培养 5～ 6个月 ,即可在茎节处形成一定大小的零余子。
1. 2. 2　愈伤组织的诱导　在超净工作台上 ,从试管苗上取下形成的零余子 ,切割成长宽
均为 5 mm左右的切块置于添加不同激素组合的脱分化培养基上 (表 1)。 30 d时统计出
愈率和成苗率。
出愈率= (形成愈伤组织的切块数 /接种的切块数 )× 100%
成苗率= (形成苗的愈伤组织块数 /形成愈伤组织的切块数 )× 100%
1. 2. 3　愈伤组织的分化　选择生长较好、质地疏松的愈伤组织作为进一步分化培养的材
料 ,并将其切割成长宽约为 3 mm左右的切块放入添加不同激素组合的分化培养基中 (表
2) , 40 d时统计分化率和平均成苗数。分化率= (分化苗的愈伤组织 /接种的愈伤组织 )×
100% ;平均成苗数= 分化苗的总数 /分化出苗的愈伤组织块数。
1. 2. 4　再生植株的壮苗、生根和移栽　将高 2～ 3 cm的苗移入生根培养基 (表 3) , 40 d
时统计生根率。生根率= (生根苗数 /培养苗总数 )× 100%。
7735期 李明军等: 怀山药零余子愈伤组织诱导及植株再生的研究
选择生长健壮、根系发达的试管苗移入装有细砂的营养钵中 ,每天用自来水或营养液
进行叶面喷雾 ,保持湿度 ,并定时定量浇营养液。 15 d时统计成活率 , 30 d后将成活的试
管苗移入大田。
表 1　怀山药零余子愈伤组织的形成和分化
Table 1　 Fo rma tion and differentia tion o f calli f rom bulbil explants o f Dioscorea opposita
培养基编号
No. of
medium
植物激素浓度
(毫克 /升 )
Phytoh ormone
concen tration
( mg /L)
接种切块数
No. of inoculation
ex plants
出愈率 (% )
Rate of cal lus
p rod uction (% )
成苗率 (% )
Rate of callus
dif f erentiation (% )
( 0) 0 30 0 0
( 1) KT2+ N AA2 48 68. 7 12. 5
( 2) K T2+ 2, 4-D 1 36 66. 7 0
( 3) 6-BA2+ N AA2 93 100 12. 9
( 4) 6-BA2+ IAA0. 2 36 33. 3 33. 3
表 2　怀山药零余子愈伤组织的分化与植株再生
Table 2　 Differentia tion and plantlet reg enera tion o f bulbil callus o f Dioscorea opposita
培养基编号
No. of
medium
植物激素浓度
(毫克 /升 )
Phytohormone
concen t ration
( mg /L)
接种的愈伤组织数
No. of in oculation
cal lus
愈伤组织分化率 (% )
Frequency of
callus
dif f erentiation
(% )
每块愈伤组织平均苗数
Mean number
of plan tlets
per cal lus
每块愈伤组织最多苗数
M os t n umber
of plan tlet s
per callus
( 5) 0 21 0 0 0
( 6) BA1+ N AA0. 1 48 16. 7 1 1
( 7) BA1+ N AA0. 5 52 23. 4 1 1
( 8) BA1+ N AA1 88 63. 6 4. 4 10
( 9) BA2+ N AA0. 1 36 33. 3 2. 7 4
( 10) BA2+ N AA0. 5 32 50 3. 5 5
( 11) BA2+ N AA1 44 36. 4 2. 8 4
( 12) BA4+ N AA0. 1 60 13. 3 1. 5 2
( 13) BA4+ N AA0. 5 56 28. 6 2. 3 4
( 14) BA4+ N AA1 36 16. 7 1 1
表 3　怀山药无根苗在生根培养基上的生根
Table 3　 Roo ting o f ro o tless shoo ts o f Dioscorea opposita on the r oo ting medium
培养基编号
No. of
medium
植物激素浓度
(毫克 /升 )
Ph ytoh ormone
concent ration
( mg /L)
接种的无根苗数
No. of
roo tless
shoots
inoculated
生根率 (% )
Root induction
rate(% )
( 15) KT2+ N AA0. 02 51 47. 1
( 16) KT2+ N AA0. 02+ PP333 0. 1 68 91. 2
1. 3　培养及移栽条件
所有的培养基均以 MS为基本培养基 ,并附加不同的植物生长调节剂 ,含蔗糖 3% ,
琼脂 0. 7% ,调 pH为 5. 8,并在 121℃下高压灭菌 20 min。培养室温度为 25℃± 2℃ ,光强
为 2000 lx ,光照时间为 14 h /d。移栽在自然条件下进行。
774 西　北　植　物　学　报 20卷
2　实验结果
2. 1　愈伤组织的诱导
　　将零余子切块置于不同的脱分化培养基中。 6 d时 , ( 1)号培养基上的切块边缘部位
开始出现零星的白色或绿色的愈伤组织。 10 d时 , ( 2)号培养基上的切块颜色开始发白 ,
( 3)号培养基上的切块在边缘处开始形成白色的愈伤组织 ,质地疏松 (图版Ⅰ , 1)。 15 d
时 , ( 4)号培养基上的切块开始膨大 , ( 3)号已经出现明显的愈伤组织 ,少数已布满整个切
块表面。 30 d时愈伤组织的形成和分化情况见表 1。
从表 1可知 , ( 3)号培养基对于零余子愈伤组织的形成最有利 ,其出愈率为 100% ,
( 1)和 ( 2)号培养基出愈率大致相同 , ( 0)号培养基则无愈伤组织形成。 在观察中还发现
( 1)、 ( 3)和 ( 4)号培养基上的愈伤组织可以直接分化出苗 ,但这些苗通常是单生苗 ,即一块
愈伤组织仅形成一个苗 (图版Ⅰ , 2)。
2. 2　愈伤组织的分化
将 ( 3)号培养基诱导形成的愈伤组织切割后置于不同的分化培养基中培养。 6 d时 ,
多数愈伤组织由原来的白色变为灰褐色 ,同时从少量的愈伤组织上开始分化出根。 10 d
时 ,所有培养基中的愈伤组织切块开始重新形成新的愈伤组织 ,颜色灰白 ,质地疏松 ,此时
多数愈伤组织长出根 ,在 ( 8)号培养基上开始有芽的分化 , ( 10)、 ( 11)和 ( 13)号中的愈伤组
织也有绿色突起的出现。 20 d时 ,在 ( 8)号培养基上已经能够辨别出芽的个数 ,而且芽也
比较高 ,达 0. 7 cm。 40 d时不同的分化培养基上苗的分化情况见表 2。
从表 2可以看出 ,在无任何激素的培养基 ( 5)上 ,愈伤组织不发生分化 ,而在添加 BA
与 NAA不同浓度与不同组合的培养基上 ,愈伤组织均有不同程度的分化 ,其中 ( 8)号培
养基分化率最高 ,为 63. 6% ,而且每一块愈伤组织上形成的芽也较多 ,最多的有 10个小
芽 ,平均成苗数达 4. 4,也是最高的。研究发现多数培养基上均能形成丛生芽 (图版Ⅰ , 3)。
2. 3　再生植株的壮苗、生根和移栽
从愈伤组织上将高 2～ 3 cm的苗切离 ,移入 ( 15)和 ( 16)号培养基中 , 10 d左右再生苗
从茎节的膨大处和叶腋部开始产生新芽 ,并有根的生长。 这 2种培养基均能诱导生根 ,但
生根率不同 , ( 16)号培养基不仅生根率较高 ,而且还能使根早生快发 ,根粗而多 ,根系发达
(图版Ⅰ , 4) ,地上部分生长健壮 ,叶色浓绿 ,生长整齐一致。 40 d时 , 2种培养基的生根率
见表 3。
4月中旬 ,将根系发达的试管苗移入营养钵 ,没有发生萎蔫现象 ,成活率达 90%以上
(图版Ⅰ , 5) ,移入大田后 ,生长健壮 ,叶色浓绿 ,生长良好 (图版Ⅰ , 6) ,并对环境具有较强
的适应能力。
3　讨　论
3. 1　植物激素对愈伤组织诱导的影响
　　从表 1可知 ,愈伤组织的诱导形成必须加入植物激素 ,但植物激素的种类、浓度和比
值不同 ,对愈伤组织诱导形成的效果也不同。从 ( 1)号和 ( 3)号培养基上的出愈率可以看出
BA的效果优于 K T。 BA2 mg /L+ N AA2 mg /L是诱导零余子愈伤组织形成的一种理想
7755期 李明军等: 怀山药零余子愈伤组织诱导及植株再生的研究
的激素组合。
3. 2　植物激素对愈伤组织分化的影响
愈伤组织在脱分化培养基上可以一次性成苗 ,但成苗率较低 ,最高也仅有 33. 3% (表
1) ,且仅形成单芽 ,而将愈伤组织转移到合适的分化培养基上可以显著提高成苗率 ,在
BA1 mg /L+ N AA1 mg /L培养基上成苗率可以达到 63. 6% (表 2) ,而且多形成丛生芽。
从表 2可知 ,苗的形成必须有植物激素的存在 ,否则愈伤组织不发生分化。在一定的
生长素浓度范围内 ,随着 BA浓度的增大 ,愈伤组织的分化率也增大 ,如 NAA为
0. 1 mg /L时 , BA2 mg /L比 BA1 mg /L的分化率高 16. 6% ; N AA为 0. 5 mg /L时 , BA2
mg /L比 BA1 mg /L的分化率高 26. 6%。 但 BA浓度增大到一定值时分化率则减小 ,如
NAA为 0. 1 mg /L时 , BA4 mg /L比 BA2 mg /L的分化率低 20% ; N AA为 0. 5 mg /L时 ,
BA4 mg /L比 BA2 mg /L的分化率低 21. 4% ,这说明高浓度的 BA不利于愈伤组织的分
化 ,在细胞分裂素浓度较低时 ,随着 NAA浓度的增大分化率也随之增大 ,如 BA为 1 mg /
L时 , N AA为 0. 1 mg /L , 0. 5 mg /L和 1 mg /L的分化率分别为 16. 7%、 23. 4%和 63.
6% 。 但当 BA浓度较高时 ,最高的分化率则要求合适的 NAA浓度 ,如 BA2 mg /L或 4
mg /L,在最高分化率时 NAA的最适浓度是 0. 5 mg /L,如果 NAA浓度高于或低于 0. 5
mg /L,则分化率减少。
3. 3　植物激素对再生植株生根和壮苗的影响
PP333(多效唑 )是人工合成的一种生长延缓剂 ,它能使茎叶生长延缓 ,叶色浓绿 ,分
蘖或分枝增多 ,尤其是对根系的生长有显著促进作用 ,使根系发达 ,生根快、粗、多 [8, 9 ]。 我
们的实验结果也证实了这一点 ,添加 PP333后不仅能够使根早生快发、粗壮而发达 ,而且
还能使地上部分生长健壮 ,叶色浓绿 ,茎较粗 ,产生更多的芽 ,从而达到了培育健壮怀山药
试管苗的目的 ,并使移栽后的试管苗具有较高的成活率和很快适应外界环境的能力。
3. 4　零余子高频率再生体系的建立为怀山药品种改良或新品种的选育奠定了基础
怀山药是一种利用根茎或珠芽进行营养繁殖的作物 ,利用传统的育种方法培育高产
优质的怀山药时间较长并且难以奏效 ,而利用组织培养方法结合基因工程技术是进行品
种改良和新品种选育的一种有效方法 ,但这一方法能否成功地应用 ,则首先取决于能否成
功地建立起适合于基因转化的植株再生体系。本文通过零余子培养诱导愈伤组织 ,建立了
怀山药的高频率的植株再生体系 ,为进一步利用细胞工程和基因转化系统进行品种改良
或新品种的选育提供了可能的途径。
参考文献:
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图版说明:
图版Ⅰ 　 1～ 2.在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织 ( 10 d)和分化的苗 ( 40 d) ; 3.在愈伤组织分化培养基上形成
大量的再生植株 ( 30 d) ; 4.在生根培养基上再生植株生根 ( 20 d) ; 5～ 6.移入沙 ( 15 d)和大田 ( 40 d)中成活的再生植
株 ,生长健壮。
Explanation of plate
PlateⅠ　 Figs. 1～ 2. Formation of bulbi l calli ( 10 d) and regen erated plan tlet s ( 40 d ) on th e callus induction medium;
Fig. 3. A larg e number of plan tlet s w ere regenerated w h en cal li w ere subcul tured on di fferen tiation medium; Fig. 4.
Rooting of regenerated plant lets on the rooting medium; Figs. 5～ 6. Af ter plant lets t ransplan ted in th e s and ( 15 d) and
field ( 40 d ) , th ey grew robus tly.
7775期 李明军等: 怀山药零余子愈伤组织诱导及植株再生的研究
李明军等:怀山药零余子愈伤组织诱导及植株再生的研究 图版Ⅰ
LI Ming-jun et al .: Study on the callus induction and plantlet regeneration f rom the bul-
bil o f Dioscorea opposita Pla teⅠ
See explanation at the end of tex t