全 文 ：中草药 第 卷第 期 年 月 · ·
· 制剂与质量
·
一环糊精键合固定相分离纯化银杏叶提取物和银杏黄酮
邓 利 ‘ , 孙 猛 , , 谭天伟‘ , 王 芳‘ ,
北京化工大学生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室 , 北京
, ,
摘 要 目的 考察以 卜环糊精 卜 为键合固定相的色谱柱分离纯化银杏叶提取物和银杏黄酮的影响因素 。 方
法 以色谱图中色谱峰的个数和 目标物为离度为指标 , 采用低压液相色谱技术对银杏叶提取物和银杏黄酮进行分
离纯化 。 同时 比较固定相 、 流动相 、 缓冲液 、 值 、 洗脱速度和上样体积对分离结果 的影响 。 结果 抓代环氧丙烷偶
联 卜 一 键合相能够较好地分离银杏叶提取物和银杏黄酮 , 优于葡聚糖凝胶 即 一
。 结
论 卜环糊精键合固定相适用于银杏叶提取物和银杏黄酮的分离与纯化
。
关键词 卜环糊精键合固定相 银杏叶提取物 银杏黄酮 分离纯化
中图分类号
,
文献标识码 文章编号 一 一 一
一 一
‘ , , , 一 ‘ , ’ ,
·
, ,
, , , , ,
各 件
一 即 友
,
, , , , ,
件 一
一
各 尽一 一
银杏为我国特有 的珍稀植物 , 银杏 叶制剂在临
床上广泛用于治疗心脑血管疾病 。 目前认为银杏的
活性部位为黄酮类化合物和内醋类化合物 。 黄酮类
化合物传统的分离纯化方法包括各种吸附色谱或分
配色谱 、 葡聚糖凝胶分子筛 、 梯度 萃取 , 但这些
方法分离过程复杂 、效率低 。 一环糊精 各 具有特
殊分子结构 , 锥形的环状空穴 , 锥体外侧边框连有大
量轻基而呈亲水性 , 内部空腔处于 基团的屏蔽
下而呈疏水性 。 当客体分子进人 一 的空穴 , 就
形成具有特效亲和作用的包合配合物 。 件 的硅胶
键合固定相 已经应用于 分析中 , 特别是分离
对映异构体方面 , 〕。 琼脂糖凝胶具有大孔性 、 经基
多 、 刚性好 、 特异性吸附少 、 理化性质稳定等特点 , 广
泛应用于亲和色谱介质的合成 。 本实验采用交联琼
脂糖凝胶为基体 , 卜 为配基 , 合成新型 各环糊精
键合相 , 采用低压液相色谱技术 , 以银杏叶提取物为
对象 , 分离纯化银杏叶黄酮和黄酮昔元 , 并对黄酮昔
元的最佳分离条件进行 了考察 。
仪器与材料
一 恒流泵 北京卫星制造厂 , 紫
外 检测 器 北京新技术应 用研究 所 , 记录仪
四川仪表四厂 , 七通进样器 瑞典法玛西亚惠赠 ,
自动馏份收集器 , 数据工作站 自编 , 岛津
高效液相色谱仪 。
鉴繁籍 蓄翼猫学基金资助项 目 。 匕京 自然科学基金博士点基金资助项 目 。 教育部优秀青年教学科技奖励
作者简介 蠢金薪恐黔稽黯髯敷
, 博士 , 副教授 , 年 , 。月一 。年 。月在丹麦技术大学作访问学者 , 主要从事生物分离
和生物催化方向的研究 , 在国内外核心刊物发表论文近 篇 , 和 收录 篇 。
一
· 中草药 第 卷第 期 年 月
一 键合 固定相 由瑞典 大学
教授合成提供
。
合成方法如下 第一步为凝胶 的活
化 , 先 用蒸馏 水洗涤 , 然后将蒸馏
水 、 和 溶液加人反应瓶
中 , 控温搅拌反应 , 然后 向反应瓶中缓慢流加环氧氯
丙烷 , 并加人醋酸调节 , 最后用蒸馏水洗涤凝胶 ,
得到环氧氯丙烷活化的 。 第二步为
偶联 件 , 将蒸馏水
、
活化 的凝胶 和 、
加人到反应瓶 中均匀搅拌 , 控温进行偶联反
应 , 并用醋酸调节 。反应结束后 , 用少量蒸馏水洗
涤不溶反应物 。
色谱填充柱 ①号柱 , 自己填
充 , 用氯代环氧丙烷偶联 份 的
②号柱
·
, 自己填充 ,
用双环氧化合物偶联 一 的
·
③号柱 , 自己填充 , 日一
偶 联到环氧活化 的 ④
号柱 一 , 自己填充
柱 ⑤号柱 。 。 , 商品
分析柱 。 试剂均为分析纯 , 银杏叶提取物 由中国蓝
田集团提供 , 棚皮素对照品 由中国药 品生物制 品检
定所提供 。
方法与结果
溶液 的制备 取银杏 叶提取物适 量溶于
乙醇溶液 , 作为样 品 。 精密称取银杏叶提取物
, 加 甲醇一 盐酸 溶液 , 水浴加热
回流 , 迅速冷却至室温 , 移至 量瓶 中 ,
加 甲醇稀释至刻度 , 作为样品 。
定性定量分析方法 的确立 样 品 主要成分
是银杏黄酮醇类化合物 , 是 种昔元 懈皮素 、 山奈
酚 、 异 鼠李黄素 为基本骨架的没食子酞基糖昔 , 其
成分十分复杂 , 无法定性所得的峰 , 实验 中主要观察
各个分离谱图中峰的个数的多少 样品 的主要成
分为懈皮素 、 山奈酚 、 异 鼠李素 种昔元闭 , 成分较
为简单 , 可以通过分步收集各个峰进行定性定量 。见
图 。
黄酮昔元 的分离 采用 全充 环管 进
样 , 常温下 甲醇 一 。 磷酸水溶液
洗脱 , 检测波长为 , 观察出峰情况 , 分步收集
各 目标物 。
分析色谱条件 柱
·
,
北京北分厂提供 流动相 甲醇一 磷酸
检测 波长 体积 流量 柱 温
℃ 。
时间
一懈皮素 一 山奈酚 一异鼠李素
一 一 一
图 银杏叶提取物 和银杏黄酮 的 色谱图
·
不同固定相对银杏黄酮的分离 银杏叶提取物
中的主要成分是糖昔和双黄酮类化合物 , 实验中以
分离谱图峰的个数评价介质分离效果 。 ①号柱进样
, 柱压 , 乙醇 洗脱 ④号
柱进样 , 柱压 , 甲醇 洗脱 ⑤
号柱进样 , 柱压 , 乙醇
洗脱 。 见图 。 可见 ①、 ④、 ⑤号柱能较好地分离银杏
黄酮 , 其中 ①号柱分离效果最高 。 ④号柱
一 固定相 分离机制 主要是分子筛作用 , ①号
柱 环糊精键合琼脂糖凝胶固定相 分离机制除了分
子筛效应外 , 还具有环糊精的空腔包合作用 。 因此
的环糊精凝胶 固定相 ①号柱 的分离效果 比
的 一 固定相 ④号柱 分离效果要
好的多 。 为基体的环糊精键合固定相
③号柱 的分离效果明显差于 为基
体 的环糊精 固定相 ①号柱 , 可能与 印
与 空间结构有关 。 ①号柱比 ②号柱
的分离效果好 , 可能是 ①号柱上环糊精的键合量多 。
少咖七 一厂八抓弧
一
时间
一 ①号柱 一 ④号柱 一 ⑤号柱
一 一 一
图 不 同固定相对银杳黄酮分离的影响
不同流动相对银杏黄酮的分离纯化 选用亲水
性较强的乙醇和 甲醇为流动相对 ①号柱分离银杏叶
提取物中银杏黄酮的条件进行 了优化 。 进样 ,
柱压 时 , 考察 、 、 乙醇和 、
、 甲醇的洗脱效果 , 见图 。 结果表明 , 极性
较弱 的乙 醇 比甲醇 的分离效果要好 , 乙醇分离
效果最好
。 除溶剂极性强弱差别外 , 另一个原因可能
是 , 对于环糊精空腔结构来说 , 乙醇比甲醇具有更强
的置换洗脱能力
。
中草药 第 卷第 期 年 月
一一一一一一 吐 ,
时间 刀
一 乙醇 一 乙醇 一 写乙醇 仆 写甲醇
一 一 一 一
图 不 同流动相对银杏黄酮的分离
·
不 同固定相对银杏黄酮昔元的分离 考察了
种 固定相填充柱对样 品 的分离 , 其 中 ①、 ②号柱
进样 , 柱压 , 甲醇 洗脱
⑤号柱柱压 , 甲醇 一 ,
洗脱 。 见图 。 结果表明 ①、 ②号柱能将
种物质分离 , 其中 ①号柱分离效果最佳 。 这 种黄
酮昔元的相对分子质量差别很小 , 主要 的差异在于
酚经基和经甲基的个数不 同 。 因此黄酮昔元的分离
主要取决于它们与分离介质和流动相之间的吸附能
力和氢键强弱等亲和作用 。从分离结果看 , 环糊精固
定相 的特殊结构对于分离该体系是特别有效的 , ①
号柱 比 ②号柱有更多 的环糊精键合量 , 因此 ①号柱
有更好 的分离效果 。 比
的刚性好 , 而且是琼脂糖的二次交联后的产物更
有利于与环糊精交联 , 交联后 的固定相具有更好的
空 间结构 , 因此具有相 同交联度的 “
固定相 ①号柱 比 固定相 ③号柱
分离效果更好 。
环糊精的空腔 内只有氢原子和糖昔氧原子 , 是
非极性的 , 具有疏水性 。 种昔元进人环糊精非极性
空腔后 , 酚经基越多 , 吸附越弱 。 预测的出峰顺序为
时间
一栅皮素 一山奈酚 一异 鼠李素
一 一 一
一 ①号柱 一 ②号柱 一 ⑤号柱
一 一 一
图 不 同固定相对银杏黄酮普元分离的影响
一
懈皮素 、 山奈酚和异 鼠李素 。 分步收集 个主峰 , 采
用 法定性分析 , 各物质的出峰顺序与预测顺
序吻合
。
对分步收集 的样品进行定量分析 , 结果表
明 , 面积归一化计算 的山奈 酚纯度 为 , 异 鼠李
素纯度为 , 外标法计算棚皮素纯度为 。
不同流动相对银杏黄酮昔元分离的影响 ①号
柱进样 , 柱压 , 使用 乙醇 、 甲醇 、 乙睛 、 丙
酮以及它们的水溶液进行分离 , 发现只有 甲醇一水体
系能够较好地将 种昔元分离 , 见图 。
缓冲液对银杏黄酮昔元分离的影响 实验中发
时间 】
一 乙醇一水 一 甲醇一水 一 乙睛 一丙酮 一 甲醇一水
一 一 一 一 一 一 一 一
图
·
不同流动相对银杏黄酮普元的影响
中草药 第 卷第 期 年 月
现 甲醇一水 系统加人缓 冲盐使流动相 的 值得 以
控制 , 可 以抑制溶质的离子化 , 同时对缔合作用的影
响也较大 , 从而减少谱带拖尾 , 改善峰型 , 能够大大
改善分离结果 。 结果见图 。 可见 , 甲醇一 。
醋酸钠缓冲液 体系是最佳流动相 。
表 不 同 对银杏黄酮普元分离效能的影响
火一
一懈皮素 一 山奈酚 一异 鼠李素
一 一 一
一 甲醇一水 一 甲醇 一 醋酸钠
一 甲醉 一 。 ,
一 一 一 一 ,
一 一
图 缓冲液对银杏黄酮普元分离的影响
值对银杏黄酮昔元分离的影 响 ①号柱进
样 , 柱压 , 使用 作为缓
冲液 , 甲醇 一 为流动相 , 用稀 调节
, 结果见表 。 可知 一 是最佳的 。
洗脱速度 的影 响 考察 了在 ①号柱上进样
, 柱压 。 , 不 同洗脱速度对懈皮素和 山奈 酚
分离效果的影响 , 结果见表 。 可见 是
、 分别表示拱皮素与山奈酚的保留因子和分离度 ,
、
分
别表示彬皮素与异鼠李素的保留因子和分离度 。 表 同
, ,
·
表 洗脱速度对分离效能的影晌
洗脱速度 · 一 ,
。
。
最佳的洗脱速度 。
上样量对分离 的影响 使用 ①号柱 、 以 甲醇
。 , 洗脱不 同上样量 的银杏
黄酮昔元 , 分离结果见图 。 可见上样量增大 , 分离
度不断减小 , 当上样量达到
·
样品
固定相 时 , 榭皮素仍然能得到较好的分离 ,
收率达 以上 , 纯度在 以上 。
︸﹂
、一
、苍、﹂
、一
川刀一︸
。
时间
一 一 一 一
图 负载 对分离的影响
色谱柱的寿命和再生 当累计上样量达到 分离银杏黄酮的最佳流动相为 乙醇 , 分离
时 , 色谱柱上端发黄 , 分离能力下降 , 需要再生 。 银杏黄酮昔元的最佳流动相为 甲醇 , 这与 目的
实验中使用丙酮 、 乙睛 、 甲醇一水
、 乙醇一水 、 溶 产物的分离机制有关
。 银杏黄酮的分离主要依靠分
液洗脱 。 结果表明 , 分离银杏黄酮昔元时 , 需用 乙醇 子筛效应和环糊精 的空腔包合作用 , 待分离组份间
一水体 系洗脱 ①号柱 , 分离银杏黄酮 时 , 需 用 具有较大的相对分子质量差异 , 弱极性 的乙醇对它
溶液洗脱 ①号色谱柱
。 到 目前为止 , 们的分离更加有效 。 银杏黄酮昔元的分离主要依靠
①号色谱柱的累计上样量 已超过 银杏黄酮 环糊精空腔对 目的产物的吸附机制 , 较强极性 的甲
样品 固定相 。 醇对于环糊精空腔内作用力具有更好的置换作用 。
讨论 使用 自件环糊精键合固定相对银杏黄酮 黄酮
中草药 第 卷第 期 年 月 ·
昔和昔元 进行分离 , 色谱柱能较好地达到分
离效果 。 乙醇 一水体系 乙醇 适用于银杏黄酮的
分离纯化 , 甲醇体系 甲醇一 。 , 适用 于
银杏黄酮昔元的分离 。 懈皮素和山奈酚的最佳分离
度 为 , 山奈 酚 和 异 鼠李 黄素 的最 佳分 离 度 为
, 昔元分离的负荷量可以达到 。 懈皮素的
收率可达到 以上 , 纯度在 以上 山奈酚和
异 鼠李素的纯度均可达到 以上 。 色谱柱通过反
复再生其寿命在 固定相以上 。 表明该固
定相具有一定应用潜力 。
〔 〕 ,
。 〕
二 , 延安大学学报 , , 一
〔 , 卜
〔〕 。 , , 一
〕 , , 一 ,
卜
一
〔〕 口 人 ,
, 一
免疫磁性捕获 法检测甘草中甘草蛋 白的研究
曹 宇 , 曹学琳 , 田 旺 , 杨文博 , 白 钢
南开大学生命科学学院 , 天津
摘 要 目的 制备甘草蛋白免疫磁性微球 , 并建立快速 、精确的免疫磁性捕获 法检测甘草蛋 白 。 方法 采
用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球 , 并以兔抗甘草蛋白 沙 抗体致敏 , 制备特异性捕获甘草特征蛋 白的免疫磁
性微球 。 以生物素标记抗体为示踪抗体 , 结合辣根过氧化物酶标亲和素建立 检测系统 , 用于甘草药材和含
甘草中成药中甘草蛋白的分析 。 结果 利用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋 白抗原检测 , 检测灵敏度达到
新方法
。 结论 免疫磁性捕获 检测技术方便 、 快速
、
准确 , 为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一种
关挂词 甘草 甘草蛋白 免疫磁性微球 免疫磁性捕获 技术
中圈分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
, 一 , , 一 ,
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一 卿犷犷人
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一
免 疫 磁 性 微 球 。
, 是近年来兴起 的一类新型磁性活
性材料 , 是连有抗体或抗原的磁性微球 , 通过表面的
抗体或抗原特异性地与靶物质结合 , 从而赋予其磁
响应性 , 在特定磁场 的作用下 , 这些结合 了
的细胞和分子可 以发生定 向移动 , 从而实现其免疫
收稿 日期 一 一
鑫金项 目 天津市 自然科学重点基金资助项 目 。。 ,教育部回国留学人员启动基金 〔 。。。 号 〕
作者简介 曹 宇 一 , 男 , 辽宁铁岭人 , 硕士研究生 , 主要从事免疫磁性微球的研究 。
, 通讯作者 一