全 文 ：[ 1]　Liu G J. Ep hedr a (麻黄) [ M ] . Beijing: Chinese T radit ional
Medicine Pub lish ing Hou se, 2001.
[ 2]　Zh on g L. Determinat ion an d analysis on f ight ing a droug ht of
Ep hed ra p rz ew al ski i [ J] . Qinghai Op ratacu ltu re ( 青海草
业) , 2000 ( 1) : 20-21.
[ 3]　Departm ent of Biology in Nank ai U nivers ity. Basic M icrobiol-
ogy (基础微生物学) [ M ] . Tianjin : Tianjin Educat ional Pub-
lish ing Hou se, 1975.
[ 4]　Meng S D. Funct ion of phytohormone from r hizosph ere soil
micr oorganisms on w heat g rowth [ J] . P lant P hysiol (植物生
理学通讯) , 1998 ( 6) : 427.
[ 5]　Al-Achi B. J et al. Compet it ive coloniz at ion betw een P seu-
d omonas species in s teril e soil [ J] . Curr microbiology , 1991,
23: 97-104.
[ 6]　N anjing In st itute of Pedology. Meth od of S tudy about S oil
M icrobiology ( 土壤微生物研究法 ) [ M ] . Bei jing: Science
Press , 1985.
[ 7]　L iu L S . S tudy on ch aracter ist ic of Gent iana macr op hylla
s eed ger mination [ J] . C hin T rad it H erb Dr ugs (中草药) ,
2002, 33( 3) : 268.
[ 8]　Bashan Y. Enh anced grow th of w heat and soybean plants in-
ocu lated w ith A z osp iri llum br asi lense is not n ecess ar ily due to
general enhancement of mineral uptake [ J ] . App l Env ir on
Microbio, 1990: 769-775.
新疆紫草无性繁殖体系的建立
计巧灵

(新疆大学生命科学与技术学院, 新疆 乌鲁木齐　830046)
摘　要: 目的　为了促进新疆紫草大面积人工栽培, 缓解自然资源匮乏的现状,通过组织培养技术建立了新疆紫草
的无性繁殖体系。方法　诱导新疆紫草多种外植体脱分化均已成功,胚状体扩增后萌发出大量的试管苗;愈伤组织
扩增后诱导出大量的不定芽, 不定芽经诱导生根后,得大量的试管苗,试管苗土栽成活。结果　外植体脱分化期间,
2, 4-D不可缺少, KT 的作用优于 BA ; 嫩芽切段脱分化最快,愈伤组织质量最好; 降低 2, 4-D浓度有利于愈伤组织
扩增和再分化; 一定浓度 KT 或 BA 都可诱导出不定芽, 前者还有利于球形胚的形成; 球形胚培养初期,培养基中加
入适量激素能使球形胚大量增殖, 并很快发育;适当的昼夜温差( 10 ℃～28 ℃)和自然光照有利于壮苗的形成和移
栽成活。在移栽的 236株试管苗中, 31 株土培成活, 成活率达 13. 2%。结论　通过组织培养方法建立的新疆紫草无
性繁殖体系稳定、可用。
关键词: 新疆紫草;组织培养; 再生植株;无性繁殖系
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 1041 04
Establishment of asexual multiplication system of Arnebia euchroma
JI Qiao-ling
( Institute o f L ife Science and Technolog y, Xinjiang Univ ersity, U rumuqi 830046, China)
Abstract: Object　In order to promote the art ificial cult ivation o f A rnebia euchr oma ( Royle) Johnst . ,
and save the w ild herb from reliev ing the lack of resour ces, the asexual mul tiplicat ion system o f A . euchr o-
ma was established by t issue culture technique. Methods　Dedif ferent iat ion in many kinds of explants of
A . euchroma by inducement succeeded. Af ter the embr yos w er e mult iplied, there w ere a lot of g erm inated
t ransplants in media . After callus w ere mult iplied, many advent itious buds had formed in the media, then
they w ere root ing; the t ransplants formed by inducement and the plants survived af ter being cultured in
so il . Results　During the dedifferent iation, 2, 4-D was essent ial, the ef fect of KT w as bet ter than BA.
The shoot sect ions w ere dedif ferent iated in the most rapid w ay among the explants. The callus fr om them
wer e in ver y good quality . It is o f benefit to the callus mult iplicat ion and r ediffer ent iat ion after reducing
the concentration of 2, 4-D. Both KT and BA can induce advent it ious buds, KT w as also suitable for the
fo rmat ion of g lobular -shaped embr yos. In init ial period o f sphere embryos culture, it w as necessary to add
the plant grow th regulators in media for mul tiplying sphere embryos and promot ing their development .
·1041·中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 34 卷第 11 期 2003年 11 月

收稿日期: 2003-01-13基金项目:国家自然科学基金资助项目( 38960025)作者简介:计巧灵( 1956- ) ,女,新疆乌什县人,副教授,理学士, 1982年毕业于新疆大学生物系,至今一直在新疆大学生命科学与技术学院任教,主要从事细胞生物学、细胞工程、电镜技术方面的教学与科研工作; 1993年主持完成了国家自然科学基金项目:新疆紫草组织和细胞培养及其有效成分提取(项目号 38960025) ,后主要参加完成了多项有关药用植物快繁、移植、有效成分分离提取等科研项目。　Tel: ( 0991) 8581529　E-mail: wangji@x j. cninfo. net
Proper temperature difference betw een day and night ( 10 ℃—28℃) and natural light w ere helpful fo r the
fo rmat ion of st rong sprouts and surv ival of t ransplants. The survival r ate w as 13. 2% w ith 31 plant lets
survived among 236 transplants cultured in so il . Conclusion　The asexual mult iplicat ion system of A . eu-
chr oma establ ished through t issue culture is stable and available.
Key words: A rnebia euchr oma ( Roy le) Johnst . ; t issue culture; regenerated plant let ; asexual mult ipli-
cat ion sy stem
　　紫草根中的萘醌类混合物(紫草素)不仅具有抗
菌消炎、解毒透疹、治疗烧伤的作用,而且具有抗肿
瘤细胞的作用[ 1～3 ]。中药紫草中以新疆紫草质量较
好[ 1, 4, 5]。它主要分布于新疆境内。但近十几年来,随
着紫草市价的升高,掠夺式的乱挖滥采屡禁不止,不
仅严重地破坏了自然植被,而且使新疆紫草资源日
益匮乏。20世纪 80年代日本开始利用细胞悬浮培
养技术生产紫草素。20世纪90年代以来, 国内学者
对此也进行了大量的研究,如以氯化铜 [ 6]、表面活性
剂聚山梨酯 20、多糖、
-射线[ 7]、油菜素内酯 [ 8]、真菌
诱导物等处理,可以提高新疆紫草或滇紫草悬浮培
养细胞中紫草素含量, 用紫草细胞固定化培养法建
立了基质消耗与紫草素合成量的动力学模型[ 9] ,用
豆蔻酸甲酯、正十六烷离析 [ 10] , 树脂 XAD-2、R-
A [ 11]、聚氨酯泡沫吸附等方法可提高紫草素的提取
率等,工业发酵生产紫草素的技术日趋成熟,但生产
成本偏高。
新疆有很多高海拔的砾石山地都适宜于新疆紫
草的生长, 但近年人为掠夺式地挖掘, 资源日渐枯
竭,加之新疆紫草以种子繁殖, 生长五年才开花、结
果,自然繁殖缓慢,给人工种子繁殖新疆紫草带来了
较大的困难。另外,以种子繁殖生产周期长,采用常
规育种方式进行品种改良周期很长。而利用组培无
性快繁技术不仅能提供大量的栽培苗,缩短栽培周
期,还能进行周期较短的品种改良。为了充分利用新
疆较大面积的、未被利用的高海拔山地优越的光、温
等自然条件, 人工大面积种植新疆紫草,合理而持续
地利用自然资源, 使环境改善与经济效益同步发展,
建立新疆紫草无性快繁体系就显得很有必要,而且
很有现实意义。本实验在以前工作基础上[ 12, 13]就新
疆紫草无性繁殖系的建立进行了研究。
1　材料与方法
1. 1　材料: 实验用植物采自新疆伊犁地区海拔
2 300 m左右的高山砾石坡,经新疆大学赵建成教授
鉴 定 为 新 疆 紫 草 A rnebia euchroma ( Royle )
Johnst . 。
1. 2　组织培养方法:组织和细胞培养时, 取自然生
长的新疆紫草的白色嫩芽和幼叶(叶长 0. 5 cm ) , 无
菌水洗数次后,转入 0. 1%升汞溶液(加入聚山梨酯
80 2 滴)中灭菌 5 min,再以无菌水反复洗涤, 切除
原伤口后,接种到不同的诱导培养基上,诱导其脱分
化。另取新疆紫草种子去壳,经 5%次氯酸钠灭菌处
理 2 min,以无菌水洗涤数次后, 接种在 1/ 2 M S(无
激素)培养基上, 27 ℃下培养 6～7 d, 待种胚萌发长
高近 1 cm 时,切下子叶和胚轴段,接种到不同的诱
导培养基上,诱导其脱分化。另取部分子叶块直接接
种到再分化培养基上,诱导其分化不定芽。
愈伤组织经 4个月继代扩增后大部分转入再分
化固体培养基上,诱导其再分化,结合石蜡切片和形
态观察检查再分化情况。少部分松散愈伤组织经过
悬浮,过 100目筛后, 取滤过液的沉淀, 进行细胞悬
浮培养,诱导其胚性化,并定期取样在倒置显微镜下
观察,了解细胞的分裂、分化情况。分化出的芽生长
到一定高度时切离,经扶壮, 芽高 3 cm 以上时诱导
生根,形成试管苗。经悬浮培养形成的球形胚转入固
体培养基, 使其发育为各期胚状体, 进而发育成苗。
试管苗经炼苗、移栽,土培成活。
诱导新疆紫草外植体脱分化的培养基列于表 1
中, 每种激素组合重复 4～5次;再分化培养基见表
2,每种不同的培养基重复 4次; 芽扶壮以 LS 为基
本培养基,附加 NAA 0. 3 mg / L+ BA 0. 4, 0. 6 mg /
L ; 生根培养基为 LS+ IBA 2. 0 mg / L+ 活性碳 200
mg/ L。固体培养基均以 0. 7%琼脂固化,含3%蔗糖
(生根培养基减半) , pH 5. 8～6. 0,置于 22 ℃～28
℃下培养(芽扶壮和诱导不定芽生根阶段,部分芽放
在昼夜温差 10 ℃～28 ℃下培养) , 脱分化、再分化
诱导初期均在暗处进行, 其余过程在光照下进行, 培
养架上的光照度为 1 500～ 2 000 lx ,光照 14 h/ d。
细胞悬浮培养用 MSB+ IAA 0. 6 mg / L + KT 1. 0
mg/ L , 其中或加入Gln 100 mg / L 或Phe 100 mg/ L
或0. 1%琼脂, 置T HZ—03型恒温振荡器上( 27℃,
80 r / min) ,黑暗中培养,每隔 5 d换液一次。
1. 3　显微制片法:石蜡切片时,用纳瓦兴固定液Ⅲ
固定材料,按常规脱水、包埋、制片,切片厚 5
m, 以
·1042· 中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 34 卷第 11 期 2003年 11 月
番红-固绿对染,用 BH 型 01ympus摄影显微镜观察
并拍照。
表 1　诱导新疆紫草外植体脱分化的培养基
Table 1　Culture media induced didiff erentiation
for explants of A. euchroma
培养基编号 NAA
/ (mg·L - 1)
2, 4-D
/ ( mg·L- 1)
BA
/ (mg·L - 1)
KT
/ ( mg·L- 1)
1 0. 4 0. 2 0. 2
2 0. 4 0. 2 0. 4
3 0. 4 0. 2 0. 6
4 0. 4 0. 2 0. 8
5 0. 4 0. 2 1. 0
6 0. 4 0. 2 0. 5
7 0. 4 0. 2 1. 0
8 0. 4 0. 2 1. 5
9 0. 4 0. 2 2. 0
　　以上均以 MSB为基本培养基
　　All above are wit h MSB as basic culture media
表 2　诱导新疆紫草愈伤组织再分化的培养基
Table 2　Culture media induced callus redif ferentiation
of A. euchroma
培养基编号 NAA
/ (mg·L - 1)
BA
/ (mg·L - 1)
KT
/ (mg·L - 1)
10 0. 4 1. 0
11 0. 4 1. 2
12 0. 4 1. 5
13 0. 4 2. 0
14 0. 4 2. 5
15 0. 4 1. 0
16 0. 4 1. 2
17 0. 4 1. 5
18 0. 4 2. 0
19 0. 4 2. 5
20 0. 4 1. 0
21 0. 4 1. 2
22 0. 4 1. 5
23 0. 4 2. 0
24 0. 4 2. 5
　　10～14 号、15～19号、20～24号分别以 MSB, MS, L S为基本培养基
　　No . 10- 14, 15- 19 and 20- 24 wit h M SB, M S, L S as basic culture me-
dia respectively
2　结果与分析
2. 1　外植体的脱分化:不同来源的外植体在诱导脱
分化培养基上均能产生愈伤组织, 但愈伤组织产生
的快慢及质地有很大差异,嫩芽切段在 7号培养基
上产生愈伤组织最快, 产量高, 愈伤组织乳白色、稍
疏松; 其次是胚轴段在 8号培养基产生愈伤组织较
快,产量较高,愈伤组织质地、色泽较好。在含BA 的
培养基上愈伤组织生长也较快,但疏松、透明呈水浸
状。在愈伤组织继代培养中如果仍用原培养基,愈伤
组织生长快,但较透明、疏松, 若将 2, 4-D 降至 0. 1
mg/ L , 这样经过 4～5次继代,可得到大量高质量的
愈伤组织。在继代培养过程中,有些乳白色的愈伤组
织可逐渐变红(产生了紫草素) ,因而整块愈伤组织
半边红、半边白,发红的愈伤组织扩增很慢,在转瓶
时将其切除有利于乳白色愈伤组织的生长。
2. 2　愈伤组织的再分化:将继代产生的愈伤组织大
部分转入再分化培养基上, 经 3个月的培养, 在 24
号、21号培养基上可看到大量的不定芽产生,起初有
些愈伤组织团块表面变得光滑、明亮,逐渐看到表面
有许多小的瘤状突起, 最后形成了芽丛。在有 KT 的
培养基上有些愈伤组织逐渐产生了许多谷粒状的小
颗粒堆,石蜡切片观察发现,此种小颗粒是许多胚状
体。幼叶在 12号培养基上能直接产生不定芽丛,不定
芽起源于伤口处,先形成少量结构紧密的愈伤组织,
然后在隆起处产生多个小瘤状突起,进而发育为不定
芽。待芽丛长至 1 cm 高,芽丛中的芽一个个清晰可见
时,将各芽切离,转入扶壮培养基上培养。不定芽的切
离不能太早,太早会因看不清芽与芽的分界而伤及不
定芽, 致使部分芽呈畸形, 芽数量减少或再分化时间
延迟。细胞悬浮培养过程中,定期观察发现,加入 Gln
100 mg / L 或加入 0. 1%琼脂均能促进细胞分裂, 加
入L-Phe 100 mg/ L 对促进细胞分裂作用不明显。待
产生大量的球形胚后,转入固体培养基上培养,球形
胚在固体培养基上培养初期,培养基中仍需加入适量
激素, 我们采用 MSB+ KT 0. 5 mg / L + IAA 0. 3
mg/ L 培养基,能使球形胚大量增殖, 并很快发育为
各期胚状体。新疆紫草胚状体形态与合子胚相似,经
历球形、心形、鱼雷形、子叶形各时期。
2. 3　不定芽扶壮、生根及试管苗移栽: 切离后的不
定芽在扶壮过程中, 用 BA 0. 6 mg / L 较合适, 但温
度和光照是两个很重要的因素。在恒温、恒定光照强
度的培养架上, 芽的生长较快,但叶片窄长、新绿色,
显示出体质较弱。若将接有切离芽的培养瓶放在玻
璃温室中培养, 情况就好得多, 温室温度昼夜在 10
℃～28 ℃波动, 自然光照强度比培养架上强很多,
在这种条件下, 芽的生长虽然稍慢,但长出的叶片比
较宽、厚, 呈浓绿色, 显示出个体的强壮,玻璃温室中
这种光、温条件与新疆紫草自然生长环境中的光、温
条件较接近,以这种方式扶壮的芽有较强的生命力。
扶壮后的芽长高至 3 cm 以上时就可以诱导生根, 在
·1043·中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 34 卷第 11 期 2003年 11 月
诱导生根过程中, 来自培养架上扶壮的芽生根慢,而
在玻璃温室扶壮的芽生根快,苗健壮。待试管苗根粗
达 2 mm 以上时, 经 5 d 的敞口炼苗后,洗净根部琼
脂,移入由灭菌蛭石填充的营养杯中, 盖上薄膜一
周,揭膜后培养一个月, 移入土壤填充的花盆中栽
培,一个月后统计成活率。在移栽的 236株试管苗
中, 31株土培成活, 成活率达 13. 2%。
3　讨论
在诱导新疆紫草多种外植体脱分化的多次探索
中发现, 0. 4 mg / L NAA 加 0. 2 mg/ L 2, 4-D 是个
较合适的生长激素浓度,配以 5 个 BA 的浓度梯度
和 4个 KT 的浓度梯度,实验表明,这几种激素浓度
的配比均能诱导出愈伤组织, 嫩芽切段在 MSB+
0. 4 mg / L NAA+ 0. 2 mg / L 2, 4-D+ 1. 0 mg / L KT
培养基上产生愈伤组织最快,产量和质量最好。胚轴
切段在 1. 5 mg / L KT 时(其他条件不变)也能产生
较高质量的愈伤组织。
新疆紫草嫩芽、胚轴段来源的愈伤组织,均可诱
导产生大量的不定芽。但在这之前的愈伤组织扩增
过程中, 激素水平须进行调整,尤其是降低 2, 4-D
浓度,不仅有利于愈伤组织扩增,且对后续诱导愈伤
组织的再分化也很有利。在再分化诱导过程中, 提高
细胞分裂素的浓度是关键, 2. 5 mg/ L KT 或 1. 0
mg / L BA 都有利于不定芽的分化, 前者还有利于球
形胚的形成。3种基本培养基使用结果表明, LS 培
养基就可以满足要求, 这有利于降低组培苗的成本。
从芽丛中切离不定芽, 应等到芽长至一个个分界明
显时再切离较好, 以免周围的芽受损。在芽的扶壮过
程中,适度增大昼夜温差和光照强度,虽然幼芽生长
稍慢, 但容易形成壮芽,而且对诱导生根有利,对试
管苗移栽成活也很有利。细胞悬浮培养能产生大量
的球形胚。球形胚在固体培养基上培养初期需要加
少量激素诱导,才能大量扩增并继续发育, 待长成鱼
雷后期胚和子叶胚时, 即使在没有激素的培养基上
也可以顺利萌发形成试管苗。
试管苗移栽成活率不高的原因可能是当时移栽
地的环境条件、气候条件不太适宜新疆紫草的生长
发育所致。自然界光照强度、温度和海拔高度有密切
的关系,在海拔高的阳坡上光照很强,但气温并不太
高,昼夜温差较大,是新疆紫草生长的合适环境。还
需对新疆紫草适宜的移栽环境和气候条件进行深入
的探讨。提高移栽成活率,使这种技术尽快地运用到
实际生产中去。
References:
[ 1]　Gao J H. Su rvey in th e resources , ch emist ry, pharmacology
and clinic f rom A rnebia euchroma [ J] . Chin T rad it H er b
Dr ugs (中草药) , 1986, 17( 6) : 28-31.
[ 2]　L u G R. T es t of the ant icancer ef fect of monomer s eparated
f rom sh ikonins [ J] . Chin J Integ rated T rad it Chin W est Med
(中国中西医结合杂志) , 1990, 10( 7) : 422-425.
[ 3]　Fan H X, Zhu W H . Tissue culture of A rnebia euchroma and
format ion of shikonin der ivat ives [ J] . Ac ta P harm Sin (药学
学报) , 1988, 23( 9) : 716-720.
[ 4]　L i Z L , Lian g G Y. Quality com paris on of three L ithosp er-
mum erythror hiz on [ J] . J T rad it Chin Med (中药通报) ,
1982 ( 2) : 9-10.
[ 5]　Fang D Q, Hou S S , Li X M. Progres s ab ou t shikonin f rom
cel l cul ture in L ith osp er mum erythr orhi z on [ J] . Chin Tr adi t
H e rb Drug s (中草药) , 1992, 23( 4) : 209-212.
[ 6]　Y e H C, Yin Z H, L i G F, e t al . Ef fect s of physical and
chem ical factors on callu s cultur e of A rnebia euchroma and
format ion of shikonin derivat ives [ J ] . A cta Bot S in (植物学
报) , 1991, 33( 12) : 927-931.
[ 7]　Zhang H, Cao R Q, Yang Y H. Inf luence of gamma-ray on
shikonin format ion in cultured cell of Onosma p aniculalum B.
F. [ J] . J P lant R esourc es Env ir on (植物资源与环境) , 1999,
8( 1) : 42-45.
[ 8]　Zh ang H, Xiang Y H, Yang Y H. Ex ploration of brass ino-
s teroids enhanced shik onin production f rom the cel l of Onos-
ma p aniculalum B. F. [ J ] . J N anj ing Univ- Nat S ci (南京
大学学报·自然科学版) , 1999, 35( 2) : 151-155.
[ 9]　Yuan L H, Luo X M, Ouyang P K. Inf luence of immobiliza-
t ion con dit ions on product ion of shikonin and its derivat ives
[ J ] . J N anj ing Univ Chem T ech ( 南京化工大学学报 ) ,
1999, 21( 2) : 44-48.
[10]　Kim D J. Enhan ced shikonin product ion f rom L ithospe rmum
ery throrhiz on b y in s ite ext ract ion an d calcium alginate immo-
bil izat ion [ J] . Biotechnol B ioeng, 1990, 36: 460-464.
[11]　S him onura K. S hikonin p roduct ion and secret ion by hairy
root cu ltures of L ithosp ermum ery thr orhi z on [ J] . P lant Cell
R ep ort , 1991, 10: 282-286.
[12]　J i Q L , Gou P, Wang W G. Study on th e callus induced f rom
segments of A rnebia euchroma ( Royle) Johnson [J ] . J X in-
j iang Univ—N at S ci (新疆大学学报·自然科学版) , 1992,
9( 4) : 96-100.
[13]　J i Q L, Wang W G, Li R J , et al. Ex plant t iss ue culture and
plant let regener at ion of A rnebia euchroma [ J] . J X inj iang
Univ- N at Sc i (新疆大学学报·自然科学版) , 1993, 10
( 3) : 91-94.
·1044· 中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 34 卷第 11 期 2003年 11 月