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Experimental study on protective and therapeutic effect of nourishing kidney and activating blood recipe on renal in terstitial fibrosis

补肾活血法组方中药防治肾间质纤维化的实验研究



全 文 :补肾活血法组方中药防治肾间质纤维化的实验研究
张勉之1, 段惠军1, 张大宁2Ξ
(11 河北医科大学, 河北 石家庄 050017; 21 天津市中医药研究院, 天津 300022)
摘 要: 目的 探讨依据补肾活血法组方中药对进展性肾间质纤维化的防治作用。方法 制备大鼠肾间质纤维化
模型, 将大鼠随机分为假手术组, 高、低剂量治疗组和模型组。观察肾间质病变的程度及角蛋白 (CK)、波形蛋白
(V im ) 和 Α2平滑肌肌动蛋白 (Α2SM A ) 在肾间质的表达情况。结果 治疗组肾间质损伤程度明显轻于模型组 (P <
0101) ; V im、Α2SM A 阳性细胞表达明显少于模型组, CK 表达明显多于模型组 (P < 0101)。结论 补肾活血法组方
中药使肌成纤维细胞的表达减少, 上皮细胞的表达增强, 说明其抑制并逆转了肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分
化, 阻止了肾间质纤维化的进程。
关键词: 补肾活血方; 肾间质纤维化; 角蛋白; 波形蛋白; Α2平滑肌肌动蛋白
中图分类号: R 28515   文献标识码: A    文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0302 03
Exper im en ta l study on protective and therapeutic effect of nour ish ing
k idney and activa ting blood rec ipe on rena l in terstit ia l f ibrosis
ZHAN G M ian2zh i1, DUAN H u i2jun1, ZHAN G D a2n ing2
(11H ebeiM edical U niversity, Sh ijiazhuang 050017, Ch ina; 2. T ian jin A cadem y
of T radit ional Ch inese M edicine, T ian jin 300022, Ch ina)
Key words: nou rish ing k idney and act iva t ing b lood recipe; renal in terst it ia l f ib ro sis; cytokera t in;
vim en t in; Α2smoo th m u scle act ion
  肾间质纤维化 ( renal in terst it ia l f ib ro sis,
R IF ) 是各种肾脏疾病发展的最终结果, 近年研究显
示肾间质病变与慢性肾衰竭关系较肾小球更为密
切[1, 2 ]。补肾活血法是张大宁于 1978 年首先提出的
中医理论和临床治疗大法[3 ]。本实验利用肾间质纤
维 化动物模型, 通过检测角蛋白 ( cytokera t in,
CK )、波形蛋白 (vim en t in, V im ) 和 Α2平滑肌肌动
蛋白 (Α2smoo th m u scle act ion, Α2SM A ) 等特异性
标志物的表达, 观察依据补肾活血法组方中药对肾
间质纤维化的防治作用。
1 材料
111 动物: 雄性W istar 大鼠, 清洁级, 体重 220~
286 g, 由河北省实验动物中心提供。
112 药物: 根据补肾活血法组方, 选取生黄芪、川
芎、赤芍、鳖甲、甘草等, 购自天津市药材公司, 并经
天津市中医药研究院鉴定。药材粉碎后, 于多功能提
取罐内乙醇热回流提取 2 次, 减压浓缩至稠膏 (相
对密度为 1135~ 1140, 85 ℃ 热测) , 出膏率 32%。
113 试剂: 抗 Α2SM A 单克隆抗体 (Sigm a 公司) ,
抗波形蛋白单克隆抗体、抗角蛋白单克隆抗体
(San ta C ruz 公司) 均为第一抗体; 生物素标记的抗
小鼠 IgG 抗体及抗兔 IgG 抗体 (华美公司) 均为第
二抗体。
114 仪器: CM IA S 真彩色病理图像分析系统由北
京航空航天大学研制。
2 方法
211 模型制备及给药: 雄性W istar 大鼠 32 只, 其
中 24 只在无菌条件下行单侧输尿管结扎术 (un i2
la tera l u retera l ob struct ion, UUO ) [4 ] , 术后随机分
成高、低剂量治疗组和模型组, 每组 8 只。治疗组于
手术第一天起分别 ig 4. 0, 210 gö(kg·d) 药物, 模
型组 ig 等量温水。其余 8 只行假手术, 只找到输尿
管, 并不结扎。常规喂养, 实验期间自由饮水、摄食,
室内温度控制在 20 ℃~ 24 ℃, 通风湿度良好。给药
3 周后, 处死动物。
212 标本制备: 动物处死后取肾组织, 用 10% 的
中性福尔马林固定, 经脱水、包埋, 切成 2 Λm 的切
片, 作 H E, PA SM 染色; 另一些标本做成 4 Λm , 切
片脱蜡水化后, 用 3% H 2O 2溶液封闭内源性过氧化
物酶 (10 m in) , 磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗 (每次 5
·203· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003206229
作者简介: 张勉之 (1973—) , 男, 天津市人, 主治医师, 河北医科大学 2001 级博士生, 主要从事中西医结合肾脏病的基础与临床研究, 在
国内外发表论文 20 篇。 E2m ail: m zzhang9866@ sina. com
m in, 共 3 次) , 在微波缓冲液中微波修复 10 m in, 羊
血清白蛋白封闭 (20 m in ) , 依次加入一抗 (抗 Α2
SM A 抗体, 抗 V im 单克隆抗体, 抗 CK 单克隆抗
体)。4 ℃ 冰箱孵育过夜, 加入二抗 (生物素标记的
抗小鼠 IgG 抗体及抗兔 IgG 抗体) 37 ℃ 孵育 30
m in, 链霉素2卵白素复合物 (ABC) 37 ℃ 孵育 30
m in, 用 DAB 显色液显色 3~ 5 m in, 苏木素复染 3
m in, 最后用树脂封片。每批标本均做阴性及阳性对
照。肾组织免疫组化标本通过光学显微镜放大 200
倍摄取图像, 输入图像分析系统内, 进行免疫组织化
学定量分析, 在 200 倍光学显微镜下每个标本随机
选取 10 个无肾小球的视野, 计算每个视野内肾小
管上皮细胞内免疫组化阳性面积和肾小管上皮细胞
总面积的比值, 取其平均值为每例标本肾小管上皮
细胞阳性表达的比较值。
213 结果判定和记录: H E, PA SM 染色切片在光
镜下观察肾间质炎细胞浸润及间质病变。将肾小管
间质病变程度分Ë 级。即É 级: 小管间质病变散在轻
微, 范围< 15% ; Ê 级: 病变呈灶性或小片状分布, 范
围 15%~ 50% , Ë 级: 病变呈灶性或小片状或弥漫
分布, 范围> 50%。免疫组化 Α2SM A 染色主要以肾
间质血管平滑肌作为阳性对照, 对除此以外的Α2SM A 阳性细胞记录其量的差别, 即每一切片用
(10×40 倍) 光镜观察大鼠肾间质 5 处病变最为明
显的区域, 记录其阳性细胞数。按每个高倍视野的Α2SM A 阳性细胞的数量分为 5 级; < 50 个为 0 级;
50~ 100 个为É 级; 101~ 200 个为Ê 级; 201~ 300
个为Ë 级; > 300 个为Ì 级。
214 统计学处理: 数据以 x ±s 表示, 计数资料用ς2检验, 计量资料用 t 检验, 等级资料用秩和检验。
3 结果
311 光镜: H E, PA SM 染色切片可见, 模型组出现
弥漫性炎细胞浸润、间质水肿, 伴有不同程度的上皮
细胞肿胀、变性及部分肾小管萎缩、管腔闭塞, 肾间
质出现多灶性纤维化, 范围> 50% , 属于Ë 级病变;
高、低剂量治疗组分别可见部分肾小管上皮细胞发
生空泡变性, 少数肾小管上皮细胞发生空泡变性增
加并伴有部分肾小管上皮细胞核发生脱落, 肾间质
病变呈片状分布, 范围< 15% , 属于É 级病变, 与模
型组比较, 差异显著 (P < 0101) ; 肾小管面积、管腔
面积及管壁面积与模型组比较明显增加, 差异非常
显著 (P < 0101) 见表 1; 肾间质面积与模型组比较
明显缩小 (P < 0101) , 其中高剂量组效果更为明显,
但低剂量组差异无显著性, 假手术组未见病理改变。
表 1 各组肾小管面积比较
Table 1 Compar ison of renal tubular
area in d ifferen t groups
组 别 剂量ö(g·kg- 1) 肾小管面积 肾小管管腔面积 肾小管管壁面积
假手术 - 182188±111693 3 46143±21723 3 161103±141903 3
模型 - 122138±14102△△ 18133±3174△△ 101135±13126△△
治疗 210 175125±151383 3 36101±11523 3 147121± 91363 3
410 164136±161223 3 28115±11693 3 127149±101343 3
  与模型组比较: 3 3 P < 0101;  与假手术组比较: △△P < 0101
  3 3 P < 0101 vs model group;  △△P < 0101 vs Sham group 
312 肾组织免疫组织化学检测结果
31211 Α2SM A 和V im 表达分布: 结果见表 2。假手
术组极少量 Α2SM A 和V im 的表达; 模型组 Α2SM A
和 V im 表达明显增加, 肾间质阳性细胞数均大于
220 (Ë 级) ; 高、低剂量治疗组分别可见 Α2SM A 和
V im 在肾小管上皮细胞胞浆内有少量表达, 每高倍
视野 Α2SM A 和 V im 阳性细胞数均少于 200 (Ê
级) , 其中高剂量组效果更为明显, 低剂量组与模型
组比较, 差异无显著性。
31212 CK 的表达分布: 假手术组 CK 有较强的表
达; 模型组 CK 的表达明显减少; 治疗组 CK 表达有
所增强, 与模型组比较差异非常显著 (P < 0101) , 但
仍低于假手术组。见表 2。
表 2 肾组织免疫组化结果
Table 2 Results of immunoh istochem istry of k idney tissue
组 别 剂量ö(g·kg- 1) CK Α2SMA V im
假手术 - 01209 8±01023 53 3 01000 7±01000 13 3 01001 1±01002 23 3
模型 - 01065 1±01006 3△△ 01084 3±01019 0△△ 01112 2±01002 4△△
治疗 210 01157 6±01018 93 3 01015 8±01001 63 3 01033 8±01005 83 3
410 01172 5±01017 23 3 01006 7±01001 13 3 01028 5±01003 73 3
  与模型组比较: 3 3 P < 0101;  与假手术组比较: △△P < 0101
  3 3 P < 0101 vs model group;  △△P < 0101 vs Sham group
4 讨论
  以补肾活血法为依据组方的中药具有补肾、活
血、软坚的功效, 改善肾虚血瘀的病理变化, 使机体
阴阳平衡、邪祛正存。其中生黄芪具有增强机体免疫
功能、利尿、保肝、消除蛋白尿的作用; 川芎可提高 Χ
球蛋白及 T 淋巴细胞, 对免疫系统有一定调节作
用; 赤芍可提高耐缺氧能力、抗血栓形成及改善微循
环; 鳖甲能抑制肝、脾之结缔组织增生, 提高血红蛋
白水平; 甘草有类似肾上腺皮质激素样作用。诸味药
配伍可调节机体免疫功能, 改善微循环, 软坚散结,
提高组织损伤后的修复能力。
近年来肾小管间质损伤在肾脏疾病中的作用日
益受到国内外学者的重视[5, 6 ]。各种原因引起的肾小
球疾病常常伴随着肾小管间质损伤, 肾间质纤维化
是慢性进行性肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同形
·303·中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
态学特点, 决定着肾脏疾病的预后, 小管间质病变的
严重程度与肾小球滤过率的下降密切相关[7 ]。有关
研究证实, 不伴有肾小管间质纤维化的肾脏疾患, 肾
功能恶化甚至肾小球硬化进展缓慢[8 ]。肾小管间质
纤维化的过程包括肾小管细胞的丧失和细胞外基质
(ECM ) 的积聚[9 ]。肾小管间质中的肌成纤维细胞
(m yofib rob last, M yoF) 是合成细胞外基质É 型和Ë 型胶原的主要细胞, 是肾纤维化中使细胞外基质
沉积增多的主要原因之一[10 ] , 是肾间质纤维化的重
要机制之一[11 ]。M yoF 可来自成纤维细胞, 也可由
肾小管上皮细胞转化而来, 能特异性表达间充质细
胞的标志物 Α2SM A 和 V im , 而正常肾小管上皮细
胞可表达 CK [12 ]。在肾组织无损伤或仅发生轻度损
伤时肾小管上皮细胞仍表达 CK, 随着肾小管上皮
细胞损伤逐渐加重, CK 的表达开始减弱, 与此同时
可见部分损伤的肾小管上皮细胞表达 Α2SM A、
V im , 并逐渐增强, 以后出现Ë 型胶原的表达, 使肾
间质中基质增多, 发生纤维化。本实验证实, 应用补
肾活血法组方的中药, 可抑制肾小管上皮细胞肌成
纤维细胞转分化, 使M yoF 的表达减少, 抑制纤维
细胞的活化, 从而抑制肾间质纤维化的形成和发展。
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1998, 54: 86428761
复方缬芎滴丸对犬急性心肌缺血的保护作用
王 磊1, 彭仁 1, 杨 静1, 薛存宽2Ξ
(11 武汉大学医学院 药理系, 湖北 武汉 430071; 21 华中科技大学同济医学院老年医学研究所, 湖北 武汉 430077)
  随着社会的发展, 冠心病已日益成为影响人类
健康的重要疾病之一。缬草V a leriana of f icina lis L.
作为一种中药, 其抗心肌缺血的作用已早有报道[1 ];
川芎嗪是川芎 L ig usticum chuanx iong Ho rt. 的一
种有效成分, 广泛用于脏器缺血再灌注损伤的防
治[2 ]。本研究欲对两者合剂复方缬芎滴丸的抗心肌
缺血作用进行研究, 并探讨其作用机制。
1 材料与方法
111 动物: 健康杂种犬, 体重 7~ 13 kg, 雌雄不拘, 由武汉大学医学院实验动物中心提供。112  药物: 复方缬芎滴丸 (VL C, 含川芎嗪约1% ) , 湖北省老年医学研究所提供, 批号 20020323;阳性对照药复方丹参滴丸, 天津天士力制药公司产品, 批号 20020317。硝基四氮唑红 (T TC ) , 批号940824, EM K 进口, 上海化学试剂采购供应站分装; 葡萄糖氯化钠注射液, 武汉滨湖双鹤药业有限责任公司生产, 批号 020815; 盐酸利多卡因注射液, 上海复星朝晖药业有限公司产品, 批号 020906。
·403· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003206206
作者简介: 王 磊 (1976—) , 男, 河南省漯河人, 硕士在读, 主要从事生化药理与心血管药理的研究。
T el: (027) 87331565 E2m ail: w anglei138@yahoo. com. cn