全 文 ：·药材与资源·
鸡血藤高效液相色谱指纹图谱研究
严启新, 李　萍Ξ
(中国药科大学 生药学教研室, 江苏 南京　210038)
摘　要: 目的　建立鸡血藤的高效液相色谱指纹图谱, 以评价鸡血藤的质量。方法　用H PL C 法获得鸡血藤药材的
色谱图, 再用聚类分析方法进行考察。结果　鸡血藤共有 11 个峰, 其中非共有峰 6 个, 共有峰 5 个, 共有峰的相对保
留时间分别为: 01046, 01664, 11000, 11198, 11383; 相对峰面积分别为: 01819, 01221, 11000, 01331, 01458。鸡血藤及
其混淆品种的色谱指纹图谱存在明显差异, 所提取的 11 个色谱峰可作为指纹特征。结论　H PL C 色谱指纹图谱分
析技术可用于鸡血藤药材的鉴别。
关键词: 鸡血藤; 高效液相; 指纹图谱
中图分类号: R 2821710103　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 05 0556 04
Study on HPLC f ingerpr in t of Cau lis Sp a tholobi
YAN Q i2x in, L I P ing
(D epartm ent of Pharm acogno sy, Ch ina Pharm aceu tical U niversity, N an jing 210038, Ch ina)
Abstract: Object　To estab lish H PL C fingerp rin t fo r the iden t if ica t ion and evaluat ion of Cau lis
S p a tholobi. M ethods　H PL C system w as u sed to ob ta in the ch rom atogram s of Cau lis S p a tholobi and the
clu stering analysis w as app lied fo r data analysis. Results　T here are 11 peak s in to ta l, among them five
are common, the rela t ive reten t ion t im e is 01046, 01664, 11000, 11198, 11383, the rela t ive peak area is
01819, 01221, 11000, 01331, 01458. T here w as obviou s difference among ch rom atograph ic fingerp rin ts of
Cau lis S p a tholobi and its easily2confu sed species. T he 11 m easu red peak s cou ld be u sed as the fingerp rin t
fea tu res. Conclusion 　Ch rom atograph ic fingerp rin t of H PL C can be u sed fo r iden t ifying the Cau lis
S p a tholobi and its easily2confu sed species.
Key words: Cau lis S p a tholobi; H PL C; fingerp rin t
　　鸡血藤, 别名过江龙、血枫藤 (《中药志》) ; 马鹿
藤、紫梗藤 (《云南思茅中草药选》) ; 猪血藤、血龙藤、
过岗龙、五层血 (广西) ; 九层风 (《广西植物名录》) ;
野奶豆、红藤、大血藤 (广西、云南) ; 血风 (广东) 等。
《中华人民共和国药典》2000 年版收载为豆科植物
密花豆 S p a tholobus suberectus D unn 的干燥藤茎, 具
有补血、活血、通络之功, 用于月经不调, 风湿痹痛,
麻木瘫痪等症[1 ] , 为一常用中药, 鸡血藤主产于广
西、广东。市场上所用鸡血藤品种较为复杂, 各书记
载和各地使用差别很大, 涉及 6 个科 30 余种。有的
是地方习用品种, 有的是生产鸡血藤膏的原料药。鉴
于鸡血藤市售品种的混乱, 为全面控制鸡血藤的质
量, 在建立鸡血藤主成分分析方法 (另文发表) 的基
础上, 建立了鸡血藤高效液相色谱指纹图谱, 提取图
谱中的 11 个色谱峰作为指纹峰, 并用聚类分析进行
考察。研究结果表明, 这 11 个色谱指纹峰可用于鉴
别鸡血藤及其混乱品种。
1　实验材料
111　仪器: H P1100 系列高效液相色谱仪 (美国惠
谱公司) , 包括二元泵 GB 12A , R heodyne 7725i 手动
进样器, 二极管阵列检测器 (DAD ) , H PA 106101 化
学工作站; 25 ΛL 微量进样器; H S3120 型超声波提
取仪 (淮阴汉邦科技有限公司) ; 十万分之一天平 (上
海天平仪器厂)。
112　试剂与药品: 对照品原儿茶酸 ( 3, 42dihy2
droxybenzo ic acid ) , 对羟基苯甲酸 ( 42hydroxyl2
benozic acid) , 大黄素 (emodin ) , 刺芒柄花素 ( fo r2
mononet in ) , 大 豆 黄 素 ( daidzein ) , 樱 黄 素
(p runet in ) , 均从鸡血藤中分离制备, 结构经UV ,
IR ,M S,NM R 鉴定。化合物经H PL C 检测纯度均达
·655· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
Ξ 收稿日期: 2003208229
基金项目: 国家重点科技攻关项目 (992929201231)
作者简介: 严启新 (1971—) , 男, 河南省信阳市人, 助理研究员, 博士, 2002 年 9 月毕业于中国药科大学生药学专业, 研究方向为新药研究
与开发。3 通讯作者　T el: (025) 85322256, 13505142632　E2m ail: lip ingli@publicl. p tt. js. cn
到 98% 以上。色谱纯乙腈 F isher 公司生产; 蒸馏水
为乐百氏公司生产, 其余试剂均为分析纯。
113　药材: 收集于全国不同区域, 均经笔者鉴定, 见 表 1 (样品序号为 1～ 18, 其中 2, 6, 7, 8, 10 为其主产区样品)。2　方法与结果
表 1　鸡血藤及其混淆品样品
Table 1　Samples of Caulis Sp a tholobi and its easily-confused spec ies
序号 样品来源 产地 鉴定结果 收集日期
1 湖南长沙 商品　　 密花豆　　 S p a tholobus suberectus D unn 2001208
2 江苏南京 广西南宁 密花豆　　 S. suberectus 2000203
3 贵州贵阳 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2001203
4 江西南昌 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2000204
5 四川成都 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2001212
6 广西钦州 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2001211
7 广西百色 广西百色 密花豆　　 S. suberectus 2000204
8 广西柳州 广西柳州 密花豆　　 S. suberectus 2000207
9 河南商城 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2000208
10 广东韶关 商品　　 密花豆　　 S. suberectus 2000209
11 广东广州 广东连县 厚果鸡血藤M illettia p achy carp a Benth. 2000209
12 广东广宁 广宁　　 白花油麻藤M ucuna birdw ood iana T utcher 2000210
13 江西九江 江西九江 亮叶崖豆藤M illettia n itid a Benth. 2001212
14 江西九江 江西九江 光叶崖豆藤M illettia h irsu tissim a Z. W ei 2001212
15 福建南安 福建南安 香花崖豆藤M illettia d ielsiana H arm s. 2001204
16 海南　　 商品　　 红血藤　　 S p a tholobus sinensis Chun et T. Chen 2001207
17 四川峨眉 四川峨眉 大血藤　　 S arg en tod ox a cunea ta (O liv. ) Rehd. et W ils. 2001210
18 云南昆明 商品　　 网络崖豆藤M illettia reticu la ta Benth. 2001211
211 　色谱条件: 色谱柱: H P2H yspersil BD S2C 18
(250 mm ×4 mm , 5 Λm ) , Pellicu lar C 18预柱; 流动
相: 乙腈 (B ) 2水 (A ) , 梯度洗脱 99% A 21% B (0～ 5
m in ) , 80% A 220% B (5～ 12 m in) , 60% A 240% B
(12～ 40 m in) , 30% A 270% B (40～ 50 m in) , 20%
A 280% B (50～ 55 m in) , 0% A 2100% B (55～ 60
m in ) ; 流速: 1 mL öm in; 柱温: 25 ℃; 检测波长:
250 nm。
212　对照品溶液的制备: 精密称取原儿茶酸, 对羟
基苯甲酸, 大黄素, 刺芒柄花素, 大豆黄素, 樱黄素各
1 m g, 分别用甲醇定容于 5 mL 量瓶中, 摇匀, 作为
储备液, 分别量取储备液原儿茶酸, 对羟基苯甲酸,
大黄素, 刺芒柄花素各 110 mL , 大豆黄素 015 mL ,
樱黄素 015 mL 置 2 mL 量瓶中混合, 甲醇定容并摇
匀, 作为对照品溶液。
213　供试品溶液的制备: 取药材粉末 500 m g, 精密
称定, 用氯仿2甲醇 (4∶1) 50 mL 加热回流提取 8
h, 提取液浓缩至 30 mL , 加 100 mL 醋酸乙酯分 3
次萃取, 萃取液浓缩至干, 甲醇溶解, 转移至 25 mL
量瓶中, 摇匀, 微孔滤膜滤过, 取续滤液 014 mL 置 1
mL 量瓶中定容即得。
214　方法学考察
21411　稳定性试验: 取同一供试品溶液, 分别在 0,
2, 4, 6, 8, 10 h 检测, 其相对保留时间R SD < 3% , 主
要共有峰面积 R SD 不超过 5% , 说明溶液至少在
10 h内稳定。
21412　精密度考察: 取同一份供试品溶液, 连续进
样 3 次, 考察色谱峰保留时间的一致性, 计算各色谱
峰保留时间的相对标准偏差, 结果R SD < 2%。
21413　重现性试验: 取同一批号的供试品 3 份, 同
法检测, 考察色谱峰相对保留时间的一致性, 结果各
色谱峰相对保留时间的R SD < 2%。
215　H PL C 图谱分析: 精密吸取对照品溶液与供试
品溶液各 20 ΛL , 注入高效液相色谱仪, 按 211 色谱
条件进行分析, 测定, 以刺芒柄花素 (fo rmononet in)
为内标, 计算相对保留时间和相对峰面积。H PL C 色
谱分离图见图 1 (图 12A 对照品峰 1 为原儿茶酸、峰
2 为对羟基苯甲酸、峰 5 为大豆黄素、峰 7 为刺芒柄
花素、峰 8 为樱黄素和峰 9 为大黄素)。
216　各峰相对保留时间和相对峰面积: 以刺芒柄花
素 (fo rmononet in , 峰 7) 为内标, 计算各样品的所有
峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表 2, 3。
　　表 2, 3 说明, 样品中有 5 个共有峰, 分别是: 峰
1, 5, 7, 8, 10, 5 个共有峰相对峰面积和在 11821～
41508。共有峰的相对保留时间和相对峰面积的均值
可以作为鸡血藤H PL C 指纹的特征。
　　鸡血藤混淆品 5 个共有峰相对峰面积与正品有
明显区别, 结果见表 4。
3　聚类谱系图的建立[2 ]
　　将样品分析中所获得的 18 个样品的 11 个色谱
·755·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
图 1　对照品 (A)、鸡血藤 (B)和鸡血藤混淆品 (C) HPLC 色谱图
F ig. 1　HPLC chromogram s of reference substance (A) , Caulis Sp a tholobi (B) , and its easily-confused spec ies (C)
表 2　鸡血藤样品 11 个峰的相对保留时间 (n= 2)
Table 2　Relative reten tion time of 11 peaks of Caulis Sp a tholobi (n= 2)
样品 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
1 0. 044 0　　 0　　 0　　 0. 664 0. 715 1. 000 1. 195 1. 275 1. 380 1. 509
2 0. 043 0. 428 0. 447 0. 514 0. 666 0. 695 1. 000 1. 198 1. 277 1. 383 1. 510
3 0. 046 0. 427 0. 446 0. 467 0. 664 0. 715 1. 000 1. 194 1. 275 1. 406 0　　
4 0. 046 0. 430 0　　 0　　 0. 664 0. 699 1. 000 1. 194 1. 304 1. 377 0　　
5 0. 046 0　　 0. 453 0. 514 0. 665 0　　 1. 000 1. 204 0　　 1. 389 0　　
6 0. 046 0. 429 0. 457 0. 516 0. 668 0. 700 1. 000 1. 194 1. 305 1. 379 0　　
7 0. 045 0. 430 0. 446 0. 496 0. 664 0. 717 1. 000 1. 200 1. 305 1. 387 1. 536
8 0. 044 0. 428 0. 448 0. 516 0. 663 0. 720 1. 000 1. 198 1. 292 1. 381 0　　
9 0. 051 0. 423 0. 447 0. 510 0. 661 0. 692 1. 000 1. 190 1. 263 1. 367 0　　
10 0. 045 0. 427 0. 451 0. 514 0. 652 0. 714 1. 000 1. 207 1. 270 1. 375 1. 499
均值 0. 046 0. 427 0. 449 0. 505 0. 664 0. 637 1. 000 1. 198 1. 157 1. 383 1. 501
　　　　样品序号同表 1
　　　　Samp le’s N o. are sam e to T ab le 1
表 3　鸡血藤样品 11 个峰的相对峰面积 (n= 2)
Table 3　Relative peak area of 11 peaks of Caulis Sp a tholobi (n= 2)
样品 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11
1 0. 449 0　　 0　　 0　　 0. 147 0. 208 1. 000 0. 988 0. 178 0. 643 0. 043
2 0. 198 0. 037 0. 049 0. 036 0. 082 0. 058 1. 000 0. 074 0. 036 0. 468 0. 029
3 0. 553 0. 107 0. 089 0. 210 0. 325 0. 434 1. 000 0. 798 0. 196 1. 093 0　　
4 0. 879 0. 064 0　　 0　　 0. 284 0. 368 1. 000 0. 210 0. 320 0. 074 0　　
5 0. 818 0　　 0. 107 0. 070 0. 132 0　　 1. 000 0. 026 0　　 0. 149 0. 029
6 0. 522 0. 137 0. 182 0. 216 0. 147 0. 200 1. 000 0. 156 0. 066 0. 049 0　　
7 1. 823 0. 210 0. 241 0. 300 0. 256 0. 199 1. 000 0. 504 0. 145 0. 927 0. 125
8 2. 209 0. 174 0. 255 0. 306 0. 252 0. 483 1. 000 0. 053 0　　 0. 287 0　　
9 0. 358 0. 159 0. 157 0. 247 0. 285 0. 384 1. 000 0. 247 0. 098 0. 803 0　　
10 0. 384 0. 171 0. 169 0. 274 0. 301 0. 404 1. 000 0. 258 0. 101 0. 084 0　　
均值 0. 819 0. 106 0. 125 0. 166 0. 221 0. 274 1. 000 0. 331 0. 114 0. 458 0. 023
表 4　鸡血藤混淆品相对峰面积
Table 4　Relative peak area of easily-confused
spec ies of Caulis Sp a tholobi
样品序号 　名　称 峰 1 峰 5 峰 7 峰 8 峰 10
11 厚果鸡血藤 - - - - -
12 白花油麻藤 3. 590 0　　 1 0. 361　 0. 360
13 亮叶崖豆藤 0　　 0. 285 1 0. 025　 0. 010
14 光叶崖豆藤 0　　 0. 273 1 0. 016 1 0　　
15 香花崖豆藤 0. 548 0. 285 1 0　　　 0　　
16 红鸡血藤　 0. 806 0　　 1 0　　　 3. 470
17 大血藤　　 - - - - -
18 昆明鸡血藤 1. 646 0　　 1 0　　　 0. 657
　　样品序号同表 1
　　Samp le’s N o. are sam e to T ab le 1
峰, 采用模糊聚类分析方法。在进行模糊聚类分析之
前, 为消除由于数据变换的幅度和范围以及数据分
布的非正态性对聚类结果的影响, 对原始数据进行
中心化变换, 原始数据经中心化变换后, 采用绝对指
数来描述样本之间的距离。根据样本之间的绝对指
数计算结果, 选择绝对指数最近的两个样本并类, 不
断将距离最小者并类, 直到所有样本都归为一类。结
果见图 2。
　　从图 2 中可以看出, 1～ 18 号样品分为两大类,
第一类: 1～ 10 为正品鸡血藤, 他们之间差异较小。
第二类: 11～ 18 为鸡血藤混淆品。该结果和形态鉴
定基本是一致。
4　小结和讨论
411　通过对 18 批不同产地和不同商品的鸡血藤的
·855· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
图 2　鸡血藤聚类树状图
F ig. 2　Cluster ing analysis of Caulis Sp a tholobi
H PL C 指纹图谱分析, 结果表明正品鸡血藤中有 11
个峰, 和已知对照品相比较, 其中, 峰 1, 2, 5, 7, 8 和
9 分别是原儿茶酸、对羟基苯甲酸、大豆黄素、刺芒
柄花素、樱黄素和大黄素。
412　11 个峰中, 其中非共有峰 6 个, 共有峰 5 个:
分别是峰 1 (原儿茶酸)、峰 5 (大豆黄素)、峰 7 (刺芒
柄花素)、峰 8 (樱黄素)、峰 10 (大黄素) ; 共有峰的相
对保留时间分别为: 01046, 01664, 11000, 11198,
11383, 相对峰面积分别为: 01819, 01221, 11000,
01331, 01458。11 个色谱峰作为鸡血藤色谱峰的共
性, 可作为鸡血藤的H PL C 指纹图谱的特征。
413　鸡血藤及其混淆品的H PL C 指纹图谱特征有
一定差别, 5 个共有峰在各混淆品中是缺失的, 故各
自相对保留时间和相对峰面积都有不同, 从而达到
鉴别的目的。如厚果鸡血藤和大血藤 5 个共有峰都
没有, 白花油麻藤缺峰 5, 亮叶崖豆藤缺峰 1, 光叶崖
豆藤缺峰 1 和峰 10, 香花崖豆藤缺峰 8 和 10, 红鸡
血藤、昆明鸡血藤均缺峰 5 和峰 8。
414　以 11 个色谱峰为特征峰, 运用模糊聚类对其
进行分析, 结果表明 18 个样品能较好地分成两大
类, 很明显地区分鸡血藤的正品及其混淆品种。
415　聚类方法曾采用了系统聚类方法, 数据运用对
数转换、平方根、标准化等, 聚类距离运用了欧氏距
离、马氏距离、兰氏距离、卡方; 运算方法采用离差平
方和等多种方法, 其结果均不理想。后采用模糊聚类
分析方法, 以中心化转换数据, 绝对指数计算聚类距
离。其结果较好, 与经典形态鉴定具有一致性, 能达
到鉴定的目的。
References:
[ 1 ]　Chen D , Xu G J , Xu L S. Study on the p roperties of
S p a tholobus suberectus D unn [J ]1 J Ch in M ed M ater (中药
材) , 1993, 16 (8) : 212241
[ 2 ]　Kang Q Y, Feng M G. P ractica l S ta tistics and D PS D ata
P rocessing S y stem (实用统计分析及其 D PS 数据处理系统)
[M ]1 Beijing: Ch ina A gricu ltu ral P ress, 20021
牛膝的 rD NA ITS 序列分析
王淑美1, 梁生旺13 , 周开亚2, 刘忠权2, 冯卫生1, 吴明侠1Ξ
(11 河南中医学院 药物分析学科, 河南 郑州　450008; 21 南京师范大学遗传资源研究所, 江苏 南京　210097)
摘　要: 目的　探讨不同产地牛膝的 IT S 的序列变异, 为鉴别牛膝提供DNA 分子标记。方法　利用特异性 PCR 技
术对牛膝的 rDNA IT S 区碱基序列进行测定, 报道了牛膝的 rDNA IT S 区的碱基序列。结果　得到核糖体DNA 中
的 IT S 及 518 S rDNA 完全序列, 18 S 和 26 S rDNA 部分序列, 共约 650 bp。牛膝与川牛膝及土牛膝碱基序列有明
显差异, 不同产地、不同栽培品种牛膝碱基序列无差异。结论　此法可用于牛膝种间及真伪品鉴别。
关键词: 分子鉴定; 牛膝; PCR; 序列分析
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 05 0559 04
R ibosoma l rD NA ITS sequence ana lysis of root of A chyran thes biden ta ta
W AN G Shu2m ei1, L IAN G Sheng2w ang1, ZHOU Kai2ya2, L IU Zhong2quan2,
FEN G W ei2sheng1, W U M ing2x ia1
(1. D epartm ent of Pharm aceu tical A nalysis, H enan Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, Zhengzhou 450008, Ch ina;
2. Inst itu te of Genetic R esources, N an jing N o rm al U niversity, N an jing 210097, Ch ina)
Abstract: Object　To study the co rrela t ion betw een IT S sequence varia t ion of roo t of A chy ran thes
·955·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 5 期 2004 年 5 月
Ξ 收稿日期: 2003208211
基金项目:“九五”国家科技攻关项目 (992929201206)
作者简介: 王淑美 (1966—) , 女, 山东省海阳市人, 1990 年毕业于上海医科大学药化专业, 2001 年获硕士学位, 河南中医学院药物分析学
科副教授, 硕士生导师, 主要从事药物质量控制研究。T el: (0371) 5680562　E2m ail: ShmW ang@Sina. Com3 通讯作者　T el: (0371) 5961380　E2m ial: SwL iang371@ 163. com