全 文 ：·综述·
生物技术在药用石斛研究中的应用
杨显志 ,邵　华* ,周　成 ,张玲琪 ,魏蓉城
⒇
(云南大学生命科学与化学学院 ,云南 昆明　 650091)
摘　要: 石斛具有极大的药用价值 ,在临床上及中药复方中被广泛应用。 但是石斛药源一直处于紧张状态 ,是亟待
解决的问题。 综述了组织培养、遗传转化、菌根技术等生物技术在药用石斛研究中的应用 ,指出了存在的主要问题
及今后的研究前景。
关键词: 药用石斛 ;组织培养 ;遗传转化 ;菌根技术 ;人工种子
中图分类号: R282. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 02 0173 03
Application of biotechnology in studies of medicinal plants Dendrobium Sw.
YANG Xian-zhi, SHAO Hua , ZHOU Cheng , ZHANG Ling-qi, WEI Rong-cheng
( Colleg e of Life Science and Chemistry , Yunnan Univ ersi ty, Kunming Yunnan 650091, China)
Key words: medicinal plants Dendrobium Sw. ; tissue cul ture; g enetic t ransfo rmation; myco rrhizal
technolog y; artificial seeds
　　石斛是常用名贵中药材 ,为兰科 ( Or chidaceae )石斛属
(Dendrobium Sw. )多种植物的新鲜或干燥茎的统称。 我国
76种石斛属植物中有 30多种作药用 [1] ,著名的有金钗石斛
D. nobile Lindl.、铁皮石斛 D . off icinale Kimura et Migo、霍
山石斛 D . huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng等。在《神
农本草经》中 ,石斛被列为上品 ,具有滋阴清热、生津益胃、润
肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究表明 ,石斛还具有抗
肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等
作用 [2] ,因此石斛在临床上及中药复方中被广泛应用。 但石
斛属植物自然繁殖力极低 ,生长缓慢 ,加之人们掠夺性采挖 ,
致使野生资源已经严重枯竭。石斛的栽培也一直存在着存活
率低 ,产量低 ,进入盛产期年限长的问题 ,因此 ,石斛药源一
直处于紧张状态 ,亟待解决。 应用生物工程技术和现代农业
技术来解决才是长远之计。 本文就石斛的组织培养、遗传转
化、菌根技术、人工种子等技术的研究作一综述。
1　组织培养
由于石斛自然繁殖力极低 ,用组织培养方法快速大量繁
殖试管苗 ,是解决种苗的有效途径。 张明等 [3 ]综述过石斛的
组织培养研究 ,其中以种子进行组培的研究较多。
1. 1　原球茎 ( pro to corm)的增殖与分化: 原球茎的增殖分化
是石斛试管苗繁殖的关键 ,因此研究原球茎增殖分化的适宜
培养条件非常重要。 曾宋君等 [4 ]研究表明 ,石斛原球茎的增
殖与种子种龄有关 ,种龄在 45 d以下 ,萌发率极低 ,萌发时
间长 ,随着种龄增长 ,其胚细胞愈多 ,萌发率越高。 原球茎增
殖分化的最适培养基为改良 N6+ 0. 2 mg /L NAA+ 2%蔗
糖。种子萌发成苗后需及时将小苗转移到合适的培养基中进
行生根 ,壮苗培养。 刘骅等 [5]报道铁皮石斛试管苗壮苗阶段
的适宜培养基为: B5 (或 1 /2MS )+ 10%香蕉水提物 +
2 mg / L N AA+ 2%蔗糖。 曾宋君等 [4]报道的生根壮苗培养
基为改良 N6+ 10%香蕉汁+ 2%蔗糖 ,苗长得更粗壮。
1. 2　其他外植体的离体培养: 石斛组培除用种子外 ,也可用
根、茎、节、叶等外植体进行。 周月坤等 [6 ]在 M S+ 0. 5 mg /L
6-BA+ ( 0. 5～ 2. 0) mg /L 2, 4-D培养基上 ,由叶基部诱导产
生愈伤组织 ,进而分化出拟原球茎 ( pro toco rm like bodies,
PLBs)获得完整植株 ,并指出 2, 4-D对诱导愈伤组织形成和
分化有重要作用 , N AA的加入对分化 PLBs有一定的促进
作用。Mujib等 [7]报道 D . `madame pompadour’的茎尖接于
附加 0. 2 mg / L 2, 4-D和 0. 2 mg /L BAP培养基上可诱导出
愈伤组织。 而添加 NAA和 BAP则易产生 PLBs,在添加了
10%椰汁和活性炭的无激素 VW培养基上可使 PLBs快速
增殖 , GA-3对 PLBs的增殖有一定影响。生根培养基以添加
1 mg /L N AA为佳。 Nayak等 [8 ]报道 D. aphy llum 和 D .
moschatum的茎段在 M S+ 6-BA(或 TDZ)上能快速增殖并
形成茎 ,将其转接到含 6-BA和 NAA的培养基上可继续生
长。 在 M S+ IBA上可诱导生根 ,外植体经驯化后最终可以
移栽到大田。 另外 , TDZ浓度超过最适浓度 ( 2. 2～ 4. 5μmol /
L )会抑制茎再生。茎段作水平放置可以获得再生植株 ,而垂
直放置的处理则无任何茎芽发生 ,这说明外植体的取向对茎
上芽的形成至关重要。 杨联河等 [9 ]报道曲茎石斛 D .
flex icaule茎段培养和苗增殖的培养基以 B5+ 0. 5 mg / L 6-
·173·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
⒇ 收稿日期: 2001-09-10基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39860005)作者简介:杨显志 ( 1968-) ,男 ,四川省安岳县人 ,现为云南大学生物系微生物学专业硕士生 ,师从张玲琪教授 ,主要从事植物真菌及其次生活性代谢产物方面的研究。
* 通讯联系人　　 E-mai l: yim401@ public. km. yn. cn　　 Tel: 0871-5033369　　 Fax: 0871-5171975
BA+ 1 mg / L NAA+ 20 g / L蔗糖最好。 试管苗生根培养基
为: M S+ 2 mg /L 6-BA+ 0. 2 mg /L N AA+ 0. 1 mg /L IBA
+ 30 mg / L蔗糖。 Yasugi等 [10 ]将石斛的假鳞茎分为上部 (含
第 2个节 )和下部 (含第 4个节 ) ,在 M S+ 3%葡萄糖 +
0. 1 mg /L N AA+ 0. 1 mg /L 6-BA培养基上 , p H 5. 8, 23
℃ ,日光灯照射的条件下 ,上部和下部假鳞茎段都能产生大
量丛生苗。单个假鳞茎段在含有 1 mg / L NAA和 1 mg /L 6-
BA的培养基上获得再生植株的最大数量为 37. 3,表明假鳞
茎段培养是获得多丛苗和再生植株的有效途径。
1. 3　离体开花:铁皮石斛在栽培条件下 ,由种子萌发到开花
通常需 3～ 4年。 王光远等 [11, 12]以铁皮石斛种子诱导形成的
愈伤组织 ,在光照下置于 M S+ 0. 3 mg / L NAA培养基上繁
殖 ,可形成原球茎。 将原球茎转入 M S+ 2 mg /L 6-BA+ 0. 5
mg / L N AA培养基中 , 3～ 6个月开花。 花芽形成频率为
31. 6% ～ 45. 8%。如果原球茎先在 0. 5 mg /L ABA培养基上
预培养 15 d,再转入含 2 mg / L 6-BA的 M S培养基培养 ,花
芽形成频率明显提高 ,可达 84. 4% ,而且每株植株花的数目
增加。 但是 ,在仅有 ABA的 MS培养基上培养的原球茎 ,其
再生的植株未见花芽形成。该研究极大地缩短了石斛开花所
需时间 ,在育种上有着重要的生物学意义。
2　遗传转化
Kuehnle等 [13]用带有植物表现的 Nos-NPTⅡ基因和番
木瓜病毒 ( PRV )膜蛋白 ( CP )基因的质粒 pGA482GG /
cpPRV4包被的微粒轰击石斛原球茎进行基因转移实验。通
过 4次杂交得到的近 280个原球茎被粒子轰击 ,转化与否表
现在组织是否变绿。 培养基为 1 /2 MS+ 2%蔗糖+ ( 50～
100) mg / L硫酸卡那霉素。 PCR分析表明 ,由 2次杂交得到
了 13株具有卡那霉素耐受性植株带有 Nos-NPTⅡ基因 ,而
只有 1株带有 PRV CP基因。这些结论表明用粒子轰击的方
法可以实现单子叶植物石斛的转基因。
Chia等 [14]用带有 35S-luc嵌合基因质粒包被的钨颗粒
( 1. 3 μm )轰击石斛 PLBs, 3周后向转化组织中加入 1
mmo l /L荧光素 ,转化细胞可通过低光视频显微镜及其辅助
图像处理设备检测生物性发光来辨别。检测出的转化组织允
许其繁殖 ,然后进行第 2轮筛选。经过 3轮生长和筛选后 ,表
达荧光素酶的转化组织用来产生石斛再生植株。
此外 ,还可利用根癌农杆菌 Agrobacterium tumef aciens
介导法获得转基因植物 ,其关键是毒性基因的诱导表达 ,而
在单子叶植物中常常缺少这种诱导物质。 近来 Nan等 [15]在
石斛组织培养中发现 PLBs发育早期有大量的松柏醇产生 ,
它可诱导毒性基因的表达。如果将在暗处培养的 PLBs转入
光照条件下培养 ,其含量呈 6倍增加。 PLBs松柏醇的产量是
叶的 11倍 ,这使通过农杆菌介导法获得转基因植物 ,即将克
隆的花色基因、主成分表达基因等通过农杆菌介导法转入石
斛 PLBs成为可能。
3　菌根技术
分离和筛选促进石斛生长发育的适宜菌根真菌 ,是菌根
技术应用于石斛生产的关键问题之一。 郭顺星等 [16]对野生
铁皮石斛和金钗石斛根中的菌根真菌进行了分离 ,共分得菌
根真菌 25种 ,主要属于担子菌和半知菌。生物活性测定结果
表明 ,其中 5种真菌可促进铁皮石斛种子萌发 , 7种真菌可
与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系 ,但仅有 3种真菌
对幼苗有促生作用。
自野生细叶石斛 D . hancockii Ro lfe和见血清 L iparis
nervosa种子萌发的原球茎中分离的微囊菌属 (Microascus )
和毛壳菌属 (Chaetomium )以及从天麻原球茎中分离的紫萁
小菇 Mycena osmundicola 对 细叶 石斛 、罗 河 石斛 D .
lohohense Tang et Wang和铁皮石斛种子的萌发有显著促进
作用。 菌丝伴播种子的方法 ,还有利于萌发形成的原球茎继
续发育。用这些真菌培养物的醇或水提取液培养细叶石斛的
种子时 ,发芽率达 40% ～ 70%。超微结构观察发现 ,真菌自石
斛种子的胚柄处侵入种胚细胞后 ,在胚细胞中稀疏分布 ,受
到侵入真菌刺激 ,胚细胞的质膜内陷 ,产生许多囊状体包围
消化入侵的菌丝 ,菌丝逐渐被分解作为种子萌发的营养物
质 [17]。 今后应加强对石斛菌根真菌的分离和筛选及其对石
斛促生机理的研究。
4　人工种子
植物人工种子作为一项新兴的生物工程技术 ,在植物培
养材料的快速繁殖、保藏、运输等方面 ,展示了广阔的应用前
景。 郭顺星等 [18 ]已成功地以原球茎为材料 , 3%海藻酸钠和
2% CaCl2为人工种皮 ,改良 1 /2 M S+ 3%蔗糖为胚乳制成铁
皮石斛人工种子 ,其存活率、发芽率高 ,发芽率可达 80%以
上 ,成苗好。但仍有许多问题需深入研究 ,直接用于栽培的人
工种子也尚无研究。
5　无土栽培
石斛组培试管苗在室内培养获得了一定成功 ,但由于入
土困难 ,仍无生产栽培的实际意义。石斛是一种附生植物 ,因
而进行无土栽培具有重要意义。 李泉森等 [19 ]发现采用冷杉
或杂木等粗糙锯末为基质适宜金钗石斛气生生长 ,施以由
N, P, K及多种微量元素组成的营养液 ,用适当浓度的激素
处理 ,保持基质湿润 ,石斛生长良好 ,产量增加 82. 1% ～
177. 8%。 在无土栽培条件下 ,水分和营养较充足 ,这时强光
照有利于石斛的生长和高产 ,这与自然条件下生长的石斛喜
半阴半阳的生态环境有所不同。
6　结语
石斛的组培工作主要集中在快速繁殖 ,扩大繁殖系数方
面 ,已能成功地培育出试管苗 ,然而对试管苗移栽方面的研
究工作做得还很少。从试管苗到大田栽培的中间环节应是目
前的主攻方向。加强石斛菌根技术的研究 ,研制菌根菌剂 ,结
合大田栽培 ,从根本上解决石斛试管苗移栽问题。 遗传转化
既可提高石斛品质 ,又可创造新品种 ,应继续加强遗传转化
方面的研究 ,其中以发根农杆菌 A . rhizogens Ri质粒介导
的石斛毛状根培养对生产次生代谢产物极为重要。
对石斛组培过程中次生代谢产物的研究也极重要 ,然而
这一研究在国内外都较少。 Nan等 [15]报道在石斛 PLBs组培
过程中产生大量的松柏醇。 黄民权等 [20]发现铁皮石斛愈伤
·174· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
组织培养物中多糖及其生物活性与原植物存在着明显相似
性。 而石斛植物中尚有多种生物碱 ,抗癌菲 ,类黄酮等物质 ,
这些物质在组培物中的情况有待深入研究 ,为通过组培来获
取这些药用成分提供依据。 石斛花药培养 ,原生质体培养等
目前国内外均尚未见报道。石斛药用成分的化学合成是目前
研究的弱点 ,应当加强对以活性成分为先导化合物的结构修
饰和改造 ,而酶学等生物技术在化学合成方面的应用将具有
良好的前景。
参考文献:
[1 ]　李满飞 ,徐国钧 ,徐珞珊 ,等 .商品石斛的调查及鉴定 (Ⅱ ) [ J] .
中草药 , 1991, 22( 4) : 173-180.
[2 ]　陈晓梅 ,郭顺星 .石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展
[ J] .天然产物研究与开发 , 2001, 13( 1): 70-75.
[3 ]　张　明 ,夏鸿西 ,朱利泉 ,等 .石斛组织培养研究进展 [ J ] . 中
国中药杂志 , 2000, 25( 6): 323-326.
[4 ]　曾宋君 ,程式君 . 石斛的试管苗快速繁殖 [ J] . 中药材 , 1996,
19( 10): 490-491.
[5 ]　刘　骅 ,张治国 . 铁皮石斛试管苗壮苗培养基的研究 [ J ] . 中
国中药杂志 , 1998, 23( 11): 654-656.
[6 ]　周月坤 ,王伏雄 . 兜唇石斛幼叶再生植株的研究 [ J] . 植物学
集刊 , 1989, 12( 4): 123-126.
[7 ]　 Mujib A, Jana B K. Clonal propagation of Dendrobium ma-
dame pom padou r th rough apical m eris tem cul ture [ J ] . Adv
Plant Sci , 1994, 7( 2): 340-346.
[8 ]　 Nayak N R, Rath S P, Satyanarayan P. In vit ro propagation
of three epiphy tic orchid s, Cymbid ium aloi folium ( L. ) Sw. ,
Dendrobium aphyllum ( Rox b. ) Fisch. and D. moschatum
( Buch-Hain) Sw. through thidiazu ron-induced h igh f requency
sh oot prolif eration [ J ]. Sci Hortic, 1997, 71( 3-4): 243-250.
[9 ]　杨联河 ,王倩嵘 ,何俊彦 ,等 . 曲茎石斛组织培养研究 [ J ]. 中
国中药杂志 , 1998, 23( 11): 658-659.
[ 10 ]　 Yasugi S, Shinto H. Fo rmat ion of mul tiple shoo ts and
regenerated plantlets by cul tu re of ps eudob ulb seg men t in
nobi le type Dendrobium [ J ] . Sh okubu tsu Soshiki Baiyo,
1994, 11( 2): 153-156.
[11 ]　王光远 ,刘　培 ,许智宏 ,等 .石斛离体培养中 ABA对诱导花
芽形成的影响 [ J] .植物学报 , 1995, 37( 5): 374-378.
[12 ]　王光远 ,许智宏 ,蔡德发 ,等 . 铁皮石斛的离体开花 [ J] . 中国
科学 ( C辑 ) , 1997, 27( 3): 229-234.
[13 ]　 Kuehnle A R, Sugii N. Transformation of Dendrobium orch-
id using particle b ombardmen t of protocorms [ J ] . Plant Cell
Rep, 1992, 11( 9): 484-488.
[14 ]　 Chia T F, Ch an Y S, Chua N H. Th e fi ref ly luciferase g ene
as a non-invasiv e repo rter for dendrobium transformation
[ J] . Plan t J, 1994, 6( 3): 441-446.
[15 ]　 Nan G L, Tang C S, Kuehnle A R, et a l. Dendrobium orch-
ids contain an inducer of Agrobacterium virulence gen es [ J].
Physiol Mol Plan t Path ol , 1997, 51( 6): 391-399.
[16 ]　郭顺星 ,曹文芩 ,高微微 . 铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分
离及其生物活性测定 [ J ]. 中国中药杂志 , 2000, 25( 6): 338-
341.
[ 17 ]　王康正 ,范　磊 ,高文远 ,等 . 药用石斛栽培的研究概况 [ J ].
中国中药杂志 , 1998, 23( 6): 340-343.
[ 18]　郭顺星 ,曹文芩 ,张集慧 ,等 .铁皮石斛人工种子制作流程及
发芽研究 [ J ]. 中草药 , 1996, 27( 2): 105-107.
[19 ]　李泉森 ,张　明 ,金仕勇 . 石斛无土栽培基质的初步研究 [ J ].
中国中药杂志 , 2000, 25( 1): 23-24.
[ 20 ]　黄民权 ,卢应京 .石斛愈伤组织培养物的药用前景探讨 [ J ].
中药材 , 1998, 21( 11): 543-545.
黄药子的研究进展
林厚文 ,张　罡* ,赵宏斌* * ,张　纯 ,刘皋林
⒇
(第二军医大学长征医院 药学部 ,上海　 200003)
摘　要: 综述了有关黄药子在化学成分、药理作用、临床应用等方面的研究进展。
关键词: 黄药子 ; diosbulbin;化学成分 ;药理作用 ;临床应用
中图分类号: R282. 71; R285　　　文献标识码: A　　　文章编号 : 0253 2670( 2002) 02 0175 03
Advances in studies onDioscorea bulbifera
L IN Hou-wen, ZHAN G Gang , ZHAO Hong-bin, ZHAN G Chun, L IU Gao-lin
( Chang zheng Hospita l, Second M ilitar y Medical Univ e rsity , Shanghai 200003, China )
Key words: Dioscorea bulbi fera L. ; diosbulbin; chemical consti tuents; pharmacological ef fect; clinical
application
　　黄药子为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbif era L.的块 茎 ,又名黄药脂、黄药根、黄独、黄药等。目前临床上用于治疗
·175·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 2期
⒇ 收稿日期: 2001-06-15作者简介:林厚文 ( 1967-) ,男 , 1998年毕业于沈阳药科大学 ,获得博士学位 ,现任职于第二军医大学长征医院药学部海洋药物研究室 ,主要从事抗肿瘤天然活性成分的研究。 Tel: ( 021) 25070971-6016
* 第二军医大学药学院 97级实习生　　* * 中国药科大学生物制药学院 97级实习生