全 文 ：HPLC法测定大鼠血浆中丹参酚酸 A的浓度
张向荣,潘卫三
(沈阳药科大学药学院, 辽宁 沈阳 110016)
摘 要:目的 建立大鼠血浆中丹参酚酸 A 的含量测定方法。方法 利用 HPLC, 色谱柱: Hypersil ODS 柱( 4. 6
mm×200 mm, 10 m) , 流动相: 乙腈-水( 1∶2. 65, 甲酸调 pH 值至 2. 5) ,流速: 0. 9 mL / min, 检测波长: 285 nm ,以
桂皮酸作为内标物。结果 方法回收率在 98. 9%～106. 9% , 提取回收率大于 83% , 日内、日间精密度均低于
8. 4%。结论 该法可作为丹参酚酸 A 在大鼠体内药物动力学研究的检测手段。
关键词: 血浆;丹参酚酸 A; HPLC
中图分类号: R285. 6; R286. 02 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0410 03
Quantitative determination of salvianolic acid A in rat plasma by HPLC
ZHANG Xiang-rong , PA N Wei-san
( College o f Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical Univer sity , Shenyang L iaoning 110016, China)
Abstract: Object T o develop a method fo r the quant itat ive determ inat ion of salvianolic acid A in rat
plasma. Methods HPLC method and Hypersil ODS column ( 4. 6 mm×200 mm , 10 m) w ere used, the
mobile phase w as acetont rile-w ater ( 1∶2. 65, adjusted pH to 2. 5 w ith form ic acid) , at a f low rate of 0. 9
mL/ m in, the UV detect ion w avelength w as 285 nm . Cinnamic acid w as used as inter nal standard. Results
The recovery of the method w as in the range o f 98. 9%～106. 9%, the recovery of the ex t ract ion w as
over 83% . T he w ithin-day precision and the day-to-day precision w ere both low er than 8. 4% . Conclusion
The method is appr opr iate for the determ inat ion o f salv ianolic acid A when pharmacokinet ics of salv iano-
lic acid A is studied in rat plasma.
Key words : plasma; salv ianolic acid A; HPLC
丹参酚酸 A ( salvianolic acid A, Sal A)为丹参
Salvia miltiorrhiz a Bge. 的水溶性酚酸类成分, 具
有抗脑缺血及体内外抗氧化、保护心、脑等生理作
用[ 1～ 3]。血浆中丹参素和原儿茶醛及丹参酮的含量
测定方法已有文献报道 [ 4～6] , 而血浆样品中 Sal A
含量的测定方法未见报道。本实验以桂皮酸为内标
建立了 HPLC 法测定大鼠血浆样品中Sal A 含量的
分析方法,为进行 Sal A 的药物动力学研究提供了
一个灵敏、可靠的检测手段。
1 材料
1. 1 仪器:高效液相色谱仪(日本 JAsco 公司) ,包
括 JA sco U V-975检测器, JAsco PU-980HPLC 泵,
Ckchrom Data Sy stem 数据处理工作站; SLJ-Ⅱ型
电动离心机(沈阳市理化仪器厂) ; YKH-Ⅱ型液体
快速混合器(江西医疗器械厂) ; SCQ-50型超声波
清洗机(上海申波超声公司) ; PHS-2C 型酸度计(上
海伟业仪器厂)。
1. 2 试剂: Sal A (自制, 经核磁、红外、紫外光谱确
证) ,桂皮酸(上海正翔化学试剂研究所,分析纯) ,甲
醇、乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
2 实验方法
2. 1 色谱条件:色谱柱: Hypersil ODS ( 4. 6 mm×
200 mm , 10 m) ;流动相: 乙腈-水( 1∶2. 65, 甲酸
调 pH 至 2. 5) ;流速: 0. 9 mL/ min, 紫外检测波长:
285 nm ;柱温:室温。
2. 2 对照品溶液及内标溶液的配制:精密称取约
25 mg Sal A 置 50 mL 容量瓶中,用流动相溶解稀
释至刻度,得 500 g/ mL 的对照品贮备液, 以此来
配制系列浓度的对照品溶液。精密称取内标物桂皮
酸 25. 0 mg 溶于 250 mL 蒸馏水中, 精密量取 1. 0
mL 置 25 mL 容量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻度, 摇
匀, 得 4 g / mL 内标溶液。以上溶液均置冰箱中( 4
℃)保存备用。
2. 3 血浆样品预处理:取大鼠空白血浆 0. 1 mL 置
5. 0 mL 离心管中, 加0. 5 mol / L HCl 50 L, 超声振
荡 5 min,加入内标溶液 30 L,再加乙腈0. 4 mL 沉
淀蛋白,置混合器上涡旋 5 m in。离心( 3 000 r/ min)
10 m in, 吸取上清液,置 5 mL 具塞试管中,于 40 ℃
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收稿日期: 2001-08-06
水浴下氮气吹干,残余物中加入流动相 200 L, 超
声溶解, 离心( 2 000 r/ min) 5 m in, 取上清液 20 L
进样。
2. 4 系统适用性试验:在选定的条件下, 注入上述
血浆样品溶液,记录色谱图。按Sal A 计算得到色谱
柱的最小理论板数为 26 192,血浆中 Sal A 与桂皮
酸的分离度 R> 1. 5,拖尾因子为 0. 97,均符合药典
要求。
2. 5 方法专属性的考察:将实验动物的血浆按上述
方法处理后,取 20 L 注入高效液相色谱仪。同法处
理空白血浆样品,所得色谱图见图 1。可见,在上述
色谱条件下, Sal A 与内标物桂皮酸具有良好的分
离度,空白血浆对 Sal A 及内标物的分析测定无干
扰,因此本方法具有良好的专属性。
A -空白血浆 B-对照品溶液 C-血浆样品 * -Sal A * * -内标物桂皮酸
图 1 HPLC 图谱
2. 6 标准曲线的制备: 精密量取空白大鼠血浆 0. 1
mL, 分别加入 Sal A 系列贮备液, 使血浆浓度分别
为 10, 25, 50, 100, 150, 200, 300 g / mL,按上述样品
处理过程分析, 以 Sal A 与内标物峰面积比值为纵
坐标, Sal A 浓度为横坐标绘制标准曲线,计算得血
浆中 Sal A 的标准曲线方程为: Y = 0. 013 2X -
0. 027, r= 0. 999 3。
2. 7 最低检测浓度的测定:按峰高为基线噪音 3倍
计算,血浆中 Sal A 最低检测浓度为 2. 9 g / mL。
2. 8 精密度试验: 用空白血浆配制含 Sal A 25. 0,
100. 0, 300. 0 g / mL 样品各 5管,分别计算日内精
密度和日间精密度,结果见表 1。
表 1 血浆中 Sal A的精密度试验( n= 5)
浓 度
( g/ mL)
日内精密度
均值(% ) RSD ( % )
日间精密度
均值( % ) RSD ( % )
25 23. 6 4. 4 24. 5 8. 4
100 98. 3 2. 5 95. 8 2. 0
300 297. 4 1. 4 288. 4 1. 4
2. 9 回收率试验:分别于空白血浆中准确加入一定
量的Sal A,按上述处理及分析方法测定,重复4次,
测定结果与标准曲线中的相应浓度比较, 得方法回
收率。用未经试验处理的Sal A 对照品溶液 25, 100,
300 g/ mL 浓度在已确定 HPLC 条件下测定, 计算
绝对回收率。结果见表 2。
结果表明, Sal A 在血浆中的绝对回收率较高,
均在 83%以上,方法回收率在 98. 9%～106. 9% ,能
够满足测定要求。
表 2 回收率试验结果( n= 4)
浓 度
( g /m L)
方法回收率
均值( % ) R SD ( % )
绝对回收率
均值( % ) R SD ( % )
25 98. 9 1. 6 83. 0 2. 3
100 100. 8 2. 3 85. 0 3. 3
300 106. 9 4. 8 87. 5 2. 5
3 讨论
本实验考察了乙腈与水不同比例组成的流动相
及加入不同的缓冲液调整流动相 pH, 以甲酸调 pH
值的分离效果最好。当甲酸调 pH 为 2. 5时, Sal A
的保留时间约为 10. 5 min, Sal A 及内标与血浆中
的内源性物质得到良好的分离。
血浆预处理过程中,如果不加 0. 5 mol/ L HCl
50 L, 则药物峰不出现, 可能是药物与血浆蛋白有
一定结合的原因,当酸化后,药物则游离出来。
血浆的预处理方法一般采用提取法和沉淀法,
本实验采用乙醚或乙酸乙酯为溶媒提取不如以乙腈
为溶媒沉淀血浆处理后所测 Sal A 的回收率高。
致谢:实验过程中得到本校天然药化教研室李
铣教授、王金辉副教授的大力支持,深表感谢。
参考文献:
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HPLC法测定不同品种柴胡中的柴胡皂苷 a、c、d的含量
茅仁刚1 ,林东昊1 ,王智华2,洪筱坤2,潘胜利3
( 1. 上海师范大学新康制药厂,上海 200234; 2. 上海中医药大学中药学院, 上海 200032;
3. 复旦大学药学院,上海 200032)
摘 要: 目的 考察不同品种柴胡中柴胡皂苷 a、c、d 的含量, 以期扩大柴胡药用品种的范围。方法 采用 RP-
HPLC 法, 使用 LUNA C18柱、乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,检测波长为 210 nm ,以柴胡皂苷 a、c、d 含量为指标
进行比较。结果 不同品种柴胡中的柴胡皂苷 a、c、d 含量差异悬殊,其中云南会泽产多枝柴胡中的含量最高。结论
研究所建立的方法适合不同品种柴胡中柴胡皂苷 a、c、d 的定量分析 ,并且结果准确可靠。
关键词: 柴胡;品种; 柴胡皂苷 a、c、d; HPLC 法
中图分类号: R282. 2; R286. 02 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0412 03
Quantitative analysis of saikosaponin a, c, d in different species
of Radix Bupleuri by HPLC
MAO Ren-gang
1
, L IN Dong-hao
1
, WANG Zhi-hua
2
, HONG Xiao-kun
2
, PA N Sheng-li
3
( 1. Xinkang Pharm aceutica l Factor y, Shanghai Normal Univ ersity , Shangha i 200234, China;
2. Co lleg e of T CM , Shanghai Univer sity of T CM , Shanghai 200032, China;
3. Pharmaceutical Co llege , Fudan Univer sity , Shanghai 200032, China)
Abstract: Object To observe the content of saiko saponin a, c, d ( ss a, ss c, ss d) in different
species of Radix B up leuri and exploit the medical use of them . Methods An opt imal RP-HPLC method
w as set up. The samples w er e separated by LUNA C18 column w ith acetonit rile-w ater as mobile phase in a
gr adient elution, and detected with U V 210 nm . Comparison w as done w ith the index of ss a, ss c, ss d.
Results The amount of ss a, ss c, ss d in a variety o f species w as remarkably dif ferent . Among tho se,
the content o f Bup leurum poly clonum Y. Li et S. L . Pan yielded in Huize, Yunnan Province w as the high-
est . Conclusion The HPLC method is suitable and accurate for the quant itat ive analy sis of ss a, ss c, ss
d in dif ferent species of Radix Bup leur i.
Key words : Radix Bup leuri ; species; saikosaponin a, c, d ( ss a, ss c, ss d) ; HPLC method
柴胡是伞形科( Umbelliferae)柴胡属( Bup leu-
rum L. )植物的干燥根, 具有解表和里、疏肝解郁、
升举阳气之功效, 为中医治疗少阳证的首选要药。
《中华人民共和国药典》2000 年版规定北柴胡 Bu-
p leurum chinense DC. 和狭叶柴胡 Bup leur um scor-
z onerif olium Willd. (习称南柴胡、红柴胡)为正品。
然而由于我国柴胡属植物品种众多, 除海南外, 全国
各地均有分布 [ 1] , 各地对柴胡的用药品种意见不一,
加之近年柴胡出口转畅,内需增加, 市场需求量较
大,而野生资源量减少,人工栽培生产周期长、产量
低,因此根据当地所产柴胡而作为习惯用药的较为
普遍, 各地供以药用的除南、北柴胡外还有同属 20
余个品种[ 2]。为考察不同品种柴胡的质量,本研究采
用 RP-HPLC法对 23种柴胡样品中柴胡皂苷 a、c、d
( saikosaponin a、c、d,简称 ss a、ss c、ss d)进行了定
量分析。
1 仪器和材料
1. 1 仪器、药品: PERKIN ELMER高效液相色谱
仪( ser ies 200 LC泵、DAD 235 C 型检测器)。甲醇、
乙腈(均为国产色谱纯) , 氨水(国产分析纯) , 柴胡皂
苷 a、c、d 对照品由上海医药工业研究院提供。
1. 2 实验材料:不同品种柴胡共 23个样品, 由复旦
大学药学院潘胜利教授鉴定和提供。
2 实验方法及结果
·412· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 5期
收稿日期: 2001-08-07作者简介:茅仁刚( 1968-)男,上海人,工程师,硕士,现任上海师范大学新康制药厂技术副厂长,主要从事中药、天然产物活性成分和制剂研究。T el : ( 021) 64322290 E-m ail : rgm ao@ eas tday. com