全 文 ：HPLC-MS在麝香酮分析中的应用
张皓冰 1 ,陶　奕 1 ,洪筱坤 2 ,王智华 2
( 1. 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 ,上海　 200025;　 2. 上海中医药大学中药学院 ,上海　 200032)
摘　要: 目的　测定制剂中麝香酮含量。 方法　标准加入法、 2, 4-二硝基苯腙 ( DNP)衍生化法及高效液相 /电喷雾 -
串联质谱法。 结果　根据标准品麝香酮腙特有的质谱图对样品中的麝香酮进行了鉴别 ,并在优化的高效液相及质
谱条件下观察到了 [M+ H]+ 峰及其特征碎片峰。 ESI及 APCI对 m /z 419作 M S /MS全扫描质谱图有相同的相对
分子质量及断裂方式。回收率 102. 5% , RSD≤ 2. 76% (n= 5)。结论　本方法可同时实现麝香酮的定性和定量分析。
关键词: 麝香酮 ;标准加入法 ;液相色谱 -质谱联用法
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 11 0970 04
Application of HPLC-MS to analysis of muscone
ZHANG Hao-bing
1
, T AO Yi
1
, HONG Xiao-kun
2
, WANG Zhi-hua
2
( 1. Institute fo r Para sitic Disea se Contro l and Prevention, Chinese Cente r fo r Disease Cont rol and Prevention, Shanghai
200025, China; 2. Colleg e of Chinese Mate ria M edica , Shanghai Univ er sity o f TCM , Shanghai 200032, China)
Abstract: Object　 To determine the content of muscone in preparation. Methods　 Standard addi tion,
DN P deriv ati za tion and HPLC with elect rospray ionization tandem mass spect rometry ( LC /ESI-M S /M S)
w ere uti li zed. Results　 Identification o f muscone hydrazone in the sample was based on the unique mass
spect ra of the standard. Under an optimum condi tion peak cor responding to [M+ H ]+ ion and cha racteris-
tic f ragments fo r muscone hydrazone w ere observ ed. ESI and APCI full scan m /z 419 M S /M S had the
same rela tiv e molecular mass and fragmenta tion pat tern. The recovery w as 102. 5% with RSD≤ 2. 76%
(n= 5) . Conclusion　 The quali tativ e and quanti tativ e determination on muscone could be fulfilled simulta-
neously.
Key words: muscone; standard addi tion; HPLC-M S
　　麝香 ( musk)自古以来就是一种名贵的香料与
中药。 其芳香气味主要来源于其中所含的麝香酮
( muscone)。药理研究表明 ,麝香酮是天然麝香中的
重要生理活性成分 [1 ] ,它的含量是评价主含麝香药
品质量的重要指标之一。
关于麝香酮的含量测定方法 ,文献报道采用
GC
[2, 3 ]
,也有柱前衍生化后进行 HPLC[4 ] , TLCS[ 5]
以及收集 HPLC洗脱液作 EI-M S分析。本研究以麝
香醒脑液原液为样品 ,利用 2, 4-二硝基苯肼与样品
中的麝香酮进行衍生化反应 ,并通过标准加入法 ,采
用液相 -质谱 ( HPLC /M S)联用技术 ,测定样品中麝
香酮的含量。 本实验同时实现了麝香酮的定性与定
量分析。
1　实验部分
1. 1　药品与仪器: 麝香醒脑液原液 ,成都市药物制
剂研究所 ;麝香酮 ,中国药品生物制品检定所 ;乙腈
( AR) E. M erck公司 ; 2, 4-二硝基苯肼 ( AR) ,上海
试剂三厂 ; Finigan LCQ离子阱液相-质谱联用仪 ;
TSP UV 6000检测器 ; ESI离子源 ; Iner tsil ODS-3
( 5μm, 2. 1 mm× 150 mm)色谱柱。
1. 2　标准溶液的配制
1. 2. 1　麝香酮标准储备液的配制:取 200 mg麝香
酮对照品 ,溶解于 50 mL乙腈中 ,配制成 4 mg /mL
的麝香酮标准储备液。
1. 2. 2　 2, 4-二硝基苯肼溶液的配制: 称取 500 mg
2, 4-二硝基苯肼 ( DN PH) ,加入浓硫酸 -水-乙醇 ( 2∶
3∶ 10)混合液 30 m L,摇匀 ,待溶解后滤过备用 ( 2 d
内使用 )。
1. 3　衍生物的制备及待测溶液的配制
1. 3. 1　标准品衍生物溶液的制备: 精密量取 0. 5
·970· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 11期
收稿日期: 2002-02-16作者简介:张皓冰 ( 1962-) ,女 ,四川人 ,副研究员 ,上海中医药大学博士生 ,研究方向为中药质量分析。
Tel: ( 021) 64377008-2603　　 E-mai l: zhangh aobing@ yahoo. com
m L麝香酮标准储备液 (含 2 mg麝香酮对照品 ) ,加
入上述 2, 4-二硝基苯肼溶液 1 mL,混匀后于室温静
置 1 h,待结晶完全析出后 ,抽滤 ,沉淀在减压下水
洗至中性 ,抽干并溶解于 5 mL乙腈中 (溶液Ⅰ ) ,进
行 MS、M S2、 MS3及 HPLC /M S分析。
1. 3. 2　样品衍生物的制备: 精密量取 0. 5 mL麝香
醒脑液原液 ,加入上述 2, 4-二硝基苯肼溶液 1 mL,
混匀后于室温静置 1 h,待固体完全析出后抽滤 ,沉
淀在减压下水洗至中性 ,抽干后溶于 5 m L乙腈中
(溶液Ⅱ ) ,进行 HPLC-M S分析。
1. 3. 3　样品加标准品后衍生物的制备: 精密量取
0. 5 mL麝香醒脑液原液 ,加入 0. 5 mL麝香酮标准
储备液和 2 mL 2, 4-二硝基苯肼溶液 ,混匀后于室
温静置 1 h,待固体完全析出后抽滤 ,减压下沉淀水
洗至中性 ,抽干后溶于 5 mL乙腈中 (溶液Ⅲ ) ,进行
HPLC-M S分析。
2　HPLC /MS分析
2. 1　标准品衍生物溶液 (溶液Ⅰ )的 M S, M S2及
MS
3分析: 进样方式: Sy ringe Pump;进样速度: 3
μL/min;质谱条件: 一级质谱: EIS源 ,源电压 4. 25
kV ,正离子检测 ,毛细管温度 200℃ ,鞘气 ( N2 ) ,流
速 60 au,辅助气 ( He) ,流速 10 au。 二级、三级质谱
相对碰撞能量 25%。
在本研究中 ,标准品进行衍生化后 ,通过简单的
分离并配制成溶液Ⅰ ,从其一级质谱图中 DN PH的
[M+ H ]
+ ( m /z 199)特征峰的存在与否来判断是否
有 DN PH残留。图 1-A是对照品麝香酮腙一级质谱
图。从谱图中基本上只能观察到 m /z 419,为麝香酮
腙的 [M+ H]+ 峰。图 1-A从 m /z 50～ 250局部放大
(图 2) ,仍然观察不到 DN PH的有关特征峰。从局部
放大图还给出了规律性很强的碎片信息。
　　进一步作 m /z 419全扫描二级质谱图 (图 1-B) ,
A-麝香酮腙 (溶液Ⅰ ) E SI　 B-m /z 419 MS2　 C-m /z 236 M S3
图 1　全扫描质谱图
图 2　图 1-A(MS一级全扫描图 )m /z50至 250放大图
基峰为 m /z 236,低质量区碎片离子与图 2所给出
的碎片模型相同 ,而 m /z 236的三级质谱图更加清
楚地表明了上述低质量碎片的产生过程 ,应该来自
于 m /z 236碎片离子。m /z 419→ 236的可能断裂方
式图 3所示:
图 3　麝香酮腙的可能断裂方式
图 1-C为 m /z 236全扫描三级质谱图谱 ,其片
段质荷比 m /z 194→ 180→ 166→ 152→ 138→ 124→
110之差等于 14或其倍数 ,为 ( -CH2-) n中性丢失 ,
体现了脂环族化合物的裂解规律。
2. 2　 HPLC分离效果及结构确证
2. 2. 1　分析条件: HPLC分析条件: Iner tsil ODS-3
( 5μm, 2. 1 mm× 150 mm)微型柱 , 98%乙腈 -水为
流动相 ,流速为 0. 4 mL /min, 230～ 370 nm扫描 ,进
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样量 20μL。
质谱条件: 正离子检测 ,源电压 4. 25 kV ,毛细
管温度 200℃ ,鞘气 ( N2 )流速 60 au,辅助气 ( He)流
速 10 au。
2. 2. 2　 HPLC /M S分析:分别精密量取 50μL溶液
Ⅰ 、溶液Ⅱ及溶液Ⅲ ,各加入 150μL乙腈 ,混匀。
HPLC /M S分析如图 4～ 6。
A-麝香酮腙 (溶液Ⅰ ) HPLC图　 B-A图 tR= 5. 35、 5. 05及 5. 65
min 230～ 370 nm UV全扫描图　 C-ES I m /z 419单离子监测色
谱图　 D-C图相应的 ESI全扫描质谱图
图 4　麝香酮腙 HPLC /UV及 HPLC/ESI-MS图谱
　　图 4～ 6分别为溶液Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ的 HPLC色谱
图、相应的 UV扫描图、 [M+ H ]+ (麝香酮腙准子分
子离子 )单离子监测 ( sing le ionic moni toring , SIM )
色谱图及其相应的质谱图。 在 HPLC图中 ,取 tR-
0. 3, tR , tR+ 0. 3 3个时间点的 UV全扫描图。 由于
ESI离子源对该化合物的电离状况不佳 , LC /M S /
M S难以观察到 m /z 419片段的二级电离。 但如采
用 APCI离子源 ,则可获较为理想的 LC /M S /M S
图谱 (图 7)。 标准溶液及样品溶液的 m /z 419 M S /
M S全扫描图谱与图 1-B一致。说明标准溶液及样
品溶液中的待分析组分为同一化合物麝香酮腙。
3　结果与讨论
A-样品腙 HPLC图 (溶液Ⅱ )　 B-A图 tR= 5. 35, 5. 05及 5. 65
min 230～ 370 nm UV全扫描图　 C-ESI m /z 419单离子监测色
谱图　 D-C图相应的 ES I全扫描质谱图
图 5　样品腙 HPLC /UV及 HPLC/ESI-MS图谱
3. 1　实验中所采用的衍生化学方法简单易行 ,反应
稳定。反应体系中麝香酮腙以沉淀析出 ,而 2, 4-二
硝基苯肼仍存留于溶液中 ,因而只需进行抽滤便可
将二者完全分离 ,无论对标准品还是样品均毋需再
采用重结晶或层析等其他分离手段。我们也曾经采
用文献中所报道的方法 [3 ]进行麝香酮的衍生化实
验 ,但由于 DN PH在此反应中溶解度较小 ,随麝香
酮腙的生成一起沉淀出来 ,难以分离。在文献 [4 ]中所
报道的样品 HPLC谱图中 3 min左右有明显的
DN PH色谱峰 ,本研究中 HPLC色谱图或质谱图中
均观察不到 DN PH残留。
3. 2　本实验采用标准加入法 ,旨在补偿待测组分在
衍生化过程中的损失。在 HPLC图谱上 ,可观察到
溶液Ⅰ与溶液Ⅱ中待测组分峰面积之和与溶液Ⅲ中
待测组分峰面积基本相等 (回收率 102. 5% ,n= 5) ,
说明用该法定量结论可信。
3. 3　 3种溶液 HPLC峰形规则 ,保留时间相等或相
近 ,分别取其 tR- 0. 3, tR , tR+ 0. 3 3个时间点的 UV
·972· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 11期
A-加入麝香标准品的样品腙 HPLC图 (溶液Ⅲ )　 B-A图 tR=
5. 33、 5. 03及 5. 63 min 230～ 370 nm UV全扫描图　 C-E SI m /
z 419单离子监测色谱图　 D-C图相应的 ESI全扫描质谱图
图 6　加入麝香酮标准品的样品腙 HPLC/UV
及 HPLC /ESI-MS图谱
扫描图谱 ,峰形一致 ,峰纯度高。质谱图中 m /z 419
片段为麝香酮腙准分子离子峰。各待测液均连续 5
次进样 , RSD≤ 2. 76% (n= 5)。
3. 4　测定结果按下式计算 [6, 7 ]:
W =
ΔWΔA× A
W -样品中待测组分的含量 ;ΔW -加入的待测组分量 ;
ΔA-加入待测组分前后所测的峰面积之差 ; A-样品中待测组
分的峰面积 ;
即: W = 4 mg478 717 3- 210 822 8× 210 822 8
= 3. 15 mg /m L
麝香酮注射液原液中麝香酮含量为 3. 15
mg /m L。
3. 5　本法用 MS定量时 ,采用 ESI离子源 ,麝香酮
腙电离状况不佳 ,误差较大。 采用 APCI离子源 ,以
419→ 236离子流峰面积定量 ,结果与本法相近。
3. 6　流动相如采用 92%乙腈 -水、 95%乙腈 -水也可
得到较好的分离效果 ,但 tR延长 ,峰形展宽 ,采用
98%乙腈-水流动相峰形好 ,分析时间短。进样器、色
A-麝香酮腙 LC /APC I-M S2 m /z 419单离子监测色谱图
B-A图相应峰 m /z 419 M S /M S全扫描质谱图
图 7　麝香酮腙 HPLC /APCI-MS2图谱
谱柱、离子源及离子阱等均无明显残留。
3. 7　采用标准曲线法时 ,麝香酮腙在 0. 44～ 47. 2
μg /mL峰面积与浓度呈线性关系 ,线性方程为 Y=
35 819. 6+ 23 371. 5X , r= 0. 999 9,有关方法学研
究的具体实验数据本文不再详述。麝香酮衍生化后 ,
分析体系简化 , HPLC分离条件亦相应简化。有 UV
吸收 ,最大吸收波长在 231 nm及 367 nm。 LC /M S
联用从定性及定量两方面证实该法的可靠性 ,由此
可拓宽 HPLC的分析范围。
参考文献:
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