全 文 ：g ene s equence for identi fication of th ree gins eng d rug s [ J ] .
Biol Pharm Bull , 1997, 20( 7): 765-769.
[11 ]　曹　晖 ,刘玉萍 ,伏见裕利 ,等 . 三七及其伪品的 DN A测序
鉴别 [ J ]. 中药材 , 2001, ( 6): 398
[12 ]　曹　晖 ,刘玉萍 ,张绍来 ,等 . 塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因
18S r RNA序列测定与分析 [ J ]. 中国中药杂志 , 2001, 26( 2 ):
90-94.
[13 ]　陈月琴 ,屈良鹄 ,周　惠 ,等 . 杜仲原植物 25S rRN A5’ 端序列
分析及其分子识别 [ J ]. 中国中药杂志 , 1998, 23( 12): 707-709.
[14 ]　曹　晖 ,刘玉萍 ,毕培曦 ,等 . 中药半夏的 DN A分析与分子
鉴别 [ A] .中国药学杂志编辑部 . 现代药物分析论坛 [ C ]. 北
京:新华出版社 , 2001.
[15 ]　中国药典 [S ]. 2000年版 . 一部 .
[16 ]　 Wu Z Y, Rav en P H. Flora of China [M ] . V ol. 24. Bei jing:
Science Press and St Louis: M is sou ri Botanical Gard en
Pres s, 2000.
[17 ]　黄燮才 ,韦家福 ,陆敏仪 . 广西中药材标准 [ S ]. 第 2册 . 南
宁:广西壮族自治区卫生厅 , 1996.
[18 ]　广西中医药研究所 . 广西药用植物名录 [ M ] . 南宁:广西人
民出版社 , 1986.
[19 ]　 Sogin M L. Ampli fication of ribos omal RN A g enes for
molecular evolution studies [A ] . In: Innis M , Gelfand D,
Sninksky J, et al . eds. PCR Protocols: A Guide to Meth-
ods and Application [ M ] . San Dieg o: Academic Press ,
1990.
[20 ]　 White T J, Bruns T, Lee S, et al . Ampli fication and direct
s equencing of fungal ribos omal RN A genes for ph ylogenet ics
[ A]. In: Innis M , Gelfand D, Sninksky J, et al . eds. PCR
Protocols: A Guide to Meth od s and Application [M ] . San
Diego: Academic Press , 1990.
[21 ]　 Cao H, But P P H, Sh aw P C. Meth od ological s tudies on ge-
nomic DNA ex t raction and pu rif icat ion f rom plant drug mate-
rials [ J ]. J Chin Pharm Sci , 1998, 7: 130-136.
[22 ]　叶　强 . 广西多来源药材及混杂品种的调查及考证 [M ]. 南
宁:广西科技出版社 , 1989.
[ 23 ]　广西卫生厅 . 广西中药志 [M ] . 南宁: 广西人民出版社 ,
1959.
[ 24 ]　 Hershkovit z M , Hahn W J, Zimmer E A. Ribosomal DN A
sequences and plant sys tematics [ OB /OL ] h t tp: / /w ww.
ncbi. nlm. nih. g ov /ent rez /query? bd= GenBank , 1998-7-26.
[25 ]　赵冰 .山药栽培新技术 [M ]. 北京:金盾出版社 , 1998.
[26 ]　洪德元 .植物细胞分类学 [M ]. 北京:科学出版社 , 1990.
[ 27 ]　李竟雄 ,宋同明 .植物细胞遗传学 [ M ] . 北京:科学出版社 ,
1993.
药用植物粉花绣线菊的组织培养的建立与快速繁殖研究
胡益明 ,甘烦远* ,彭丽萍 ,郝小江
⒇
(中国科学院昆明植物所 ,云南 昆明　 650204)
摘　要: 目的　建立了粉花绣线菊 Spiraea japonica L. f. 愈伤培养系统和快速繁殖方法。方法　通过用 M S、 6, 7-
V、 B5等 3种不同的培养基对粉花绣线菊植株的茎尖、嫩叶、叶柄等不同部位进行愈伤组织诱导和成苗诱导。 结果
　通过本研究 ,建立了愈伤培养系统 ,实现了快速繁殖。 结论　 M S培养基诱导愈伤效果最好 ,在 M S+ 2, 4-D 2. 0
mg / L+ K T 0. 3 mg /L培养基中 ,幼叶、茎尖、叶柄等外植体均能诱导出愈伤组织 ,其中以茎尖外植体诱导的效果最
好 ;茎尖外植体在 M S+ 2 mg /L BA+ 0. 1 mg /L NAA能长出丛生苗 ,将丛生苗转入培养基 1 /2M S+ 0. 25 mg /L
BA+ 0. 5 mg /L NAA可生根成小苗。
关键词: 粉花绣线菊 ;组织培养 ;快速繁殖
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1030 04
Studies on establishment of calli culture for rapid propagation of Spiraea japonica
HU Yi-ming , GAN Fan-yuan, PENG Li-ping , HAO Xiao-jiang
　　 ( Kunming Institute of Botany , Chinese Academy o f Sciences, Kunming Yunnan 650204, China )
Abstract: Object　 To establish a calli culture system for the rapid propagation of Speiraea japonica
L. f. . Methods　 Callus and shoo t induction w ere ca rried out on M S, 6, 7-V o r B5 media wi th dif ferent
parts of the plant such as stem tip, tender leaves and petiole as explants. Results　 A calli culture system
w as established for the rapid propaga tion of S. japonica. Conclusion　 MS cultural medium was found to
be most sui table fo r calli induction. M S wi th 2. 0 mg /L 2, 4-D+ 0. 3 mg /L KT can induce calli when the
explants w ere used fo r the induction, wi th stem tips being the most sa tisfacto ry explant. Clusters of
seedling s can be induced on M S+ 2 mg /L BA+ 0. 1 mg /L N A A and when these seedling s w ere t ransfer red
to 1 /2 M S+ 0. 25 mg /L BA+ 0. 5 mg /L N AA medium, roo t were developed to giv e young seedling s. -
Key words: Spiraea japonica L. f. ; cullus t issue; rapid propagation
·1030· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
收稿日期: 2001-01-19基金项目:国家自然科学基金 ( 30070087)资助 ;中国科学院资源与生态环境研究重点项目 ( KZ952-31-108)经费资助作者简介:胡益明 ( 1971-) ,男 ,湖北人 ,现为中国科学院昆明植物研究所硕博连读生。研究方向:中药重要成分的生物合成。 E-mai l: Hyiming
@ yahoo. com
* 通讯联系人　 Tel: 0871-5223111
　　粉花绣线菊 Spiraea japonica L. f.又名土黄
连、火烧尖 ,为蔷薇科绣线菊属植物。落叶灌木 ,高可
达 1. 5 m。根、叶、果实都可入药。民间常用于通经、
通便、利尿、止咳、明目、镇痛 ,主治月经不调、痢疾、
咳嗽、头痛、慢性脊髓炎等疾病 [ 1]。
粉花绣线菊的化学成分研究起于 1964年 ,前苏
联学者 Frolov a等人报道了该植物中的二萜生物
碱 ,此后至今一直有对此植物化学成分的报道。从报
道的结果看 ,其化学成分皆为 a tisine和 hetisine型
生物碱 [2 ]。我们课题组自 1987年开始对该植物的化
学成分进行了系统的化学研究 ,从中分离得到了 26
种新的 atisine型二萜生物碱和 7个新的 a tisane型
二萜。 经药理实验证明这些二萜生物碱和二萜都有
一定的抗血小板凝集 ( anti-PAF)作用 [3 ]。我们已先
后报道了生物碱 spi ramine Q的 anti-PAF和抗炎
症活性 [4 ] ,生物碱 spi ramine T的神经保护作用 [5 ]。
为了研究二萜生物碱的生物合成途径 ,扩大这
类二萜生物碱的来源 ,我们进行该植物的组织培养
的研究。试图通过建立各种组织培养体系 ,利用生物
技术、饲喂前体 ,来弄清二萜生物碱生物合成途径。
作者用 MS、 6, 7-V、 B5等 3种不同的培养基粉花绣
线菊植株的茎尖、嫩叶、叶柄等不同部位进行愈伤组
织诱导 ,首次成功地诱导了该植物愈伤组织 ,并考察
了各种培养因子的作用与影响 ,确定了最佳培养基 ;
同时还实现了该植物的快速繁殖。粉化绣线菊的组
织培养工作国内外未见报道 ,本文初次报道这一工
作。
1　材料和方法
1. 1　材料:取自昆明市西山 ,由中国科学院昆明植
物所植物园的龚洵副研究员鉴定。
1. 1. 1　无菌外植体的来源:取茎段、茎尖、叶柄或鲜
嫩叶片加洗衣粉漂洗 30 min,自来水冲洗 3次后用
蒸馏水洗 3次。在超净工作台上用 70%酒精消毒 1
min, 0. 2% HgCl2消毒 5 min,无菌水冲洗多次。叶
片剪成 0. 5 cm× 0. 5 cm大小 ,茎段及叶柄剪成
0. 5～ 1 cm长。
1. 1. 2　所有的培养基均经 121℃ , 0. 1 M Pa消毒
20 min。
1. 2　方法
1. 2. 1　丛生芽的诱导与增殖:将上述茎尖、叶柄、叶
片等外植体按 5片 (或个 ) /瓶 ,分别接种到 3× 15瓶
( 50 mL小三角瓶 ) M S、 6, 7-V、 B5 3种基本培养基
中 ,这三种培养基中 ,都添加 2 mg /L BA和 0. 1
mg /L N AA, 3%蔗糖 , 0. 7%琼脂粉 , p H 5. 8,培养
温度为 23℃～ 27℃ ,光照 10～ 12 h /d,光强 2 000
lx。 30 d后 ,选择长势良好的小苗 ,转入增殖培养基
MS+ 0. 25 mg /L BA+ 0. 1 mg /L N AA。
1. 2. 2　生根培养与试管苗的移栽:将在芽增殖培养
基中正常生长的新芽切下 ,转至培养基 1 /2 M S+
0. 25mg /L BA+ 0. 5 mg /L N AA中 ,光照 30 d后。
试管苗出瓶前 3 d,打开瓶塞在培养室内进行炼苗
后 ,植入过渡栽培基质。 30 d后 ,移栽至温室培养。
1. 2. 3　愈伤组织的诱导培养:
1)基本培养基的考察: 选择 3种常见的培养基
MS、 6, 7-V、 B5附加 2, 4-D 2. 0 mg /L+ KT 0. 3mg /
L,将上述不同部位的外植体按 5片 (或个 ) /瓶混合
均匀地接入 3× 15瓶中 ( 50 mL小三角瓶装 25 mL
相应的培养基 )进行处理。重复 3次。与丛生芽的诱
导中所使用的条件不同的是—暗培养 ,不需光照。培
养 30 d,统计外植体的诱导情况。
2)不同部位的外植体的诱导效果考察:上述不
同部位的外植体按 5片 (或个 ) /瓶 ,按类别接入培养
基 MS附加 2, 4-D 2. 0 mg /L+ KT 0. 3 mg /L,每类
外植体都接 15瓶 ,其它条件同上。培养 30 d,统计外
植体的诱导情况。重复 3次。
3)不同激素配比对愈伤的诱导: 用茎尖作外植
体 , M S为基本培养基 ,改变不同激素的配比 ,培养
30 d,统计外植体的诱导情况。 重复 3次。
2　结果与分析
2. 1　基本培养基的选择: 由表 1可看出 , M S培养
基最适合愈伤的诱导 ,诱导率达 80% ; 6, 7-V次之 ,
诱导率为 33. 3% ; B5培养基最差 ,诱导率为 24% 。
MS培养基为富集元素平衡培养基 ,有较高含量的
氮盐 ,适于外植体的脱分化。 B5培养基为 KNO3含
量高的培养基 ,而它的诱导效果比 6, 7-V差 ,说明:
愈伤诱导不仅需要较高含量的氮盐 ,而且 NH4+ /
NO3
- 比例要高 ( M S培养基 NH4+ /NO3- 比是
20. 62 /39. 41总氮量是 60. 03 mmol /L,而 B5培养
基相应是 2. 00 /25. 00, 27. 03; 6, 7-V培养基相应是
1. 514 /7. 914, 9. 4)。 一般来说 ,还原态氮 ( N H4+ )对
外植体的脱分化成愈伤组织有利 ,且不能被硝态氮
( NO3
- )所代替。
表 1　不同培养基对粉花绣线菊愈伤诱导的影响　%　
培　养　基
M S 6, 7-V B5
外植体的诱导率 80 33. 3 24
2. 2　不同部位的外植体的诱导效果不同。在 MS附
加 2, 4-D 2. 0 mg /L和 KT 0. 3 mg /L培养基中 ,幼
·1031·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
叶、茎尖、叶柄等外植体均能诱导出愈伤组织 ,其中
以茎尖外植体诱导的效果最好。具体情况见表 2。因
此 ,本实验选用茎尖作为外植体来诱导愈伤组织。
表 2　不同的部位的愈伤诱导率 %　
幼叶 叶柄 茎尖
诱导率 23. 3 35. 6 80
2. 3　不同激素配比对愈伤的诱导: 用茎尖作外植
体 , M S为基本培养基 ,附加不同配比激素组合 ,培
养 30 d,诱导情况见表 3。 从表中可看到:激素对愈
伤的形成有重要的影响。 2, 4-D对愈伤的形成有很
强的诱导能力 ,而 IAA, N AA不能诱导出愈伤组
织 ,但较高的浓度的 2, 4-D易使外植体严重褐化而
死亡。 K T对愈伤的诱导起重要作用 ,但高浓度的
KT不利于愈伤的形成。因此 , 2, 4-D 2. 0 mg /L和
KT 0. 3 mg /L激素配比最适合愈伤的诱导 (图 1)。
图 1　粉花绣线菊的愈伤组织
2. 4　激素对丛生芽的诱导与增殖影响:上述 3种外
植体在 MS+ N AA 0. 1 mg /L+ BA 2. 0 mg /L培养
基以及光照条件下均能诱导出苗 ,其中 ,茎尖外植体
诱导效果最好。外植体 7 d后小芽萌发 , 15 d后并生
丛芽但产生玻璃化现象。调整激素配比将 BA由 2
mg /L降低到 0. 25 mg /L ,即转入 MS附加 NAA
0. 1 mg /L到 BA 0. 25 mg /L培养基中 ,玻璃苗消失
呈正常生长。形成玻璃化苗的原因 ,作者推测有以下
3点: ( 1) 6-BA的浓度过高 ,促使嫩苗产生不正常
的脱分化 ,因而使幼苗叶片形成不正常的气孔和保
卫细胞 ,易形成玻璃化苗 ; ( 2) 据文献报道 [6 ] ,培养
基中的氨态氮过高是导致玻璃苗产生和加剧的重要
因素之一。而 MS培养基属高含氮的培养基 ,易产生
玻璃苗 ; ( 3)小瓶的有限容积 ,使得瓶内的乙烯过饱
和而诱导了玻璃化苗的形成。 Kevers等 [ 7]的实验表
明 ,苹果砧木等的玻璃苗是由于过氧化物酶-吲哚乙
酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响 ,并认为细
胞激动素或 N H4+ 离子的过剩是一种最初的胁迫 ,
受胁迫的试管苗在乙烯过剩的空气中 ,抑制了乙烯
的生物合成 ,结果降低苯丙氨酸解氨酶 ( PAL)和酸
性过氧化物酶的活性 ,从而妨碍了组织木质化 ,导致
形成玻璃苗。 因此 ,降低 6-BA的浓度 ,转入到新的
培养基中 ,可抑制玻璃化苗的产生。
表 3　不同浓度配比的 2, 4-D和 KT组合以及
IAA、 NAA和 KT组合的愈伤诱导率　　　　%
( mg /L)
KT ( mg /L)
0. 1 0. 2 0. 3 0. 5 0. 6 0. 9 1
2, 4-D 1. 0 --　 12. 5 25　 16. 7 13. 3 12. 5 9. 4
1. 5 14. 8 30. 7 67. 5 37. 5 37. 5 49. 5 23. 7
2. 0 53. 2 66. 7 80　 72. 5 75. 5 66. 6 33. 6
3. 0 23. 5 39. 5 61. 5 56. 5 54. 5 24. 6 9　
5. 0 --　 --　 11　 9. 8 7. 6 --　 --　
7. 0 --　 0　 0　 0　 0　 0　 0　
IAA 2. 0 0　 --　 --　 --　 --　 0　 0　
NAA 2. 0 0　 0　 --　 --　 --　 0　 0　
　　 --表示很少 ,难以统计
2. 5　生根培养与试管苗的移栽:将在丛芽增殖培养
基中正常生长的新芽切下 ,转至培养基 1 /2 M S+
0. 25 mg /L BA+ 0. 5 mg /L N AA中 ,光照 10 d左
右 ,芽切口出现根 ,生成小苗 (图 2) , 30 d后植株生
长粗壮 ,生根率达 80% ,每株生根 3～ 8条。试管苗
出瓶前 3 d,打开瓶塞在培养室内进行炼苗后 ,植入
过渡栽培基质。栽培基质为珍珠岩混有少量腐殖土。
30 d后 ,可移栽至温室培养。 由于 2, 4-D很容易引
起愈伤组织的形成 ,所以避免用 2, 4-D,改用 IAA,
N AA。而 IAA在培养基中不稳定 ,所以选择用
图 2　已长出的试管苗
NAA
[8 ]。高浓度的 6-BA有利于诱导丛芽 ,但浓度太
高 ,易诱发玻璃苗。诱导丛芽以 6-BA和 NAA组合
效果较好 [9 ]。较高浓度的 NAA,能促进根的萌发 ,但
重要的是细胞生长素与细胞分裂素的合理配比 [10 ]。
实验还表明 [8 ] ,低盐培养基有利于生根。 因此采用
1 /2 M S培养基。减少蔗糖的含量有利于生根 ,所以
生根培养时 ,蔗糖浓度为 1. 0%～ 1. 5% [8 ]。 光照有
·1032· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
利于生根 ,增加光照强度 ,能刺激植株产生通过光合
作用而进行自养的能力 [8 ]。因此 ,需要 3 000 lx的光
强 ,并且日照时间为 16 h /d有利于炼苗。移栽之前 ,
要进行预栽培 ,要保持一定的温度、光照和湿度。这
样能提高成活率。 成活率可达 85%以上。
3　小结
从当前的趋势来看 ,组织培养应用于制药主要
有两个领域: ( 1) 生产天然的植物成分 ; ( 2)外供化
合物的生物转化。 我们现已建立了粉花绣线菊的组
织培养系统 ,下一步是借助它 ,通过饲喂前体 ,弄清
二萜生物碱的生物合成途径。从而达到大量生产的
目的。同时 ,粉花绣线菊的变异性强 ,品质不稳定 ,我
们建立的快繁技术可帮助大量生产。另外 ,我们还可
以利用愈伤组织诱导生成体细胞胚 ,进行种质保存。
相关的进一步研究工作正在进行之中。
参考文献:
[1 ]　江苏新医学院 . 中药大词典 [ M ] . 上海:上海科学技术出版
社 , 1978-1979, 1992.
[ 2 ]　郝小江 ,聂晶磊 ,孙　航 ,等 . 粉花绣线菊复合群的化学分类
[ J ]. 云南植物研究 , 1997, 19( 3): 297-303.
[3 ]　 Wang B G, Li L, Yang X S, et al . Th ree new diterp ene alka-
loids f rom Spiraea japonica [ J] . Heterocycles , 2000, 53: 1343-
1350.
[ 4]　 Sh en Z Q, Ch en Z H, Li L, et al . Antiplatelet and anti th rom-
bot ic effect s of the diterpene spi ramine Q from Spiraea japoni-
ca [ J] . Plan ta Medica, 2000, 66: 287-289.
[ 5 ]　 Li L, Nei J L, Sh en Z Q, et al . Neuroprotectiv e effect s in
Gerbils of spi ramine T f rom Spiraea japonica [ J ] . Plan ta
Medica, 2001, 67( 2): 142-145.
[6 ]　卜学贤 ,陈维伦 . 试管苗的玻璃化现象 [ J ]. 植物生理学通讯 ,
1987( 5): 13-18.
[ 7 ]　 Kevers C. Th. Gasp Soluble membrane and w all peroxidases
phenylalanine ammonia-lyase and lig nin changes in relation to
vi t ri fication of camation tis su e cultureed in vi t ro [ J ] . J Plant
Physiolog y, 1998, 118: 41-48.
[8 ]　李浚明 . 植物组织培养教程 [ M ] . 北京:中国农业大学出版
社 , 1996.
[9 ]　黄健秋 ,卫志明 . 松属树种的组织培养和原生质体培养 [ J ].
植物学通报 , 1994, 11( 1): 34.
[ 10 ]　颜昌敬 . 植物组织培养手册 [M ] . 上海:上海科学技术出版
社 , 1990.
良种银杏幼苗叶质量分析 (Ⅰ )
杨义芳 ,王　晖 ,夏野鹰
⒇
(江西省药物研究所 ,江西 南昌　 330029)
摘　要: 目的　进行良种银杏幼苗叶质量分析。方法　采用 HPLC方法测定银杏叶总黄酮含量。结果　实生苗 6月
份含量明显高于 8月份与 11月份 ,极显著地高于嫁接苗 ; 2岁树龄实生苗总黄酮含量是 50年树龄的 2. 5～ 3. 8倍。
嫁接苗 6月份高于 8月份 ,雌性高于雄性。 结论　活性成分含量与生长季节、树龄、培育方式、生长环境、基地条件
等诸因素有关。
关键词: 良种银杏幼苗叶 ;银杏黄酮 ;高效液相色谱 ;质量分析
中图分类号: R282. 2　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 1033 04
Analysis on quality of leaves of improvedGinkgo biloba seedling sproutⅠ
YAN G Yi-fang , WANG Hui, X IA Ye-ying
　　 ( Jiangxi Institute o f Mate ria M edica , Nanchang Jiangxi 330029, China)
Abstract: Object　 To examine the quality of leav es from the improved Ginkgo biloba L. seedling
sprout. Methods　 Total f lav onoids in the leaves w ere determined by HPLC. Results　 Flavonoids in the
leaves o f seedling sprout were apparent ly higher in June than in August and November, and w ere much
higher than g raf ting seedling sprout which was also higher in June than in August. 2-year-old t ree con-
tained 2. 5 to 3. 8 times mo re flavonoids than 50-year-o ld tree. The content of female trees w ere higher
than tha t of male. Conclusion　 The content o f active f lav onoids w ere rela ted to the season, ag e, breeding,
envi ronment and geog raphic condi tions, etc. .
Key words: leav es f rom improved Ginkgo biloba L. seedling sprout; flavonoids; HPLC; quali ty analy-
sis
　　银杏叶 Ginkgo biloba L. 产品风靡全球 ,在我 国就有数十种之多 ,银杏叶提取物干浸膏生产企业
·1033·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2000-06-23