全 文 ：度药物抑制下代谢过程的热谱图其形状基本相同 ,
但随着加入药物浓度的增加 ,其生长代谢过程的停
滞期延长 ,生长代谢峰向后移 ,且指数生长期的斜率
不同。
3. 2　从表 1中的 k值可以说明随着中药药液浓度
的增加 ,细菌生长受抑制的作用越大 ,从而可以定性
地刻划药液抗菌作用的程度 ;从图 3, 4可以得出参
叶的最小抑菌浓度为 0. 114 g /mL,参花为 0. 500
g /mL,从而可以定量地刻划中药抑菌作用的大小 ;
从表 1中 I值以及图 5可以得出参叶的半抑制率为
0. 046 g /mL,参花为 0. 275 g /mL,半抑制率的大小
反映了中药抑菌作用的差别。 参叶和参花的 k 值 ,
I% , IC50的综合分析说明人参的不同药用部位参叶
和参花 ,其药效存在着差异 ,参叶在浓度很低时就表
现出很强的抑菌作用 ,而参花的抑菌作用相对较弱 ,
药效的强弱从一个侧面反映了药性的差异。
3. 3　从图 1, 2中可见 ,在不同的药液浓度下 ,细菌
代谢过程的的热功率 -时间曲线与基线构成的面积
发生了变化 ,这种变化呈现出一定的规律性。在图 1
中 ,随着参叶浓度的增大 ,其热功率 -时间曲线下的
面积 (ΔH )呈逐渐减小的趋势 ;在图 2中 ,随着参花
浓度的增大 ,其热功率 -时间曲线下的面积 (ΔH )呈
逐渐增大的趋势 (表 1)。也就是说:参叶能降低细菌
生长代谢的产热量 ,参花能增加细菌生长代谢的产
热量 ,ΔH的大小体现了参叶和参花的药性差异 ,与
传统文献中所记载的“……参叶大苦大寒 ,损气败
血 ,……” ,“补中带表 ,大能生胃津 ,去暑气 ,将虚火
……”的提法基本相符 [ 8] ,可见细菌生长代谢的产热
量 (ΔH )可作为中药四性研究的一个重要指标。
3. 4　中药四性的微量量热法研究是我们在中医药
传统理论的指导下 ,结合生物热力学的先进技术所
做的有益的尝试 ,研究证明:该方法科学可行 ,突破
了传统四性研究中思想和方法的局限性 ,是定性定
量刻划中药四性的有效手段 ,还可作为中草药活性
筛选的新工具。
参考文献:
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昆明山海棠诱导 HL-60细胞凋亡的初步研究
敖　琳 ,曹　佳 ,孙华明 ,杨录军 ,刘胜学 ,周紫垣⒇
(第三军医大学 分子毒理实验室 ,重庆　 400038)
摘　要: 目的　探讨中药昆明山海棠 ( T HH)诱导急性白血病细胞凋亡的规律及发生机制。 方法　应用染料排除
法、活细胞荧光染色、 DN A电泳、流式细胞仪、斑点杂交、原位杂交和荧光 Ca2+指示剂进行检测和观察。结果　 HL-
60细胞在 THH作用下出现典型的细胞凋亡特征 ,包括细胞形态改变、 DNA梯状带以及亚 G1峰 ,并且存在明显的
量效和时效关系。 进一步研究表明 , Bcl-2基因在凋亡过程中的表达持续下调 ,细胞内游离 Ca2+ 浓度未发生明显变
化。 结论　 THH有较强的诱导白血病 HL-60细胞凋亡的能力 ,其作用机制与下调 Bcl-2基因表达有关。
关键词: 昆明山海棠 ;细胞凋亡 ; HL-60细胞
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0913 04
Preliminary studies on apoptos is of HL-60 cells induced byTripterygium hypoglaucum
AO Lin, CAO Jia , SUN Hua-ming , YAN G Lu-jun, LIU Sheng-xue, ZHO U Zi-huan
　　 ( Labo rato r y of Molecular Tox ico lo gy , Third M ilitar y Medical Univ er sity , Chongqing 400038, China)
Key words: Tripterygium hypoglaucum ( Lé v l. ) Lé v l. ex Hutch. ; apoptosis; HL-60 cells
·913·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
收稿日期: 2000-12-26基金项目:第三军医大学科研基金作者简介:敖　琳 ( 1971-) ,女 ,重庆市人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事分子毒理与遗传毒理研究。
　 　 昆 明 山 海 棠 Tripterygium hypoglaucum
( Lé v l. ) Lé v l. ex Hutch (简称 T HH) 是云南省特
产中药 ,中医临床上广泛用于治疗各种自身免疫性
疾病 ,同时 ,临床治疗及实验研究均表明 THH具有
明显的抗肿瘤效应 [1, 2 ]。由于缺乏对其作用机制的认
识 ,因而限制了 THH在临床的进一步应用。对细胞
凋亡及凋亡相关疾病的研究使人们认识到 ,由于细
胞增殖与死亡平衡的失调而造成的细胞凋亡不足可
诱发肿瘤、自身免疫性疾病等细胞增生性疾病。由
此 ,我们提出 , T HH的作用机制可能与诱导细胞凋
亡有关 ,并且首次报道了 T HH水提取液对 Jurkat、
CHE、 N IH3T3细胞均有较强的凋亡诱导作用 ,且
Jurkat白血病细胞更为敏感 [3 ]。因此 ,诱导细胞凋亡
可能是 T HH治疗自身免疫性疾病的机制 ,并提示
T HH有可能发展成为一种新的抗癌药物。 目前尚
缺乏对其他肿瘤细胞以及对 THH诱导细胞凋亡分
子机制的研究。 为此 ,本研究以人早幼粒白血病
HL-60细胞为材料 ,研究 T HH水提取液诱导 HL-
60细胞凋亡的发生情况 ,并初步探讨其分子机制。
1　材料
1. 1　药物: THH购自云南省医药公司 ,按本室常
规方法制备水提取液。取 T HH根块 100 g,粉碎后
加入 500 mL双蒸水浸泡 24 h,煮沸 3次 ,药液浓缩
成 150 mL,滤膜过滤除菌 ,分装后 - 20℃ 保存备
用。 THH水提取液每毫升含生药 0. 667 g ,使用剂
量分别为每毫升培养基 5, 10, 20, 40μL药液。
1. 2　细胞培养: HL-60细胞由本室保存 ,培养于
10% FCS RPM I 1640,传代至旺盛生长后 ,试验前调
整细胞浓度为 2× 105 /mL,台盼蓝鉴定细胞活性在
98% 以上。
1. 3　主要试剂:地高辛随机引物标记及检测试剂
盒 , T ripure Iso lation Regent以及 Fura-2 /AM 为
Boch公司产品。
2　方法
2. 1　细胞存活率测定:细胞经药物处理后 ,于规定
时间采样。加入台盼蓝染液至终浓度为 0. 4% ,染色
2～ 5 min后 ,滴片 ,计算细胞存活率。
2. 2　活细胞悬液荧光染色:细胞悬液中加入荧光染
液 Hoechst 33342至终浓度 10μmo l /L , PI至终浓
度 100 mg /L,避光染色 15 min,荧光显微镜下
观察。
2. 3　 DNA电泳分析: 每样品收集 1× 106个细胞 ,
加入 0. 5 mL细胞裂解液 ( 10 mmo l /L Tris· Cl,
10 mmol /L EDT A, pH 8. 0, 0. 5% SDS, 0. 1%
RNase A)置 37℃ 保温 1 h。加入蛋白酶 K至 100
mg /L, 50℃ 保温 3 h。 2% 琼脂糖凝胶电泳 5 h。
2. 4　流式细胞仪检测:细胞加入 70% 乙醇固定 24
h以上 ,实验前用 PBS洗去固定液 , 50 mg /L RNase
A 37℃ 消化 1 h, PI染色 30 min后上机检测 ,结果
用 LysisⅡ 软件分析。
2. 5　 Bcl-2基因表达分析: 利用斑点杂交和原位杂
交方法检测细胞内 Bcl-2 mRNA的表达。 Bcl-2探
针用地高辛随机引物法进行标记。按 Tripure Iso la-
tion regent说明书提取细胞总 RNA后 ,点样于硝
酸纤维膜上进行斑点杂交 ,利用薄层扫描仪检测各
阳性反应斑点的灰度值。细胞涂片经多聚甲醛固定 ,
蛋白酶 K消化 ,醋酸酐封闭后 ,与 1∶ 100 Bcl-2探
针 42℃ 杂交 16 h, Anti-Dig-Ap 37℃ 温育 1 h,最
后底物显色 30 min。 镜检计算阳性细胞比率。
2. 6　细胞内游离 Ca2+ 浓度 ( [Ca2+ ]i )的测定: 参
照文献进行 [4 ]。 细胞悬液加入 Fura-2 /AM至终浓
度 5μmol /L, 37℃ 温育 45 min, HBSS缓冲液洗 3
次。采用日立 F3010型荧光分光光度计测定荧光强
度。 激发光波长 350 nm,发射光波长 510 nm,狭缝
10 nm,检测静息荧光强度 Fo ;然后加入 Tri ton X-
100至终浓度 0. 1% ,检测最大荧光强度 Fmax ;最后
加入 EGT A至终浓度 10 nm,检测最小荧光强度
Fmin ,按以下公式计算细胞内游离 Ca2+浓度:
[ Ca
2+
]i= Kd( Fo- Fmin ) ( Fmax- Fo )
Kd= 224 nmol /L
2. 7　数据处理: 数据由第三军医大学数学教研室
SPM R软件包处理 ,主要采用单因素方差分析。
3　结果
3. 1　细胞活性检测结果: T HH能显著降低细胞存
活率 ,存在明显的量效和时效关系 ,各剂量组 ( 5～
40μL /mL) 随处理时间延长 ,细胞存活率逐渐降
低 ,且剂量越大 ,存活率下降的速度相应加快
(图 1)。
与对照组相比: * P < 0. 05
图 1　 THH水提取液对 HL-60细胞存活率的影响
3. 2　细胞形态观察: THH可诱导细胞出现典型的
·914· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
凋亡细胞形态 ,包括核固缩 ,染色质边集 ,核碎裂及
凋亡小体。
3. 3　 DNA电泳结果: T HH各剂量组均有典型的
梯状带出现 ,并且随剂量加大 ,梯状带出现的时间前
移。 5, 10及 20μL /mL组在 12 h开始出现梯状带 ,
而高剂量组 40μL /mL在实验全程均可观察到典型
的梯状带 (图 2)。
A-40μL /m L　 B-20μL /m L
1～ 3-依次为 4, 12, 24 h处理组
图 2　 THH水提取液处理 HL-60细胞的 DNA电泳结果
3. 4　凋亡细胞亚 G1峰检测结果: T HH处理后 ,凋
亡率显著升高 ,随时间推移 ,低剂量组 ( 5μL /mL)
凋亡率呈持续性增强趋势 ,其余各剂量组升高后则
维持较长时间的凋亡率高台期。此外 ,随 T HH剂量
增加 ,凋亡率上升的速度也随之加快 (图 3)。因此 ,
药物诱导的凋亡发生率存在明显的量效和时效关
系。图 4示 T HH 10μL /mL处理后的亚 G1峰。
3. 5　斑点杂交及原位杂交结果: HL-60细胞经
T HH ( 10μL /mL)处理后 ,胞浆内 Bcl-2 m RNA的
含量显著低于正常细胞 ,从处理后 4～ 24 h均呈持
续性降低趋势 (表 1)。
3. 6　 [ Ca2+ ]i检测结果 : HL-6 0细胞经 T HH( 10
表 1　 THH水提取液 ( 10μL /mL)对 HL-60细胞
Bcl-2基因表达的影响 ( x± s,n= 3)
组　别 斑点杂交灰度值 原位杂交阳性细胞率 (% )
对照组 2 155 295± 362 611 48. 13± 5. 15
4 h组 　 697 450± 77 173* 28. 25± 6. 08*
12 h组 　 506 185± 101 816* 13. 38± 6. 42*
24 h组 　 389 390± 183 706* 10. 25± 4. 25*
　　与对照组相比: * P < 0. 05
与对照组相比: * P < 0. 05
图 3　 THH水提取液对 HL-60细胞凋亡率的影响
μL/mL)处理后 ,其 [Ca2+ ]i与正常对照组相比未发
生显著改变 ( P> 0. 05) ,处理前后 [Ca2+ ]i维持在
170～ 190 nmo l /L范围内 ,无显著性差异。
4　讨论
近年来 ,从毒副作用相对较小的中药中寻找新
的抗癌药物是一个积极的方向。 THH是卫茅科雷
公藤属植物 ,其毒性远远小于同属的雷公藤。本研究
发现 , THH能诱导细胞出现典型的凋亡细胞形态 ,
包括核固缩、染色质边集、核碎裂及凋亡小体形成
等。 DNA有规律地在核小体之间的降解从而形成
的梯状带 ,是凋亡细胞的重要生化标志。琼脂糖凝胶
电泳显示 , T HH能诱导细胞出现典型的 DNA梯状
带 ,并且随剂量增加 ,梯状带的出现时间前移 ,表现
出良好的剂量和时间依赖关系。流式仪检测表明
T HH可诱导细胞出现典型的亚二倍体峰 (凋亡
峰 ) ,并且存在明显的量效和时效关系。 在 DNA直
方图中 ,从 4 h开始 ,亚 G1期细胞逐渐增多 ,凋亡率
升高并维持较长时间的高台期或呈持续升高趋势 ,
表明药物作用全程 ( 0～ 48 h)凋亡现象均持续存在
图 4　 THH水提取液 ( 10μL /mL)诱导的 HL-60细胞凋亡峰流式细胞仪分析图
·915·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
并维持在较高水平。本研究应用染料排除法 ,活细胞
悬液荧光染色结合 DNA电泳及 FCM分析 ,均观
察到 THH诱导细胞凋亡的典型表现 ,并且检测结
果较一致地反映了 THH诱导细胞凋亡的动态变化
规律。证实 T HH具有较强的诱导白血病 HL-60细
胞凋亡的能力。
Bcl-2基因在细胞凋亡中起负性调节因子作用 ,
其过度表达可保护肿瘤细胞 ,使许多瘤细胞对阿糖
胞苷、长春新碱、顺铂等化疗药物产生抗性 ,这可能
是形成多药耐药性的原因之一 [ 5] ; Bcl-2表达增强是
许多肿瘤的共性 ,能使肿瘤细胞维持明显的生长优
势。HL-60细胞作为 Bcl-2基因高表达细胞株 ,实验
观察到 , T HH水提取液 ( 10μL /mL) 处理后 4 h,
Bcl-2基因表达即出现显著降低 ,直到处理后 24 h
均保持持续降低趋势。同步 FCM分析则显示凋亡
的高峰发生在 24 h左右 ,说明 Bcl-2表达下调是一
个早期事件 ,提示 Bcl-2基因有可能是 T HH诱导
HL-60细胞凋亡的启动基因。 由于 80% 以上的肿
瘤其 P53基因为突变型 ,使这些肿瘤对传统化疗药
物并不敏感 [6 ]。在 P53基因突变的 HL-60细胞中 ,
T HH能通过下调 Bcl-2基因诱导凋亡发生 ,提示
T HH可能发展成为一种广谱抗肿瘤药物。
大量研究表明 ,在 HL-60细胞凋亡过程中至少
存在两种不同的信号途径: 一种以 Ca2+ 为第二信
使 ,通过参与凋亡过程中一些关键点的调节 ,包括激
活 Ca2+ 依赖性核酸内切酶 ,而启动细胞自主死亡程
序 ;另一种可能依靠其他信号通路诱导细胞凋亡。目
前认为凋亡时细胞内信号还涉及 cAM P,蛋白激酶
系统 ,氧化应激等。 本研究采用目前应用较广的
Ca2+ 荧光指示剂 Fura-2 /AM检测 HL-60细胞内
游离 Ca2+浓度 ,结果提示 T HH在启动细胞凋亡过
程中未引起细胞内 Ca2+ 稳态的改变。 结果提示
T HH可能有通过 Ca2+ 以外的其他信号通路启动
HL-60细胞凋亡。此外 , HL-60细胞为 Bcl-2高表达
细胞株 ,研究表明 ,过表达的 Bcl-2蛋白能抑制胞内
Ca
2+ 库的动员 ,阻止 [Ca2+ ]i升高及核钙的积累 [7 ] ,
这可能是 T HH诱导 HL-60细胞凋亡早期 [ Ca2+ ]i
未发生变化的一个重要原因。
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桂枝对致痫大鼠海马 CA1区诱发场电位的影响
徐淑梅 ,何津岩 ,林来祥 ,郑开俊 ,仇晓菁⒇
(天津医科大学 生理教研室 ,天津　 300070)
摘　要: 目的　探讨桂枝对癫痫模型海马脑片诱发场电位的影响。方法　以毛果芸香碱致痫大鼠为实验对象 ,用细
胞外玻璃微电极记录方法 ,观察桂枝对癫痫模型离体海马脑片 CA1区锥体细胞诱发群峰电位 ( population spike,
PS)的影响。结果　桂枝提取液使致痫大鼠海马脑片 PS幅度平均降低 28. 73% ,平均 16. 8 min恢复。结论　桂枝
能降低致痫大鼠海马脑片 CA1区顺向诱发 PS幅度 ,提示桂枝对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制
效应。
关键词: 桂枝 ;癫痫 ;海马脑片 ;群峰电位
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0916 03
Effect of cass ia twig on evoked field potential of
CA1 of hippocampal slice in epileptogenic rat
·916· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2001-04-27基金项目:天津市 21世纪—青年科学基金资助项目 ( No. 963708411)作者简介:徐淑梅 ( 1960-) ,女 ,河北省人 ,副教授 ,学士学位。 1983年毕业于天津医学院医疗系 ,主要从事神经电生理研究。