全 文 ：毛细管电泳法分离丹参水溶性有效成分——
丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸
中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心 ( 116011)　　芮建中 　邹汉法
南京军区南京总医院临床药理科　　　　　　　　　　　　　　　　袁倚盛　 凌树森
摘　要　毛细管电泳法分离丹参水溶性有效成分丹参素 ( DSS)、原儿茶醛 ( PAH)和原儿茶酸 ( PA)。 分别考察电渗
流改向剂十六烷基三甲基溴化铵 ( CT AB)的浓度、电泳缓冲液 p H值及电解质浓度、有机添加剂种类及浓度、运行
电压、样品溶剂组成 ,以及检测波长等因素对有机阴离子类分析对象的峰迁移时间、分辨率、柱效的影响 ,优化选择
的分离条件为:以 pH为 7. 0,含 0. 5 m mol / L CTAB,浓度为 200 mmo l / L的磷酸盐溶液与乙腈按 20∶ 5混合配制
电泳缓冲液 ,在 75μm(id )× 34. 5 ( eff. 30) cm的毛细管柱 (柱温控制于 20℃ )上 , 10 kV ( 6 s)电迁移进样 ,运行电
压为 8 kV。 在 8 min内能将以 20%乙腈 -水为溶剂的样品 ,即内标 (对羟基苯甲酸 ,p -HBA) , DSS、 PAH和 PA完全
基线分离 ,柱效达 40万 /米理论塔板数。
关键词　高效毛细管电泳　丹参素　原儿茶醛　原儿茶酸
Separation of Water-Soluble Active Principles of Danshen (Salvia miltiorrhiza )
Danshensu, Protocatechuic Aldehyde and Protocatechuic Acid by HPCE
　　 National Ch roma tog raphic Resea rch & Analysis Centr e, Da lian Institute o f Ch emical Physics, Chinese Academy of
Sciences ( Dalian 116011)　 Rui Jianzhong and Zou Hanfa
　　Depar tment of Clinical Pharmaco lo g y, Jinling Hospital　 Yuan Yisheng and Lin Shusen
Abstract　 　 Water-so luble active principles of Salvia milt iorrhize Bge. — Danshensu ( DSS ) ,
pro tocatechuic aldehyde ( PA H) and pro to catechuic acid ( PA) w ere separated by HPCE. M any facto rs that
can affect the resolution, sensi tiv ity and column eff iciency o f organic anion, including the concentration of
cety lt rimethyl ammonium bromide ( CTAB) , pH value, concentration o f pho spha te buffer, percentage of
o rganic modifier in the buf fer , running vol tage, composition of solv ent used for the sample, and detecto r
w aveleng th w ere investig ated to optimize the experimenta l conditions. Good separation o f internal standard
( p -hydroxy benzoic acid ) , DSS, PAH and PA can be achiev ed in less than 8 min under the following
conditions: capilla ry column, 75μm (id)× 34. 5 ( ef f. 30) cm , uncoated; co lumn tempera ture controled at
20℃ ; detecto r, UV 200 nm; injection, 10 kV /6 s; running vo ltag e, 8 kV; running buffer, 200 mmol /L
phospha te buffer ( pH 7. 0, containing 0. 5 mmol /L CT AB) and acetoni t rile 5 mL in 20 mL ( 20∶ 5, v /v ) .
Sample solv ent was acetoni t rile-w ater ( 2∶ 8 v /v ) . The column ef ficiency reached 400 000 per metre in
thoretical plate number.
Key words　　 HPCE Danshensu ( DSS) protoca techuic aldehyde ( PAH) pro tocatechuic acid ( PA)
　　中药丹参 Salvia m iltiorrhza Bunge的干燥根
及根茎 ,性味苦微寒 ,为临床常用的活血药 [1 ]。 丹参
水溶性主要有效成分为丹参素 (danshensu, DSS) ,
原儿茶醛 ( pro tocatechuic aldehyde, PAH)和原儿
茶酸 ( pro tocatechuic acid, PA)。DSS能抗心肌缺血
并对冠状动脉有作用 , PA H能显著增加冠状动脉血
流量 ,对抗 ADP所致血小板聚集 ,并有广谱抗菌作
用 [2, 3 ]。丹参药材及各种制剂中 DSS、 PAH和 PA的
分离和测定方法有薄层层析 -分光光度法 ,纸层析-
紫外分光光度法 ,荧光光谱法 ,薄层扫描法和高效液
相色谱法 [4, 5 ]。
高效毛细管电泳 ( HPCE)是 80年代以来迅速
发展的新兴分析方法 ,具有高效、灵敏、快速、样品用
量少 ,以及容易自动化、操作简便、溶剂消耗少、环境
污染小等优点 ,在氨基酸、蛋白质、多肽和核酸等生
物分子的分析中得到广泛应用 ,并迅速扩展到食品
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Address: Rui Jian zh ong, National Ch romatog raphic Research & Analysis Cen t re, Dalian Ins ti tu te of Ch emical Physi scs. Chin ese
Acad emy of Sciences , Dalian芮建中　男 ,主管药师。 1994年 7月在第二军医大学获硕士学位 ; 1997年 7月在中国药科大学获博士学位。 1997年 10月进入中科院大连化物所博士后流动站 ,研究方向为高效毛细管电泳在中药成分分析中的应用。 固定地址:南京军区南京总医院临床药理科 ,南京　 210002。
化学、环境化学、临床医学和药学中 , CE分离有机
分子、药物分子 ,特别是在手性分子和中药成分分析
方面的能力 ,已显示出较大优越性 [6～ 9 ]。本文介绍用
毛细管区带电泳 ( CZE)分离有机阴离子类中药成分
丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸。
1　材料和方法
1. 1　仪器: 自动毛细管电泳仪 Bio focus○R Capil la ry
Elect rop Ho resis System 2000 型 ( Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA, U SA) ,紫外检测器 ;
毛细管柱: 75μm× 34. 5 cm ,河北永年光纤厂 ,有效
长度为柱长减去 4. 5 cm ,设柱温 20℃ ;自动控制软
件 Bio focus operating sof twa re ( Version 5. 0) ; p H
计 (杭州立丰仪表设备厂 )。
1. 2　试剂和药品:氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢
钠、乙醇为分析纯 ,江苏太仓化工厂生产 ;甲醇、乙腈
为色谱纯 ,江苏淮阴精细化工研究所生产 ;十六烷基
三甲基溴化铵 ( CT AB)购自华美生物工程公司。对
羟基苯甲酸 ( p-HBA)作为内标 ,购自 SIGMA公司 ;
丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸购自中国药品生物制
品检定所。
1. 3　溶液配制:分别配制浓度为 1. 0, 0. 1 mo l /L的
NaOH溶液 ;浓度为 100 mmol /L的磷酸二氢钠
( p H 4. 93)和磷酸氢二钠 ( pH 9. 15) ;配制浓度为
100, 150, 200, 250 mmo l /L的磷酸盐背景缓冲液
(由等浓度的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠按体积比为
1∶ 1混合而成 ) ;过滤重蒸水为去离子水。在考察和
优化分离条件时 ,如 CT AB浓度、有机添加剂种类
和浓度、样品溶剂组成等 ,则在磷酸盐背景缓冲液中
添加各种试剂配制而成。电泳冲洗液和电泳缓冲液
在使用前经 0. 45μm微孔滤膜过滤 ,并超声脱气。
1. 4　新柱预处理: 新的空柱分别用 1. 0 mo l /L、 0. 1
mol /L的 NaOH溶液和过滤重蒸水各冲洗 60 min,
活化柱表面 ,用氮气吹干后备用。
1. 5　电泳条件选择和优化
1. 5. 1　 CTAB浓度: 被分析物为有机阴离子 ,带负
电荷 ,其电泳方向和电渗流方向 (正极→负极 )相反 ,
一方面电迁移方式难以进样 ,另一方面样品达到检
测端的时间很长或无法到达检测窗。因此 ,采用电渗
流改向剂 CTAB,使电渗流方向由负极向正极 ,并使
电泳仪的检测端电极为正极 ( - →+ ) ,从而达到快
速、高效的分离。 在磷酸盐背景缓冲液中添加
CT AB,配制成浓度分别为 0. 3, 0. 5, 0. 6, 0. 7
mmol /L的磷酸盐 CTAB电泳缓冲液 ,考察电渗流
改向剂浓度对分析时间的影响。
1. 5. 2　缓冲液 pH和浓度:分别配制含 0. 5 mmol /L
CTAB的 100 mmol /L磷酸二氢钠 ( pH 4. 93)和磷
酸氢二钠 ( p H 9. 15)。 另外 ,配制 pH为 7. 0,含 0. 5
mmol /L CTAB,磷酸盐缓冲液浓度分别为 100, 150,
200和 250 mmol /L的电泳缓冲液。考察磷酸盐缓冲
液的 pH和浓度对分离效果的影响。
1. 5. 3　有机添加剂:考察在磷酸盐背景缓冲液中添
加有机试剂乙腈、乙醇和甲醇对分离效果的影响 ,以
及添加的乙腈浓度高低对峰形和分辨率的影响。
1. 5. 4　样品溶剂组成:在电泳缓冲液条件基本确定
后 ,考察分别以水-乙腈 ( 2∶ 8, )为溶剂配制的样品
在含 0. 5 mmo l /L CT AB的 200 mmol /L磷酸盐电
泳缓冲液中对羟基苯甲酸、原儿茶醛和丹参素的分
离结果。
1. 5. 5　运行电压: 考察在优化选择的电泳缓冲液
中 , 6, 8, 10 kV不同运行电压下分离效果 ,并选择分
离速度快、分离效率高、运行稳定的电压。
1. 5. 6　检测波长:考察标准液样品在不同检测波长
下峰形和峰高的变化情况 ,选择灵敏度最高的测定
波长。
2　实验结果
2. 1　电渗流改向剂浓度与迁移时间的关系: 当
CTAB浓度为 0. 3 mmol /L,电渗流已改向 ,但样品
出峰慢 ,迁移时间长 ,第一峰位 (内标峰 )出峰时间大
于 15 min,达不到快速分离的目的 ;当 CT AB浓度
为 0. 7 mmo l /L,出峰较快 ,但高浓度样品中内标与
原儿茶酸不能完全基线分离 ;用 0. 5 mmo l /L浓度
时 ,样品分离度高 ,峰迁移时间也较短。 不同 CTAB
浓度下分离结果见图 1。
毛细管电泳条件:电泳缓冲液为 pH 7. 0, 200 mol /L磷
酸盐 -乙腈 ( 20∶ 5 ) , CT AB: 1= 0. 7 mmol /L, 2= 0. 6
mmol /L, 3= 0. 5 mmol /L;毛细管空柱为 75μm× 34. 5
( ef f. , 30 ) cm;电迁移在 10 kV /6 s;运行电压 6 kV;柱
温为 20℃ ;检测波长 UV 200 nm;样品中各组分浓度均
为 0. 50μg /m L
图 1　 CTAB浓度对被分离组分峰迁移时间的影响
2. 2　缓冲液 pH和电解质浓度与分离度的关系: 样
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品在 100 mmol /L磷酸二氢钠 ( pH 4. 93)或 100
mmol /L磷酸氢二钠 ( p H 9. 15)背景缓冲液条件下
分离差 ,而在 100 mmol /L磷酸盐缓冲液 ( p H 7. 0)
中出峰良好 ,并达到相对较满意的分离度 (见图 2)。
缓冲液中电解质浓度是影响分辨率的重要因素 ,低
浓度的缓冲液不能使样品 (特别是高浓度的样品 )达
到基线完全分离。随着缓冲液电解质浓度增大 ,分离
度增大。但是 ,缓冲液电解质浓度过高时 ,加较低电
压就产生较大的运行电流 ,因而限制了运行电压的
提高 ,并易产生较大的焦耳热 ,稳定性下降。故选择
磷酸盐浓度为 200 mmol /L的缓冲液。
毛细管电泳条件: 电泳缓冲液为 pH 7. 0, 0. 5 mmol /L
CT AB, 100 mmol /L磷酸盐 -乙腈 ( 20∶ 5) ;运行电压 10
kV;其它条件同图 1。
图 2　缓冲液 pH对分离度的影响
2. 3　有机添加剂对分离和灵敏度的影响: 当电解质
缓冲液中加入甲醇或乙醇时 , p-HBA、 PA和 DSS
的分离很差 , PA H的峰形也较差。当加入乙腈 ,并随
着其浓度逐渐增加 ,分离度及 PAH的峰形得到明
显的改善。磷酸盐缓冲液与乙腈的比例 (v /v )分别为
20∶ 2, 20∶ 3, 20∶ 4和 20∶ 5时 ,以 20∶ 5为最佳。
当乙腈浓度进一步增加 ( 20∶ 8)分析时间明显延长 ,
且分离效果下降。
2. 4　样品溶剂组成与峰形:以水或乙腈-水 ( 2∶ 8)
为溶剂配制的标准溶液 ,在优化选择的电泳分离条
件下 ,高浓度样品的分离度及峰形无显著差异 ,而在
低浓度 (如 DSS、 PAH和 PA均为 0. 05μg /mL)时 ,
用乙腈 -水为溶剂 ,被分析成分的峰形和峰高较水样
要好。
2. 5　运行电压对分离结果的影响:运行电压的高低
主要影响分离度和分离效率 ,在低电压时分离度增
大 ,但这是以延长分离时间为基础。由于本方法用较
高的电解质浓度 ,在高电压时 ,电流增大较快 ,产生
更多焦耳热 ,甚至产生气泡 ,导致峰形变差或运行失
败。综合考虑分离度、分离效率、运行电流大小和峰
形的优劣 ,最后采用 8 kV运行电压 , 8 min内样品
达到基线完全分离。
2. 6　检测波长与灵敏度: 考察在 200, 214, 230,
254, 267和 281 nm紫外检测波长下的峰形和峰高
的变化。 文献报道中检测波长均用 281 nm ,本研究
通过变换不同波长 ,分析并比较测定结果认为 ,样品
在 200 nm紫外检测其峰形和峰高较 281 nm及其
它波长要好。同时较大地提高了检测灵敏度 ,通过方
法选择性考察 ,样品位置无干扰。
2. 7　优化的分离条件: p H为 7. 0,含 0. 5 mmol /L
CTAB,浓度为 200 mmol /L的磷酸盐缓冲液与乙
腈按 20∶ 5混合配制电泳缓冲液。 冲洗条件为: 0. 1
mmol /L NaOH 90 s、过滤重蒸水 180 s和电泳缓冲
液 120 s。在 75μm( id)× 34. 5( ef f. 30) cm的毛细管
柱 (柱温控制于 20℃ )上 , 10 kV ( 6 s)电迁移进样 ,
运行电压为 8 kV,紫外检测波长为 200 nm。每一次
运行后用过滤重蒸水冲洗 180 s,再运行下一样品。
优化分离条件下得到的电泳图谱见图 3。
毛细管电泳条件: 电泳缓冲液为 pH 7. 0, 0. 5 mmol /L
CT AB, 200 mmol /L磷酸盐 -乙腈 ( 20∶ 5 ) ;运行电压 8
kV;样品含 p-HBA为 0. 25μg /m L, PA, DSS和 PAH各
为 5. 00μg /m L;样品溶剂组成为乙腈 -水 ( 2∶ 8) ;其它条
件同图 1。
图 3　优化分离条件下被分析组分 p-HBA( 1) , PA
( 2) ,DSS( 3)和 PAH ( 4)的电泳谱图
3　讨论
毛细管电泳法在中药复杂成分分析中的应用不
断增加。本研究尝试用 CZE法快速分析中药丹参中
有机阴离子类活性成分 ,用优化的分离条件 ,使
DSS、 PAH、 PA和 p -HBA(内标 ) 4种成分在较短时
间 ( 8 min)内得到基线完全分离 ,柱效达 40万 /米理
论塔板数。由于采用电渗流改向剂及电极反向 (- →
+ )运行 ,可以排除样品中带正电成分的干扰 ,与文
献报道方法比较 ,具有高效、快速、灵敏和准确的特
点 ,并显示出样品用量少 (每次进样仅几个 nL)、试
剂消耗少、无柱污染和自动化运行的优势 [10 ]。 可以
为丹参制剂的质量控制 ,丹参水溶性有效成分的血
浆样品分析及体内药代动力学研究提供方法学基
础。 有关丹参制剂的人体药代动力学研究结果将进
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一步报道。
分离条件的选择和优化 ,一般从分辨率、柱效、
分离效率和检测灵敏度等方面进行考察。在 HPCE
中分离的影响因素主要为 pH、缓冲液电解质种类和
浓度、有机添加剂的种类和浓度、运行电压、进样方
式和进样量、样品溶剂组成及柱温。 在 pH较高
( 9. 15)或较低 ( 4. 93)时 , DSS、 PA和 p-HBA的分
离差 ,主要由于三者的带电量及分子量相对接近 ,而
其分离效果是电迁移效应 (质荷比的大小决定 )和电
渗流效应的总和。熔硅毛细管内壁表现的 Si-O H的
电离对 pH非常敏感 , p H较高时 , Si-O H的电离基
本饱和 , EO F很大 ,相应减弱电迁移效应的分离作
用 ; p H较低时 ,电渗流下降而使阴离子的解离也下
降 ,电迁移效应下降 ,因此在 pH适中 ( 7. 0)的条件
下 ,电渗流效应及电迁移效应的综合结果是 DSS、
PAH、 PA和 p-HBA基本达到分离。 但是以含
CT AB 0. 5 mmo l /L, 100 mmol /L的磷酸盐背景缓
冲液 ( p H7. 0)作分离介质 ,内标与高浓度样品成分
无法达到基线完全分离 ,而且 PAH的峰形相对较
差。为了提高分辨率和灵敏度 ,一方面增加磷酸盐浓
度 ,另一方面添加有机试剂。提高电解质浓度能达到
更好的分离度和增大进样的柱上浓缩效应 ,有利于
改善峰形和进行定量分析 ;添加有机试剂一般能提
高解离度较弱的有机组分的进样量 ,并改变其峰
形 [10 ]。 本研究考察了乙腈、甲醇和乙醇三种常用有
机添加剂的作用 ,以乙腈的分离效果为最佳 ,较明确
的作用机制有待进一步的研究和探讨。
文献均采用 281 nm作为丹参水溶性成分测定
的检测波长 ,本研究经多种波长测定比较采用 200
nm,目的是进一步提高灵敏度。 作者认为在实际测
定及方法选择性考察中被分析成分出峰位若无干扰
峰时可以选用吸光度更高的检测波长 ,特别是进行
体内样品测定和药代动力学研究时 ,更有实际意义。
DSS在 200 nm检测 ,最低检测限可达 0. 025μg /
mL。毛细管电泳采用在柱检测 ,检测灵敏度非常高 ,
但由于进样量太少 ,光程短 (柱内径为 75μm) ,实际
检测灵敏度受到限制 ,故优化选择新的检测波长。
为了提高检测灵敏度 , HPCE法中独特的柱上
浓缩技术也是目前研究的热点 [11 ]。本文主要通过增
加电解质浓度和降低样品溶液的电场强度 (添加
20%乙腈 )达到浓缩效应。目前应用较多方法有:
( 1)场放大进样 ,包括:导入样品塞切换极性 ,排除样
品基体 ;电迁移场放大进样 ;场放大极性切换进样。
( 2)色谱富集进样。 ( 3)单毛细管 IT P-CZE经浓缩进
样。 在场放大进样中存在堆积极限 ,进样量受到限
制。本文通过不同进样电压及进样时间的结果比较 ,
选用理想的电迁移进样方式 ( 10 kV /6 s)。
参 考 文 献
1　李家泰主编 .临床药理学 . 北京:人民卫生出版社 , 1998: 1408
2　阴　健 ,等主编 . 中药现代化研究与临床应用 .北京:学苑出版
社 , 1993: 171
3　杨春欣 .中国药理学通报 , 1997, 13( 4): 298
4　崔艳萍 .中草药 , 1996, 27( 8): 503
5　倪坤仪 ,等 .药学学报 , 1988, 23( 4): 293
6　魏　伟 ,等 .药学学报 , 1997, 32( 6): 476
7　尹　茶 ,等 .药物分析杂志 , 1999, 19( 3): 209
8　芮建中 ,等 .中国药学杂志 , 1998, 33( 9): 553
9　芮建中 ,等 .药学学报 , 1998, 33( 7): 517
10　邓延倬 ,等编著 . 高效毛细管电泳 . 北京:科学出版社 , 1996:
175
11　宋立国 ,等 .分析化学 , 1997, 25( 6): 722
( 1999-07-02收稿 )
CWJ超微 粉碎 机 问世
攻克粉碎过程中的温升难题 ,通过浙江省科委技术成果鉴定
　　这是一种特别适宜于纤维类中草药及矿物类、骨质类中药材常温下超微粉碎的新一代单元设备 ,日前通过了省级新产品
鉴定 ,专家认为该机的试制成功是粉体工程的重大突破 ,对促进中医、中药的发展具有现实意义。
该产品是依托产、学、研联合自主开发研制的新颖高效组合式超微粉碎设备 ,设计先进 ,其创新性、先进性在于将高精度
涡轮式分级和高速冲击微粉碎机有机相结合 ,成功地解决了粉碎过程中的温升问题 ,达到较大的节能效果 ,且具有较好的使
用可靠性 ;并配有高压负压吸风系统 ,使产品结构紧凑、效率高、运行可靠、粉碎粒度达 10微米以下 ,最细对中草药材可达 3～
5微米以下 ,粒度无级可调 ,粒度分布窄。
经用户使用 ,反映良好 ,认为该机是现阶段中药制备过程中 “切碎”工序应用超微粉碎技术的较佳机型 ,它比传统方式减
少污染 ,降低成本 ,改善环境 ,操作简便 ,占地少 ,投资小 ,能耗低 ,且粉碎细度能达到与气流粉碎机同样的要求 ,便于工业化生
产 ,发展整个中药产业。
规模大、新品多、品种全成套超微粉碎设备生产基地
浙江丰利粉碎设备有限公司　　电话 /传真: 0575- 3185888　 3100888　 3182888
总经理: 王春峰　　联系人:叶向红　　地址 :浙江省嵊州市城关罗柱岙　　　邮编: 312400
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