全 文 ：·药材·
藏药雪莲原植物水母雪莲及其混淆种类的 IT S序列比较和分子鉴定
刘建全 1 ,陈之端 2 ,路安民 2
( 1. 中国科学院西北高原生物研究所 ,青海 西宁　 810001;　 2. 中国科学院植物研究所 系统与进化植物学开放研
究实验室 ,北京　 100093)
摘　要:目的　比较藏药“雪莲”原植物水母雪莲及其混淆种类的 ITS序列 ,为分子序列鉴定提供参照系统。方法　
利用 PCR扩增和 ABI377自动测序。 结果　水母雪莲不同居群间的序列相同 ,与其混淆种类之间存在一定的分子
序列差异。 结论　 ITS序列可正确鉴定水母雪莲与其混淆种类。
关键词: 藏药 ;雪莲 ; ITS序列 ;分子鉴定
中图分类号: R282. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 05 0443 03
Comparison on internal transcribed spacers ( ITS)* sequences of
Tibetan medicine Saussurea medusa and its eas ily confusable species
L IU Jian-quan1 , CHEN Zhi-duan2 , LU An-min2
　　 ( 1. No r thw est Plateau Institute o f Bio lo gy , Chinese Academy o f Sciences, Xining Qinghai 810001, China; 2. Labo ra to r y
o f Sy tematic and Evo lutionar y Botany , Institute o f Bo tany , Chinese Academy o f Sciences, Beijing 100093, China )
Abstract: Object　 In o rder to identify the medicine a t the mo lecula r lev el , the internal t ranscribed
spacers ( ITS) o f Saussurea medusa Maxim. and i ts easi ly confusable species w ere sequenced. Methods　
The double-st randed DN A was amplified using PCR systems 9 600 kits and sequenced on an ABI 377 auto-
ma ted sequencer f rom bo th directions. Results　 The ITS sequences of S. medusa o f dif ferent populations
show ed no variation, but there existed distinct va ria tion betw een S. medusa and its confusable species.
Conclusion　 IT S sequences can be used fo r the molecular authentica tion between S. medusa and its con-
fusable species.
Key words : Tibetan medicine; Saussurea medusa Maxim. ; internal transcribed spacers ( ITS ) se-
quences; molecular authentication
　　中药雪莲花常采用的是菊科 ( Compositae)风毛
菊属 ( Saussurea DC)中的大苞雪莲花 S. involucra-
ta Kar. et Kir [1 ] ,而藏药“雪莲”药材的原植物 ,是分
布在我国青海、甘肃、西藏等地的水母雪莲花 S.
medusa Maxim.
[2 ]。水母雪莲是藏药中的名贵药材 ,
具有散寒除湿、活血通络、抗癌、抗炎及抗疲劳等功
效 ,可治疗风湿性关节炎、妇女月经不调、痈疮肿毒
和高山不适应等多种疾病 [3 ]。 然而天然水母雪莲由
于长期的掠夺性采挖 ,已成为濒危物种 ;因而一些非
正品种类常混入雪莲药材中充当水母雪莲出售。近
年来 ,我们发现市场出售的藏药雪莲中含有许多非
水母雪莲种类 ,其中最多的为黑毛雪兔子 S. hyp -
sipeta Diels。黑毛雪兔子外观与水母雪莲相近 ,在干
药材中最难以区别 ; 其次还有唐古特雪莲 S.
tangutica Maxim. 等。快速、简易鉴别商品流通中的
各种药材 ,成为藏药“雪莲”药材市场上急需解决的
问题之一。
根据分子标记建立准确、快速的分子鉴定试剂
盒进行中草药鉴定是今后中草药生药鉴定研究的重
要研究方向 [4 ]。 I TS ( Internal t ranscribed spacers)
是核糖体 DNA中介于 18 S和 5. 5 S之间 ( ITS1)以
及 5. 8 S和 26 S之间 ( ITS2)的非编码转录间隔区。
在一些类群中 ,通过比较发现同一种类不同生境居
群间的 IT S序列没有变异 [5 ] ;因而 ITS序列有时也
可作为物种的特异性分子标记。 同时 ,由于 ITS片
段短、多拷贝 ,在药材分子鉴定中不受药材部位、保
存时间的限制 ,是药材分子鉴定的理想片段。
本研究采用直接 PCR测序方法 ,对藏药“雪莲”
·443·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
收稿日期: 2000-10-02基金项目:中国科学院生物科学与生物技术特别支持费课题资助。作者简介:刘建全 ( 1969-) ,男 ,四川井研县人 ,博士。 现为日本森林与森林产品研究所特别研究员 ,研究方向为资源植物学与进化植物学。已发表论文 50余篇。 Tel: ( 0971) 6153387　　 E-mai l: l jqdx y @ public. xn. qh. cn
原植物水母雪莲及近年市场使用非正品种类共 4种
植物的 ITS序列进行测序 ;主要目的是比较它们之
间的 ITS分子序列是否存在差异 ,为雪莲原植物的
分子序列鉴定以及根据序列差异进一步设计特异性
“雪莲”药材分子快速鉴定试剂盒提供依据。
1　材料和方法
1. 1　材料:水母雪莲 Saussurea medusa Maxim. 有
3种来源:青海北部门源县祁连山 ,青海南部玛多县
的巴颜喀拉山和西宁藏药市场购买的雪莲药材。黑
毛雪兔子 S. hypsipeta Diels分别来自青海北部门
源县祁连山和药材市场。唐古特雪莲 S. tangutica
Maxim. 采自青海南部玛多县的巴颜喀拉山 ,弯齿
风毛菊 S. przewalsk ii Maxim. 采自青海的玉树
县。野外采集的样品直接采用硅胶干燥叶片。 药材
样品取药材上的干叶片和花序下的苞片。
1. 2　总 DNA提取:总 DNA提取基本依照 CTAB
法进行。在每个样品中取混合叶片约 2 cm2 ,加入 2
倍体积的石英沙 ,充分研磨 ,加入 700μL含 0. 3%
β -巯基乙醇的 2× CT AB提取液 ,混匀 ,倒入 1. 5 mL
的 Eppendorf离心管中 ,于 65℃水浴 50 min。加入
700μL氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)混合液 ,轻轻摇匀后 ,
10 000 r /min离心 5 min,收回的上层水相再加入
2 /3体积的异丙醇 ,置于室温下 10 min,然后 10 000
r /min离心 5 min,弃去上清液 , 70%乙醇洗涤 1～ 2
次 ,风干后加入 100μL 1× TE,备用。
1. 3　核糖体 DNA ITS1-5. 8 S rDN A-ITS2片段
PCR扩增、产物纯化和测序:采用双链 PCR反应扩
增 IT S1-5. 8 S rDN A-ITS2整个片段 ,引物 P1位于
18 S ( 5′-CGT AACAAGGT TTCCGTAGG-3′)和位
于 26 S上的 P4( 5′-TCCTCCGCTT AT TGATA T-
GC-3′)。扩增反应在 PE公司的 9600型 PCR仪上
进行 ,反应体积均为 50μL,内含 50 mmol /L Tris-
HCl( pH8. 3) , 0. 025 g /L BSA, 2 mmol /L MgCl2 ,
1. 5 U Taq DN A聚合酶 (中国农业大学产品 ) ,
d ATP、 dGT P、 dCTP和 dT TP各 200μmo l /L, 10～
20 mg总 DNA,相应的正反向引物各 12. 5 pmols。
PCR产物经 Sephaglas TM Bandprep Ki t ( Pharma-
cia Co. )或 Wizard PCR Preps DN A Puri fica tion
Sy stem ( Promega)纯化后直接用于测序反应。
1. 4　测序反应及检测:测序工作在 ABI377自动测
序仪上进行 ,测序反应程序基本同扩增反应程序 ,仅
退火温度变为 60℃ ,延伸温度变为 72℃ ,延伸时间
变为 30 s。
1. 5　序列比较: ITS-1及 I TS-2的范围根据已发表
的菊科植物的序列确定 ,序列排列用 CLUST AL V
软件完成。
2　结果和讨论
4种植物的 I TS1, 5. 8 S rDN A和 I TS2序列分
别注册到 GenBank,其序列号分别为: 水母雪莲
AF257787,黑毛雪兔子 AF257788,唐古特雪莲
AF257785和弯齿风毛菊 AF257786,可直接调阅。
笔者对 4种植物 ITS序列排序后的序列矩阵及序
列差异已作排列。
水母雪莲及其 4种植物的 5. 8 S rDN A长度完
全相同 ,全长 163 bp,未发现碱基变异。 4个种 ITS1
的长度也相等 ,为 258 bp。 ITS2的长度为 216～ 222
bp。利用 PAU P分析得到“雪莲”及其搀杂种类 ITS
的绝对遗传距离 (核苷酸差异数 )和平均遗传距离 ,
见表 1。 从表 1可看出 , 4种植物之间的遗传距离较
大 ,最大有 31个碱基的差异 ,最小也有 18个碱基的
区别。水母雪莲与黑毛雪兔子、唐古特雪莲和青海风
毛菊 IT S碱基差异分别为 18, 27和 31。
表 1　 4种植物的 ITS绝对遗传距离和平均遗传距离
类群 弯齿风毛菊 唐古特雪莲 黑毛雪兔子 水母雪莲
弯齿风毛菊 - 0. 043 0. 029 0. 047
唐古特雪莲 28 - 0. 034 0. 041
黑毛雪兔子 19 22 - 0. 028
水母雪莲　 31 27 18 -
　　水母雪莲两个地方居群的测序结果完全相同 ,
说明雪莲所在的风毛菊属中 ,同一种类不同居群间
的 ITS序列较为稳定 ,可用来鉴定与标记该属不同
的植物种类。在本研究中我们对水母雪莲和黑毛雪
兔子的药材与原植物在 DNA提取、扩增和测序方
面均设置了对照 ,药材 DNA测序结果与原植物也
完全一致 ,说明利用药材标本进行 DNA提取、扩增
和测序工作在“雪莲”药材中是可行的 ,所得结果也
是可靠的。因而 ,可利用分子方法来进行“雪莲”药材
的鉴定。
根据目前我们得到的 IT S序列 ,可对藏药市场
上出现的“雪莲”进行检测 ,即测出待检样品的 ITS
片段 ,与水母雪莲进行比较 ,即可鉴别出所检样品是
否是水母雪莲。 但 DNA提取、扩增和测序工作费
时、费力 ,且成本高。根据已知序列 ,设计特异性分子
鉴定试剂盒来检测药材种类 ,较之更为方便。关于这
种分子试剂盒的设计目前有两种途径: 一是选择限
制性内切酶对碱基变异位点进行酶切 [6 ] ;二是设计
特异性引物进行 PCR扩增 [ 7]。对于“雪莲”药材 ,我
们发现利用后者更为简捷。有关“雪莲”药材的分子
鉴定试剂盒 ,我们正在进行实验、比较与完善 ,以求
·444· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
获得最佳的分子鉴定程序。
参考文献:
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analysis [ J] . Plan ta Med , 1999, 65: 360-364.
天麻的组织培养及快速繁殖
蔡永萍 1 ,于力文 1 ,张鹤英 1 ,陈帮国 2
( 1. 安徽农业大学 生物工程系 ,安徽 合肥　 230036;　 2. 安徽省金寨县科委 ,安徽 金寨　 237300)
摘　要: 目的　利用组织培养方法快速繁殖成米麻作为种麻 ,为寻找出一条简便可行的快繁天麻种麻的新途径提
供理论依据。 方法　天麻块茎或茎尖无菌离体培养 ,米麻块茎诱导培养基为 1 /2 M S+ 6-BA 1 mg /L+ N AA 0. 5
mg / L+ 香蕉 50 mg /L;箭麻茎尖诱导培养基为 1 /2 M S+ 6-BA 2 mg / L+ NAA 0. 2 mg / L。结果　小米麻经 50 d无
菌培养后开始生长出新米麻 , 70 d后原小米麻块茎上生长出多个分枝的新米麻 ;箭麻茎尖超过 140 d组织培养 ,茎
尖分化、诱导形成原球茎 ,超过 160 d培养原球茎长大并开花。 结论　天麻可以用组织培养方法快速繁殖成米麻作
为种麻。
关键词: 天麻 ;块茎 ;茎尖 ;组织培养 ;原球茎
中图分类号: R567　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 05 0445 02
Tissue culture and clonal propagation ofGastrodia elata
CAI Yong-ping1 , YU Li-w en1 , ZHANG He-ying1 , CHEN Bang-guo2
　　 ( 1. Depa rtment of Bio tech no lo gy , Anhui Ag ricultural Univ ersity , Hefei Anh ui 230036, China; 2. Committee o f Science
and Tech no lo gy of Jinzhai County in Anhui Prov ince, Jinzhai Anhui 237300, China )
Abstract: Object　 To develop a new method fo r the culturing o f Gastrodia B1. in vit ro , w hich may
provide the theoretical basis of clonal propagation fo r i ts rapid reproduction. Methods　 The small stem tu-
bers and the stem buds w ere used as explants to culture in vitro under sterile condi tions. In the 1 /2 M S
medium containing 6-BA 1 mg /L, N A A 0. 5 mg /L and banana 50 mg /L, the small stem tuber w as induced
to form pro toco rm. In the 1 /2 M S medium containing 6-BA 2 mg /L and N AA 0. 2 mg /L, the stem bud
w as induced to fo rm protoco rm. Results　 Each stem tuber formed a new pro tocorm within 50 d, w hich can
be separated again to fo rm roset te pro to co rm w ithin 70 d. The stem bud was cul tured in v itro to fo rm the
pro tocorm within 140 d. The pro tocorm blo omed w ithin 160 d. Conclusion　 The pro tocorm of G. elata
may be induced from the stem tuber and stem bud. By subdividing these rosette pro to co rms a vi rtually in-
definite clonal propagation can be achiev ed.
Key words: Gastrodia elata B1. ; stem tuber; stem bud; ti ssue cul ture; pro tocorm
　　天麻 Gastrodia elata Blume是兰科植物中比较
特殊的植物 ,为兰科真菌营养型多年生草本植物 ,没
有根和绿叶 ,自然条件下不能独立生存 ,主要靠消化
外部侵入的蜜环菌 Arm illariella mel lea菌丝体过
异养生活 ,俗称赤箭、定风草、仙人脚等。自古以来均
被列为名贵中药材 ,以地下茎的干燥体入药 ,不仅可
治疗多种疾病 ,而且还是极好的高级保健滋补食品。
近年来 ,虽然天麻已由野生采挖发展成为人工
栽培 ,但随着药材部门需求量增多和出口量的增大 ,
加之人工栽培一直采用无性繁殖方法栽培 ,所用的
种麻已延用了十几代 ,乃至几十代 ,因长期多代繁
殖 ,带病毒植株逐年增多 ,引起品种退化和产量下
·445·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
收稿日期: 2000-07-18作者简介:蔡永萍 ( 1964-) ,女 ,安徽省太湖人 ,副教授。 1988年毕业于安徽师范大学生物系植物生理专业 ,获农学硕士学位。同年分配到安徽农业大学生物工程系工作。主要从事植物生理生化、植物生物技术的研究工作。 E-mail: cyphfnge@ mai l. hf. ah. cn