全 文 ：艾纳香二氢黄酮对脂质过氧化损伤大鼠原代培养肝细胞的保护作用
中山大学生命科学学院药学系 (广州 510275)　　蒲含林 　赵金华　许实波
云南烟草公司工业研究所　　　　　　　　　　 胡　群
摘　要　研究 5种艾纳香二氢黄酮类化合物对过氧化损伤的原代培养肝细胞的保护作用。胶原酶灌流法分离
大鼠肝细胞。以 CCl4或 FeSO4+ Cys损伤原代培养肝细胞 , 1× 10- 4和 1× 10- 5 mo l /L的 5种艾纳香二氢黄酮
均能明显抑制受损伤细胞的转氨酶逸出、M DA产生及 GSH耗竭。其中以 2, 5-二羟基艾纳香二氢黄酮的作用
最强 ,在 CCl4所致肝细胞损伤实验中 ,其抑制 MDA产生的 ED50约为 2. 6× 10- 6 mo l / L,保护 GSH的 ED50约
为 1. 08× 10- 5 mo l /L ,抑制 ALT逸出细胞的 ED50约为 9. 39× 10- 6 mo l /L。
关键词　艾纳香二氢黄酮　损伤　大鼠肝细胞　保护
Protective Actions of Blumea Flavanones on Primary Cultured
Hepatocytes against Lipid Peroxidation
Depar tment of Pha rmacy , Colleg e of Life Sciences, Sun Ya t-sen Univ er sity ( Guang zhou 510275)　 Pu Hanlin, Zhao
Jinhua and Xu Shibo
Resear ch Institute of Industry , Yunnan Tobacco Co .　 Hu Qun
Abstract　　 To search for the protectiv e actions o f blumea f lav anones ( BFs) on hepatocytes against
lipid pero xida tion, rats hepa tocytes w ere iso lated and cul tured wi th o r w ithout blumea f lav anones, then
demaged by FeSO4+ cy steine o r CCl4 . The lipid peroxidation cri teria ( malondialdehyde production and
GSH depletion) and al teration in hepatocy te membrane ( leakage of GPT and GO T) w ere estimated. It w as
found that BFs a t 10 and 100μmo l /L inhibi ted the MDA genera tion, GSH depletion and GPT leakage of
hepatocytes induced by CCl4 o r FeSO4+ cysteine. Among BFs, BF-Ⅱ possessed the st rongest activity.
Key words　　 blumea flav anones　 into xica te　 ra t hepa tocy tes　 pro tective action
　　产于中国海南的菊科植物艾纳香 B lumea
blasminfera DC,中医主要用作芳香开窍药 ,具镇
痛、发汗、驱风、祛痰等功效 [1 ] ,中山大学化学系从艾
纳香中分离获得艾纳香素 [ 2] ,并发现该化合物具有
一定的心血管活性和抗氧化、抗实验性肝损伤作
用 [3 ]。香港理工大学应用生物化学技术系对艾纳香
素进行结构改造 ,获得 4个同系物 ,本文称之为艾纳
香二氢黄酮类化合物 ( blumeaf la-vanoids, BFs) ,现
报道其肝细胞保护作用。
1　材料
三氯乙酸 ( TCA, Sigma Co. ) ;维生素 E( Vi t E,
山东淄博化工厂 ) ;胶原酶 ( Collag enaseⅡ , Sigma
Co. ) ;胰岛素 ( Insulin,上海第一生化药业公司 ) ;牛
血清白蛋白 ( BSA,北京红星生化试剂厂 ) ;硫代巴比
妥酸 ( TBA, Feinbiochem GmbH Co. ) ; 1640培养基
( Sigma Co. ) ; ALT、 AST试剂盒 (重庆东方试剂
厂 ) ; 0. 20μm微孔滤膜 (上海医药工业研究院 ) ;艾
纳香二氢黄酮 ( BF-Ⅰ ～ V光谱纯 ,结构见图 1,香港
理工大学应用生物化学技术系陈荣礼教授提供 )。
图 1　艾纳香二氢黄酮的化学结构
2　方法
2. 1　肝细胞分离:采用胶原酶灌流法 [4 ]分离大鼠肝
细胞 ,所得肝细胞以台盼蓝法检测活性 (约 88% ) ,
计数后以 1640培养液 (含 1% BSA, 10μg /mL链霉
素及 1 mmol /L胰岛素 ) , 37℃振荡培养。
2. 2　 CCl4致肝细胞损伤: 将细胞以 1× 106细胞 /
·113·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
Address: Pu Han lin, Departm ent of Ph armacy, Col leg e of Life Sciences , Sun Yat-sen University, Guangzh ou蒲含林　男 ,有机化学专业硕士 ,讲师 , 97级生理学专业博士研究生 ,研究方向是天然产物的药学研究 ,参与导师主持的多项国家基金课题及“九· 五”攻关课题的工作 ,完成部分横向科研项目工作 ,在国内刊物发表论文数篇。
m L的密度接种于培养试管中 ( 1 mL /管 ) ,加入
CCl4 7. 5 mmol /L (终浓度 ) [5 ] ;给药组在加入 CCl4
前 10 min加入不同浓度的 BFs或 VitE(浓度见表
1)。加药后 37℃振荡孵育 3 h, 1 000 r /min离心 5
min,取上清液以赖氏法测转氨酶 ( ALT, AS T)活
性 ;细胞沉淀以 4℃磷酸缓冲液 ( PBS, 0. 015 mo l /
L, pH 7. 4,含 2%磺基水杨酸 )悬浮后 , TBA显色法
测丙二醛 ( MDA)生成量 , DTNB法测还原型谷胱甘
肽 ( GSH)含量 [6 ]。
2. 3　 FeSO4 -Cys致肝细胞损伤:孵育及检测方法同
2. 2, FeSO4-Cys致细胞损伤的浓度为 FeSO4 50
μmo l /L; Cy s 200μmol /L (均为终浓度 )。检测时间
为加入 FeSO4 -Cys后 90 min。
3　结果
BFs对 CCl4及 FeSO4-Cys损伤的肝细胞有保
护作用 ,结果见表 1, 2及图 2。
　　　表 1　 BFs对 CCl4损伤的原代培养大鼠肝细胞
的保护作用 (n= 8,x-± s )
组别
剂量
( mol /L)
CCl4　 7. 5 mmol
MDA GSH ALT AS T
( nmol /106 cells ) ( kar man s U /mL medium)
损伤组 - 2. 43± 0. 27 13. 4± 0. 6 57. 8± 6. 8 92. 3± 7. 7
BF-Ⅰ 1× 10- 5 1. 58± 0. 09* 18. 3± 0. 8* 31. 1± 4. 1* 53. 0± 7. 2*
1× 10- 4 1. 00± 0. 05* 21. 2± 1. 3* 16. 4± 2. 1* 33. 7± 5. 3*
BF-Ⅱ 1× 10- 7 2. 06± 0. 14* 14. 5± 0. 7* 40. 4± 5. 2* 80. 2± 12. 2*
1× 10- 6 1. 55± 0. 13* 17. 4± 0. 6* 25. 4± 2. 5* 62. 9± 3. 9*
1× 10- 5 1. 10± 0. 08* 19. 3± 0. 9* 18. 5± 3. 9* 38. 6± 7. 6*
1× 10- 4 0. 57± 0. 19* 22. 3± 1. 1* 10. 6± 4. 9* 13. 7± 6. 5*
BF-Ⅲ 1× 10- 5 1. 73± 0. 15* 15. 6± 0. 6* 43. 3± 3. 3* 56. 8± 10. 5*
1× 10- 4 1. 56± 0. 10* 18. 0± 1. 0* 32. 2± 3. 2* 47. 3± 3. 5*
BF-Ⅳ 1× 10- 5 1. 70± 0. 13* 16. 6± 1. 2* 36. 3± 5. 0* 63. 4± 4. 7*
1× 10- 4 1. 38± 0. 11* 17. 9± 1. 0* 25. 9± 3. 6* 48. 1± 7. 8*
BF-Ⅴ 1× 10- 5 2. 12± 0. 13* 16. 2± 0. 7* 40. 1± 7. 0* 72. 9± 6. 5*
1× 10- 4 1. 86± 0. 22* 16. 9± 0. 9* 28. 3± 3. 5* 51. 9± 8. 4*
VitE 1× 10- 5 1. 43± 0. 16* 20. 8± 1. 1* 35. 1± 4. 1* 52. 3± 8. 3*
对照组 - 0. 38± 0. 08* 25. 4± 0. 9* 2. 3± 0. 5* 7. 5± 0. 5*
　　与损伤组比较: * P < 0. 05
　表 2　 BFs对 FeSO4-Cys损伤的原代培养大鼠肝细胞
的保护作用 (n= 8,x-± s)
组别
剂量
( mol /L )
FeSO4　 50μmol /L+ Cys　 200μmol /L
MDA GSH ALT A ST
( nmol /106 cells) ( karman s U /mL medium)
损伤组 - 3. 08± 0. 27 11. 0± 0. 8 29. 0± 2. 2 52. 8± 4. 2
BF-Ⅰ 1× 10- 5 1. 70± 0. 17* 16. 2± 1. 3* 12. 3± 1. 0* 32. 5± 2. 3*
1× 10- 4 1. 25± 0. 13* 21. 2± 0. 8* 9. 9± 0. 9* 18. 4± 3. 5*
BF-Ⅱ 1× 10- 7 2. 56± 0. 28* 13. 7± 0. 9* 14. 9± 1. 3* 43. 4± 3. 5*
1× 10- 6 1. 95± 0. 21* 16. 5± 1. 0* 11. 2± 0. 6* 33. 9± 3. 9*
1× 10- 5 1. 27± 0. 10* 18. 9± 1. 3* 8. 9± 0. 8* 21. 5± 4. 0*
1× 10- 4 0. 85± 0. 20* 22. 3± 1. 0* 6. 7± 0. 9* 9. 6± 2. 7*
BF-Ⅲ 1× 10- 5 2. 18± 0. 24* 13. 2± 0. 8* 21. 8± 2. 8* 38. 4± 3. 3*
1× 10- 4 1. 60± 0. 27* 17. 2± 0. 8* 14. 5± 0. 8* 31. 9± 3. 5*
BF-Ⅳ 1× 10- 5 2. 13± 0. 21* 12. 6± 1. 3* 16. 6± 1. 0* 40. 3± 4. 5*
1× 10- 4 1. 70± 0. 20* 16. 0± 0. 8* 13. 6± 2. 8* 32. 6± 3. 0*
BF-Ⅴ 1× 10- 5 2. 52± 0. 13* 12. 9± 0. 8* 26. 1± 1. 6* 46. 8± 5. 3*
1× 10- 4 2. 15± 0. 30* 15. 6± 0. 5* 15. 9± 1. 8* 37. 6± 2. 2*
V itE 1× 10- 5 1. 76± 0. 37* 21. 0± 0. 8* 8. 9± 1. 6* 14. 9± 2. 4*
对照组 - 0. 68± 0. 15* 25. 5± 1. 4* 2. 1± 1. 6* 4. 3± 0. 8*
　　与损伤组比较:　* P < 0. 05
结果表明 ,原代培养肝细胞经 CCl4或 FeSO4-
Cys损伤后 ,其培养液中转氨酶含量分别上升 24倍
和 14倍 ,肝细胞中 MDA含量增加 7倍和 6倍 ,
CSH耗竭 58%和 40%。 艾纳香二氢黄酮可明显对
抗 CCl4或 FeSO4-Cys的肝细胞损伤作用 , 1× 10- 4
和 1× 10- 5 mol /L的 5种艾纳香二氢黄酮均能明显
抑制受损伤细胞的转氨酶逸出、 MDA产生及 GSH
耗竭。其中以 BF-Ⅱ的作用最强 ,在 CCl4所致肝细
胞损伤实验中 ,其抑制 MDA产生的 ED50约为
2. 6× 10- 6 mol /L ,保护 GSH的 ED50约为 1. 08×
10
- 5
mol /L ,抑制 ALT 逸出细胞的 ED50约为
9. 39× 10- 6 mol /L。
4　讨论
研究表明 , BFs对多种化学物质所致急性肝损
伤具有保护作用 [7 ] , 对多种自由基发生系统所致的
A-CCl4致损伤　　 B-FeSO4 -Cys致损伤
1-损伤组　 2-BF-Ⅱ 10- 7 m ol /L　 3-BF-Ⅱ 10- 6 mol /L　 4-BF-Ⅱ 10- 5 mol /L　 5-BF-Ⅱ 10- 4 mol /L　 6-对照组
图 2　 BF-Ⅱ对原代培养大鼠肝细胞的保护作用 (n= 8, x-± s )
·114· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
组织脂质过氧化也有较强的抑制作用 [8 ]。 考虑到
CCl4、扑热息痛等所致急性肝损伤均与脂质过氧化
密切相关 [9 ] ,笔者研究 BFs对 CCl4和 FeSO4-Cys损
伤的原代培养肝细胞损伤的保护作用 ,以进一步探
讨 BFs肝保护与抗氧化的关系。 结果表明 BFⅠ ～
Ⅴ均能抑制 CCl4和 FeSO4-Cys所致的肝细胞脂质
过氧化: M DA产生减少 , GSH耗竭降低 ,同时保护
了肝细胞膜的稳定性。转氨酶渗出减少 ,并呈现出一
定的相关性。提示 BFs的抗氧化作用可能是其肝保
护作用的机制。此外 ,在 BFs中 , BF-Ⅰ的作用强于
BF-Ⅲ -Ⅴ ,此与“黄酮类化合物中 3’ , 4’ -OH是抗氧
化活性基团”的理论 [ 10]相符。而活性最强的 BF-Ⅱ是
具有 2’ , 5’ -OH的黄酮类化合物 ,这一结果可能对
进一步研究黄酮类化合物的抗氧化作用的构效关系
有一定的提示作用。
参 考 文 献
1　全国中草药汇编编写组 ,全国中草药汇编 (上 ) . 北京:人民卫生
出版社 , 1986: 49
2　林永成 ,等 .中山大学学报 , 1988, 27( 2): 77
3　许实波 ,等 .中国药理学报 , 1993, 14( 4): 376
4　 Diane J B, et al . Bioch emical Toxicology: A Pratical
Approach. Oxford: ILK Pres s Let, 1987: 56
5　樊爱平 ,等 .生理科学 , 1987, 7( 6): 357
6　许实波 ,等 .中国药理学通报 , 1988, 14( 2): 191
7　徐叔云 ,等 . 药理实验方法学 (第二版 ) . 北京:人民卫生出版
社 , 1994: 488
8　赵金华 ,等 .中国药理学通报 , 1997, 13( 5): 438
9　 Plaa G L, et al . Annv Rev Pharmacol Toxical, 1976, 16: 125
10　 Younes M , et al . Planta Medica, 1981, 43: 240
( 1999-07-16收稿 )
川芎嗪对大鼠浸水应激性胃溃疡的影响
烟台师范学院生物系生理教研室 ( 264025)　　万军利 　王昌留　崔胜忠
摘　要　以大鼠浸水应激性胃溃疡为模型 ,从胃酸分泌、胃运动、胃粘膜一氧化氮合成酶 ( NO S)和一氧化氮
( NO )几方面观察 ip川芎嗪 ( TM P)对大鼠应激性胃溃疡的影响 ,探讨 TM P的作用机制。 结果: TM P 10～ 40
mg /kg可明显抑制大鼠浸水应激性胃溃疡的发生 ; TM P 20 mg /kg可促进胃液分泌量的增高 ,但对胃酸分泌
无影响 ;并可明显抑制胃的运动 ;浸水应激后大鼠胃粘膜 NOS活力和 NO含量均明显降低 , TM P可抑制应激
导致的 NOS活力和 NO含量的降低。 结论: TM P通过抑制应激引起的胃粘膜 NO S活力的降低 ,提高胃粘膜
NO含量 ,进而抑制胃运动途径来抗溃疡 ,而与胃酸分泌无关。
关键词　川芎嗪　胃溃疡　胃酸　胃运动　一氧化氮
Effect of Tetramethylpyrazine on Gastric Ulcer Induced by
Restraint Water-immersion in Rats
Physiolog ical Section, Depar tment of Biolog y , Yantai No rmal Co llag e ( Yantai 264025)　Wan Junli, Wang Changliu and
Cui Sheng zhong
Abstract　　 To observ e the ef fect of tet ramethy lpy razine ( TM P) , one of the activ e principles in
Ligusticum wal lichii Franch, on stress ulcer in rats. In the rest raint wa ter-immersion rats, the
mechanisms of TM P administered int raperi toneally w ere investig ated in gast ric secretion, gast ric mo tility,
g ast ric mucosal NO S activi ty and NO content. Results show ed tha t TM P 10～ 40 mg /kg significantly
inhibi ted the forma tion o f gast ric ulcer; TM P 20 mg /kg could increase gast ric juice secretion, but had no
ef fect on ga st ric acid secretion; TM P 20 mg /kg suppressed gast ric moti li ty; in rest raint wa ter-immersion
ra ts, g ast ric muco sal NOS activi ty and NO content w ere decreased and TMP 20 mg /kg could inhibi ted the
decrease o f NOS activi ty and NO content. It w as concluded that TM P can inhibit gast ric ulcer induced by
rest raint w ater-immersion and i ts protection may be related to inhibi t gast ric mo tility, the decrease of NOS
activi ty and NO content , but is no t related w ith gast ric acid secretion.
Key words　　 tet ramethy lpy razine ( TM P)　 gast ric ulcer　 gast ric acid　 gast ric moti li ty　 ni t ric oxide
　　川芎为常用的活血化瘀中药 ,川芎嗪即四甲基
吡嗪 ( tet ramethy lpy razine, TM P)是川芎的有效成
分之一 ,基对中枢神经系统损伤和失血性休克导致
的大鼠应激性胃溃疡的作用已有报告 [ 1, 2] ,我们也观
·115·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
Address: Wan Ju nli, Departm ent of Biology, Yantai Normal College, Yantai万军利　男 ,生理学专业研究生毕业 ,理学硕士学位 ,副教授。山东省细胞生物学会会员。现从事应激性胃粘膜损伤发病机制及药物抗溃疡机制的研究。主持完成了山东省教委项目《巯基在应激性胃粘膜损伤及细胞保护过程中作用机制及应用研究》。获山东省教委科技进步二等奖
1项。 已发表论文 16篇。