全 文 ：· 药理实验与临床观察 ·
银杏叶中棚皮素黄酮昔类抗紫外线作用的研究
山东大学生命科学学 院 (济南 2 501 0) 0李 艳 ` 张举仁 徐誉泰
摘 要 小 鼠肝细 胞接受 不同剂量 的紫外线照 射后 , 线粒体 的结构和功 能受到不 同程 度的损伤 ,
而且具有明显 的剂量 效应 , 这种损伤主要表现在脂质过 氧化程度增 大以 及 由此导致的线粒体膜流
动性下降和细胞 色素 C 氧化 酶 ( C C O ) 活力的降低 。 从银杏 叶中提取 的懈皮素黄酮昔类 可以 显著抑
制线粒体的这种 变化 , 从而保护紫外线引起的线粒体的结构 和功能的损伤 。
关键词 银杏 叶 紫外线 线粒 体 懈皮 素黄酮昔
S t u d i e s o n t h e A n t i
一
U V
一
I r r a d i a t i o n E f f e e t o f Q u e r e i t r i n E x t r a e t e d
f r o m G i n k g o L e a v e s ( iG
n k g o b i l o b a )
L i Y a n
,
Z h
a n g J u r e n a n d X u Y u t a i ( C o l le g e o f L if e S e ie n e e s
,
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n iv e r s i t y
,
Ji n a n 25 0 1 0 0 )
A b s t r a e t Wh
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a t e d w i t h d if fe r e n t d o s e s o f U V r a d ia t i o n
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u n e t io n s o f e e l l m it o e h o n d r ia w e r e fo u n d t o b e e f f e e t e d
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e p月n d e n t ly , t o v a r ie s d e g r e e s · T h e e f f e e t s
m a i n l y r e s u lt e d i n a n i n e r e a s e o f d e g r e e o f li p i d p e r o x id a t io n
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u id i t y o f m i t o e h o n d r i a l
m e m b r a n e a n d t h e a e t iv i t y o f e y t o e h r o m e C o x id a s e
.
Q u e r e i t r i n
, e x t r a e t e d f r o m t h e le a v e s o f G i n k g o b i l o b a
L
.
s h o w e d a m a r k e d p r o t e e t iv e e f f e e t o n t h e f u n e t io n o f m it o e h o n d r ia b e f o r e in e u b a t i n g w i t h U V ir r a d ia t i o n
.
K e y w o r d s U V i r r a d i a t io n m it o e h o n d r ia q u e r e it r in
黄酮类化合物的抗氧化作用早 已被人们
所重视 , 以黄酮和内醋为有效成分的银杏叶
提取物临床上广泛用于改善与脂质过氧化有
关的疾病及衰老症状 。近代工业 的发展 , 大量
氟化物和氮氧化合物排放人大气 , 臭氧层遭
到一定破坏 , 地球上的生物接受的紫外照射
剂量显著增加 ,紫外线对机体的有害效应 已
有充分资料证明 。 我们研究了银杏叶中懈皮
素黄酮昔类对于紫外照射引起的线粒体损伤
的保护作 用 , 为从银杏叶中开发抗 紫外线药
物奠定 了基础 ,对于银杏叶的开发应用有 十
分重要的意义 。
1 材料
1
.
1 试剂 : 硫代 巴 比妥酸 ( T B A , 上海生化
试 剂 厂 ) , 细 胞 色 素 C ( 齐鲁 生化 制 药厂 ) ,
R M P I
一
1 6 4 0 细胞培养粉 ( G IB C O 产品 ) , 1 , 6-
二 苯基 一 1 , 3 , 5一己 三烯 ( D P H , F l u k a 公 司产
品 ) , 四 乙氧基丙烷 ( T E P , iS g m a 公司产 品 ) ,
其余试剂均为分析纯 。
1
.
2 仪器 : 冷冻高速离心机 , 7 21 型分 光光
度计 , U V 一 2 4 0 型紫外分光光度计 , 日立 8 50
型荧光分光 光度计 , L C 一 10 A 型高效液相 色
谱仪 , C O : 细胞培养箱 。
2 方法与结果
2
.
1 银杏叶中懈皮素黄酮昔类物质的提取 :
应用硅胶薄板层析的方法川从银杏叶总黄酮
中分离得 到 , 进一 步通过 H P L C 分 析川 、 昔
元及糖的分析 3j[ 确定该组分是以懈皮素为昔
元 的黄酮糖昔 。
2
.
2 不同剂量的紫外线对线粒体的影响 :取
A d d r e s s
:
L i Y a n
,
C o ll e g e o f L i fe cS i
e n e e s , S h a n d o n g U n i v e r s i t y
,
J in a n
李 艳 1 9 9 1一 19 95 年在 山东大学 生命科学学院生化专业学 习 , 1 9 9 5一 1 9 9 8 年在本院攻读 细胞生物学专业 的硕 士学
位 , 主要研究方 向是 天然抗 氧化 、抗痛药物 的筛选及药理 ,发表有关论文 3 篇 。 现在本 院发育生物学研究所读博士 , 研究方向
是 发育机制及基 因调控 。
《中茎药 》 1 9 9 9 年第 30 卷第 9 期 。 6 7 1 。
3 月 龄昆 明种小 鼠 , 断 颈椎 法处 死 , 取 出肝
脏 , 分离肝细胞 , 方法参照文献州 , 得 5 x 10 6
个细胞 /毫升的细胞悬液 。将适量的小 鼠肝细
胞悬液置于剂量率为 7 60 拜W c/ m Z 的紫外线
下照射不 同时间 , 收集 细胞 , 应用差速 离心
法川提 取 线 粒体 (线 粒 体 蛋 白含 量 测定 用
C o m as isc 亮蓝 染色 法川 , 以 牛 血清 白蛋 白
为标 准 ) , 测定线粒体脂质过氧化程度 、 膜流
动性和细胞色 素 C 氧化 酶 ( C C O ) 活力的变
化 。
2
.
2
.
1 紫外线对 于线粒体脂质过氧化 的影
响 : 过氧化脂质的含量测定 , 采用 T B A 比色
法川 , 以 四 乙 氧 基 丙 烷 为 标 准 , 以 丙 二 醛
(M D A )含量表示脂质过氧化程度 。 过氧化脂
质形成的抑制率计算公式为 :
紫外线照射可 以 明显地降低线粒体膜的
流动性 ,且剂量效应显著 。在开始的一段时间
内 ,膜 流动性 变化 比较缓慢 , 到照射 时间为
1 0 m i n 时 , 膜流动性陡然下降 , 2 0 m i n 时 , 线
粒 体膜 的流 动性几乎达到最小 ( 图 2) ,这 表
明膜脂状态与膜流动性两者之间密切相关 ,
膜流动性下降可能是膜脂过氧化达到一定程
度后的结果 。
~219876气ùL卜让氏
导、口绷移璐钱
0
.
4
0
.
3
10 15
服射时间 r ( m i n )
20 2 5
抑制率 ( % ) 一 损伤组 M D A 一保护组 M D A损伤组 M D A 一 对照组 M D A 义 1 0 0%
实验结果表明紫外线可显著影响过氧化
脂质的形成 ,在紫外线照射初始阶段 ,线粒体
膜脂对之非常敏感 。 照射 5 m in , 过氧化脂质
含量几乎为正常状 态时的 2 倍 , 随着紫外线
剂量 的继续增加 , 线粒体脂质过氧化水平继
续升高 , Z m in 之后 , 过氧化脂质的水平几乎
接近最大 (图 1 ) 。
0
.
19 r
0
.
17
0 15
图 2 策外线照射对线粒体膜流动性的影晌
2
.
2
.
3 紫外 线 照射 对 C C O 活力 的影 响 :
C C O 活力的测定采用底物氧化法 ,在细胞色
素 C 逐渐被氧化的过程 中做 A 5 。 。m 对时 间 t
的连续 扫描 ,具体操作参照文献 8[] 。 最后 以
L n ( A t
一
A co ) 对时 间 t 做 图 , 并做 回归分析 ,
直线斜率 K 即表示酶活 , 比活为 K (/ 秒 , 毫
克蛋白 ) 。
实 验结 果表 明 , 紫 外线 照 射 可 以 降低
C C O 的活力 , 随着紫外剂量的增加 , C C O 活
性逐渐降低 (图 3 ) 。
10 5 1
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131的
0
,
0
ǎZd;.奄,à记O芝
0
.
0 , L
0
图 1
5 1 0 15
服射时间 r ( m i n )
20 2 5
2
.
2
.
2
紫外线照射对线粒体脂质过级化的影响
紫外线照射对线粒体膜流动性的影 5 5右 5 10 1 5
妞射时间 “ 而 n)
2 0 2 5响 : 线粒体膜流动性分析川 以 D P H 为荧光探
剂 , 应用 日立荧光分光光度计测定 10 , 。。 , .0I 。 ,
L
。 , 。 , I。 , 。。 , 计算荧光偏振度 ( P ) , 定量 了解线
粒体膜脂分子 的运动情况 , 即微粘度 (劝 , 微
粘度越大 ,膜流动性越小 ,反之亦然 。
I
。 . 。一 G X I o . , o
1
0 . 。
+ G 义 1 0 . 0 0
G 一磊 P - 2P0 . 4 6一 P
图 3 嫂外线照射对 C C O 活 力的影晌
2
.
3 懈皮素黄酮昔类对紫外线导致的线 粒
体损伤的保护作用 : 细胞悬液中加人不同浓
度 的懈 皮 素黄 酮昔 (浓 度设定 参照 有关 文
献 uj[ 和预备实验 ) , 然后置于 37 ℃的 CO : 培
.
6 7 2
.
养箱 中培养 Z h, 设为保护组 , 对照组和损伤
组只加人 同体积的 P B S 。 将保护组和 损伤组
置于紫外灯下照射 2 0 m in ,对照组置 日光灯
下相同时间 ,然后提取线粒体 ,分析线粒体的
过氧化脂质含量 、 膜流动性以及 C C O 活力 。
2
.
3
.
1 对 线粒体脂 质过氧化 的影 响 : 见表
1
。拼皮素黄酮昔显著地抑制了紫外线引起的
过氧化脂质的形成 , 而且随着浓度的升高 ,这
种抑制能力增加 。
表 1 银皮素黄酮普对线粒体脂质
过级化水平的影响` 士 , )
浓度 印 g /m L ) M D A ( n m o l /m g · p r o ) 抑制率 (% )
q`月蜷O口1
:
,.
巴J氏jIQùJ络lj一了门r
对照组
损伤组
5
.
2 7
1 0
.
5 4
1 5
.
8 1
2 1
.
0 8
0
.
1 1 9士 0 . 0 63
0
.
2 65 士 0 . 0 5 6
0
.
1 9 9士 0 . 0 2 4
0
.
18 7 士 0 . 10 2
0
.
1 60 士 0 . 0 8 8
0
.
15 1士 0 . 0 2 9
2
.
3
.
2 对线粒体膜流动性降低及 C C O 活力
降低 的影响 : 见表 2 , 3 。 棚皮素黄酮昔能够抑
制紫外线引起 的膜流动性降低和 C C O 活力
的降低 ,而且具有剂量效应 。
表 2 椒皮素黄酮普对线粒体
膜流动性的影响 (牙士 s)
浓度 (拜g / m L ) 荧光偏振度 P
0
.
14 2士 0 . 0 6 9
0
.
2 5 6士 0 . 0 2 4
0
.
2 3 4士 0 . 0 5 0
0
.
1 9 5士 0 . 0 2 9
0
.
1 7 0士 0 . 0 3 6
0
.
1 6 4士 0 . 0 1 7
l /刀
对照组
损伤组
5
.
2 7
10
.
54
15
.
8 1
2 1
.
0 8
1
.
1 2
0
.
3 98
0
.
4 8 3
0
.
6 7 9
0
。
8 53
0
.
90 2
表 3 棋皮康黄酮普对 C C O 活力的影晌` 士 , )
浓度 (拜g / m L ) C C O 比 活 ( U / m g ) 相对活力 (% )
ó匕J任八j乃J比6
.…匕JQóùOéQ`ùh内匕月八了6Q
对照组
损伤组
0
.
6 6 3士 0 . 1 0 2
0
.
4 3 6士 0 . 0 8 6
0
.
4 6 0士 0 . 1 0 5
0
.
5 2 6士 0 . 0 7 4
0 5 9 2士 0 . 1 1 5
0
.
6 14士 0 . 0 3 6
3 讨论
实验结果显 示 , 紫外线照射小 鼠肝细胞
后会对线粒体造成损伤 , 这种损伤表现为线
粒体脂质过氧化程度增加 、 膜流动性降低 以
及 C C O 活力降低等方面 ,而且随着紫外线剂
量的增加 ,损伤作用更加严重 。线粒体膜脂受
《中草药 》 1 9 9 9 年第 3 0 卷第 9 期
紫外线照射后发生过氧化 , 导致过氧化脂质
及其分解产物 M D A 含量显著增高 , M D A 易
与膜蛋 白和膜脂上 的一 N H : 交联形成 s hi f 、
碱 ,从 而使膜 的刚性增加 l0[ 〕 , 加上膜 中不饱
和脂肪酸含量的降低 , 于是线粒体膜流动性
下降 。 细胞色素 C 氧化酶活力下降的机制可
能有两个方 面 , 一是酶分 子中的二硫键和 次
级作用力对 紫外线 比较敏感 , 紫外照射后遭
到一 定 程度 的破 坏 , 钝 化 了 该酶 的催化 能
力〔 , `〕 ; 二是膜脂 一膜蛋 白相互作用的变化 , 有
文献报道 〔` “〕 , C CO 活力的表达依赖于完整结
构的心磷脂 的存在 , 心磷脂发生过氧化可能
会间接影响 C CO 的活力 。 紫外线引起的线粒
体膜流动性降低 , 也可能限制 C C O 酶分子构
象的调整 ,从而影响 C C O 发挥正常的生物学
功能 。 黄酮类化合物能够有效地清除 自由基 ,
懈皮素黄酮昔的加人可能捕获了线粒体膜上
的不饱和脂肪酸受紫外线照射后产生的脂类
分子 自由基 , 如 L , L O O , 阻止 了 自由基链反
应 的进行 , 从而有效地抑制膜 中过氧化脂质
的形成 , 减少 了过氧化脂质及其分解 产物对
膜性质的损伤 , 保护 了 C C O 的活力 。 C C O 是
呼吸链最末端 的氧化酶 , 它的活力与线粒体
的功能密切相关 , 因此线粒体的功能得到 了
保护 。
参 考 文 献
l 中国科学院上海药物研 究所编译 . 黄酮化合物鉴定手
册 . 北京 :科 学出版社 , 1 9 81 : 31 4
2 苑可武 , 等 . 中草药 , 1 9 9 7 , 2 8 ( 4 ) : 2 1 1
3 张惟杰 主编 . 糖复合物 生化研究技术 . 杭州 ; 浙江大
学出版社 , 19 94 : 31
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科大学中国协和医科大学联合 出版 , 1 9 9 5 : 4 6 9
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et a l
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B io e h e m B i o p h y s A e t a
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科技出版社 , 19 9 4 : 4 8 9
7 张志 鸿 , 等编 . 生物物理学实验 . 上海 : 复旦大学出版
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8 刑 辉 ,等 . 生物化学杂志 , 1 9 96 , 1 2 ( 4 ) : 4 5 0
9 刘诗平 ,等 . 中草药 , 1 99 1 , 2 2 ( 4 ) : 1 8 3
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.
L ip id P e r o x id e s i n B i o lo g y a n d M e d i e in e
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N e w Y o r k
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A e a d e m i e Pr e s s
,
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1 2 程 昆蓉 ,等 . 生物物理学报 , 19 9 2 , 8 (l ) : 1 4 3
( 1 9 9 8
一
0 3
一
2 8 收稿 )
.
6 7 3
.
2781540.51502