全 文 ：荷叶水提物清除自由基的 ESR研究
余以刚 ,陈海光 ,曾庆孝⒇
(华南理工大学食品与生物工程学院 ,广东 广州　 510641)
摘　要: 目的　研究了荷叶水提物 ( LLE)对羟基自由基 (· OH)和超氧阴离子自由基 ( O÷2 )的清除效果。方法　采用
电子自旋共振法自旋捕集技术。结果　 26. 95μg /m L的 LLE对次黄嘌呤 -黄嘌呤氧化酶体系产生 O÷2 的清除率达
65. 6% , LLE浓度大于 8. 98 mg /m L时可以全部清除由 Fenten反应体系产生的 · OH。 结论　 LLE对· O H和
O÷2 有很强的清除能力。
关键词: 荷叶 ;自由基 ; ESR
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0693 03
Action of lotus leaf extract in scavenging free radicals as studied by electronspin resonance
YU Yi-gang , CHEN Hai-guang , ZENG Qing-xiao
　　 ( Co lleg e o f Food and Bio-enginee ring , South China Univ er sity o f Techno log y, Guang zhou Guangdong 510641, China)
Abstract: Object　 To study the action of lo tus leaf ex t ract ( LLE) in scavengings hydroxyl and super-
ox ide anion radical. Methods　 By spin t rapping w ith elect ron spin resonance. Results　 26. 94 ug /mL LLE
can scavenge 65. 60% superox ide anion radical ( O
÷
2 ) produced by Hypoxanthine-Xanthine oxidase system,
w hi le a t concentrations over 8. 98 mg /mL a complete eradica tion o f hydro xy l radical (· OH) produced
from Fenten reaction system w as achiev ed. Conclusion　 LLE is highly effectiv e in scavenging · OH and
O
÷
2 f ree radicals.
Key words: lotus leaf; f ree radical; elect ronspin resonance ( ESR)
　　荷叶为常用中草药 ,属睡莲科植物莲的叶。荷叶
味苦涩 ,性平。 荷叶含有多种生物碱: 荷叶碱、N -去
甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、牛心果碱、绕袂碱、亚美
帕碱、N -甲基衡州乌药碱、原荷叶碱、鹅掌楸碱及去
氧绕袂碱。另外 ,荷叶中还含荷叶苷、槲皮素、异槲皮
苷以及维生素 C、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸、琥
珀鞣质及含有抗有丝分裂作用的碱性成分 [1 ]。
从荷叶中提取的生物碱及黄酮类物质 ,可用以
降血脂和胆固醇以及用于治疗肥胖病 [2, 3 ]。很多药品
和功能食品中都含有荷叶或荷叶水提物 (简称为
LLE)。
一般研究一种药物对氧自由基的清除效果主要
是研究其对羟基自由基 (· OH)和超氧阴离子自由
基 ( O÷2 )的清除效果。有采用化学发光方法研究荷叶
对体外氧自由基的清除作用的报道 [4 ]。 但电子自旋
共振 ( ESR)是目前直接测定自由基最有效并用得最
多的方法。本实验采用国家生物医学分析中心自由
基与顺磁专业实验室的 ESR300型电子顺磁共振波
谱仪来检测 LLE对· OH和 O÷2 的清除效果 ,进一
步从自由基的角度来研究荷叶的功能 ,从而为荷叶
的深度开发利用提供理论基础。
1　材料
1. 1　实验材料:荷叶于 2000年 8月采自湖北洪湖。
荷叶用 100℃热水提取 ,过滤 ,真空浓缩至干物质含
量为 44. 8 mg /mL,即为 LLE。
1. 2　主要仪器:德国 Bruker ESR 300型电子顺磁
共振波谱仪。
1. 3　主要试剂: 二甲基吡咯啉氮氧化物 ( DM PO )
( Sigma公司 )、 EDTA(分析纯 )、 pH7. 4, 0. 05 mol /
L磷酸缓冲液 ( PBS)、次黄嘌呤 ( HX)、黄嘌呤氧化
酶 (XO)、二乙烯三胺乙酸 ( DT PCA)。试剂均为分析
纯。
2　实验方法
2. 1　· OH检测方法: 在 Fenton反应体系中 ,即
H2O2和 Fe2+ 的反应体系中 ,取配好的 6 mmol /L
H2O2 5μL, 2 mmo l /L Fe2+ 5μL, 50 mmo l /L ED-
·693·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 20001-11-20基金项目:本项目由广东省博士后基金资助作者简介:余以刚 ( 1968-) ,男 , 2000年毕业于无锡轻工业大学食品学院 ,获工学博士学位。 2000年 3月至今在华南理工大学食品与生物工程学院做博士后研究。 研究方向:粮油及植物蛋白工程。
T A 5μL, 0. 8 m mol /L DMPO 5μL和 PBS 30
μL,实验组分别加入不同量的 LLE,相应减少 PBS
的量 ,使反应的最终体积仍为 50μL。混合均匀后立
即吸入毛细管中 ,一端封口后放入谐振腔 ,于 1 min
20 s后测量其 ESR波谱。
测试条件:微波功率 5 mW ,增益 3. 2× 104 ,扫
描时间 41. 94 s,调制幅度 1 G,调制频率 25 kHz,
中心磁场 3470 G,扫场宽度 100G。
2. 2　 O÷2 检测方法:在 HX-XO产生 O÷2 的体系中 ,
取配好的 4. 4 mmo l /L HX 5μL, 0. 7 U /mL XO 5
μL, 1 mmol /L DT PCA 5μL, 0. 8 mmol /L DM PO
5μL和 PBS 30μL。实验组加入不同量的已稀释 1
000倍的 LLE,相应减少 PBS的量 ,使反应的最终
体积为 50μL。充分混匀后吸入毛细管中 ,一端封
口 ,立即测试。
测试条件:微波功率 10 mW ,增益 2× 105 ,扫描
时间 84 s,其它条件同检测· OH的条件。
3　结果
3. 1　荷叶水提物 O÷2 的清除效果:在 HX-XO体系
中产生的 O÷2 ,经 DMPO捕集后在 ESR上得到典型
的 4组 DM PO-OH自旋加合物波谱 ,以波谱第一组
峰的峰高 (或峰面积 )来表示信号的相对强度。 用下
列公式计算清除率:
清除率 (% ) = 本底第一组峰峰高 -样品第一组峰峰高本底第一组峰峰高
× 100%
a-26. 94μg /mL　 b-13. 47μg /m L　 c-8. 98μg /m L　 d-对照
图 1　 LLE对 HX-XO产生 O÷2 的清除作用
由图可见 LLE能显著清除该体系产生的 O÷2 ,
且呈明显量效关系。 26. 94, 13. 47, 8. 98μg /mL的
LLE对 O÷2 的清除率分别为: 65. 60% , 38. 55% ,
35. 10% 。在相同条件下与之相对照 , 2μg /mL的 Vc
对 O÷2 清除率为 50%。
3. 2　 LLE对· OH的清除作用: 在 Fenten反应体
系中 , Fe2+ 与 H2O2反应后产生的· OH,与捕捉剂
DMPO形成自旋加合物 DMPO-OH,在 ESR波谱
仪上呈现特征的 1∶ 2∶ 2∶ 1的波谱 (见图 2)。以波
谱第二峰峰高值 ( mm )表示信号的相对强度。用下
列公式计算清除率:
a-4. 49μg /mL　 b-8. 98μg /m L　 c-13. 4μg /mL　
d-对照
图 2　 LLE对 Fenten体系产生的· OH的清
除作用
清除率= 本底第二峰峰高 -样品第二峰峰高本底第二峰峰高 × 100%
图 2 a、 b、 c分别是加入 13. 47, 8. 98, 4. 49 mg /
mL LLE对体系产生的· OH清除作用。 清除率分
别为:全清 , 97. 1% , 95. 4%。在相同条件下与之相对
照 , 6μg /mL的 Vc对· OH清除率为 40% 。由于所
选 LLE浓对· OH自由基的清除率太高 ,难以计算
浓度梯度对清除效果的影响。
4　讨论
现代医学研究表明: 肿瘤发生、辐射致癌、心脑
血管疾病、器官的缺血再灌流、药物中毒、人体衰老
等过程都与活性氧有关 [5 ]。活性氧包括 O÷2 、· OH、
多种有机自由基 ( R· 、 RO· 、 ROO· )、单线态氧
(
1
O2 )、无机和有机过氧化氢 ( H2O2、 ROOH)等等 ,它
们有很强的生物活性。机体中适量的自由基对细胞
的分列、分化、生长、消炎解毒起着积极的作用 ;而过
量则会引起蛋白质变性 ,酶失活 ,多糖降解 , DN A断
裂 ,生物膜结构损伤 ,细胞解体乃至机体病变和死
亡。 因此对体内过剩自由基的清除就非常有必要。
从实验结果可以看出 , LLE对· OH和 O÷2 有
很强的清除能力 ,而且 LLE对 O÷2 的清除能力比对
· OH的清除能力要大很多。 26. 94μg /mL的 LLE
对 O÷2的清除率达 65. 60% ,大约 40μg /m L的 LLE
就可以全部清除 O÷2 ,而 LLE浓度大于 8. 98 mg /
mL时才可以全部清除· OH。
荷叶具有调节血脂的功能 ,主要活性部位在黄
酮和生物碱 ,作用特点主要是促进胆固醇的代谢 [6 ]。
由此可以得出一个结论: 荷叶水提物是一种非
常优良的抗氧化剂 ,在较低浓度和不需要特别的精
制的情况下即可显示出非常强的抗氧化能力。
荷叶具有如此卓越的性能 ,在医药和功能食品
行业应该得到更为广泛的重视。
参考文献:
[1 ]　中国医学科学院药用植物资源开发研究所 .中药志 [M ].第五
·694· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
册 . 北京:人民卫生出版社 , 1994.
[2 ]　许腊英 ,毛维伦 ,江向东 ,等 .荷叶降血脂的开发研究 [ J] .湖北
中医杂志 , 1996, 4: 42-43.
[3 ]　龚康敏 ,魏克民 ,厉兰娜 ,等 .荷叶饮对高脂血大鼠血脂及血流
变学的影响 [ J ].河南中医 , 1999, 19(2) : 28-29.
[4 ]　肖华山 ,黄代青 ,傅文庆 ,等 .荷叶对体外氧自由基的清除作用
及其对果蝇寿命的影响 [ J ].中国中药杂志 , 1997, 22( 6): 374-
378.
[5 ]　胡天喜 ,陈季武 ,许建营 ,等 . 云芝糖肽和灵芝多糖清除活性氧
的作用 [ J] .生物化学与生物物理学报 , 1992, 24( 5): 465-470.
[6 ]　杜力军 ,孙　虹 ,李　敏 ,等 . 荷叶大豆及其合剂调脂活性部位
的研究 [ J] .中草药 , 2000, 31( 7): 526-528.
何首乌毛状根培养及大黄酚的含量测定
王振华 ,杜　勤 ,刘　浩 ,许晓峰 ,张俊荣 ,简慧兰* ,李　莉* ,曾绍培⒇
(广州中医药大学 中药学院 ,广东 广州　 510407)
摘　要:目的　测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法　用发根农杆菌 Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体 ,
均可诱导出毛状根 ,并能合成大黄酚 ,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。 结果　毛状根中大黄酚的含量为
0. 0164%。 结论　该毛状根具有典型的毛状根形态特征 ,大黄酚含量低于何首乌药材。
关键词: 何首乌 ;毛状根 ;大黄酚
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0695 02
Culturing of hairy root of Polygonum multiforum and
determination of its chrysophanol content
W ANG Zhen-hua, DU Qin, L IU Hao , XU X iao-feng , ZHANG Jun-rong ,
JIAN Hui-lan, LI Li, ZENG Shao-pei
　　 ( Co lleg e o f Chinese Materia Medica, Guang zh ou Univ ersity of TCM , Guang zhou Guangdong 510407, China)
Abstract: Object　 To determine the content of ch rysophano l in th e cultur ed hair y ro o t o f Polygonim multiforum Thunb.
Methods　 Hair y r oo t of P . multiforum w as induced from stem and leaf explant w ith ag r obacterum rhizogens Ri 15834, and
its chr ysophanol content determined by TLCS. Results　 The t ransferr ed ro ot showed typica l hairy cha racteristics and could
synthesize ch ry sophano l to a content o f 0. 016 4% as determined by T LCS. Conclusion　 Content of chr ysophanol in the cul-
tured hair y r oo t wa s lowe r than that o f the c rude medicinal material.
Key words: Polygonum multiforum Thunb; hairy ro ot; ch ry sophano l
　　何首乌 Polygonum mult if lorum Thunb. 是著
名的常用传统中药 ,药用块根 ,具有补肝肾、益精血、
乌须发、强筋骨等功能。何首乌的化学成分主要有蒽
醌类化合物、卵磷脂以及微量元素等。
毛状根培养是植物细胞培养一种新技术。 毛状
根培养系统具有生长迅速、不需要外源生长激素、产
生次生代谢产物稳定等优点。目前已开展毛状根培
养药用植物 [1, 2 ]。但关于何首乌毛状根及其有效成分
方面的研究未见报道。本研究采用发根农杆菌 Ri
15834菌株感染何首乌茎、叶外植体 ,诱导出毛状
根 ,并对毛状根中大黄酚进行含量测定。
1　材料与方法
1. 1　细菌培养:取发根农杆菌 Ri 15834菌株 ,接种
到 YEB固体培养基中活化 ,然后转移至 YEB液体
培养基中振荡培养 ,使处于指数生长期 ,用于转化何
首乌。
1. 2　外植体制备: 取何首乌茎、叶 ,在 75%乙醇中
浸泡 0. 5 min,再用 0. 1%升汞消毒 15 min。无菌水
冲洗干净后 ,茎切成 1 cm长的小段 ,叶切成 1 cm×
1 cm的小块 ,接种于无激素的 MS0培养基上预培养
48 h后用于转化。
1. 3　毛状根的诱导: 将上述外植体浸入用 MS培
养液稀释 1倍的农杆菌菌液中 10 min,取出 ,吸干
多余液体 ,置 MS0为培养基上培养两天后取出 ,转
入含 500 mg /L羧苄氨基青霉素的 M S培养基中 ,
21℃暗箱培养。
1. 4　毛状根的培养: 将长度超过 3 cm的毛状根转
移到 M S0固体培养基上继代培养 ,以后每 21 d继代
·695·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-09-17基金项目:本研究为广东省中医药管理局课题 B96— 31的一部分研究内容作者简介:王振华 ( 1966-) ,男 ,硕士研究生毕业 ,讲师。 研究方向:中药制剂研究、中药质量、标准制订、中药新资源的开发利用。
* 广州中医大学 98级中药资源专业本科生