免费文献传递   相关文献

Tissue Culture of Thickstemen Gentian(Gentiana crassicaulis)and Plant Regeneration Through Somatic Embryogenesis

粗茎秦艽组织培养及再生植株



全 文 :粗茎秦芜组织培养及再生植株
兰州大学生物系 ( 7 3。。 0 0) 孟玉玲. 贾敬芬
摘要 用粗茎秦芜 G。 。 t fa a n e ra s o i。 a o l i。子叶和下胚轴为材料 。 在 M S+ Zm g /L Z, 魂一 D + 0 . 5
m g / L B A的培养基上进行培养 , 子叶及下胚轴的出愈率为 1 0 % 。 愈伤组织继代培养于M S + 0 . 5
m g / L Z
,
4刃 + o . s m g / L B A + o . s m g / L N A A + 50 o m g / L L H + 3倍M S有机物和维生素的培
养基上生长旺盛 。 愈伤组织转入分 化培 养基M S + l m g / L N A A + Zm g / L B A + 3m g / L z T + 3
m g / L G A + s o o m g / L L H + 6 %蔗糖 + 3倍M S有机物和维生素 + 3倍 F e S O 一 ( N a : 一 E D T A ) 上
培养 , 其中40 %形成体细胞胚 。 体细胞胚在无激素M S培养基上发育成苗 。
关键词 秦芜 组织培养 体细胞胚胎发生 再生植株
秦芙是国家重点保护野生药材之一 。 秦芜以根入药 , 能祛风湿 , 退虚热 , 止痹痛〔。 。 秦
芜主要含龙胆苦贰等生物碱 , 秦芜生物碱对抗风湿性关节炎有显著作用 (2 〕 。 粗茎秦芜属龙胆
科植物 , 组织培养成功的龙胆科植物只有龙胆草 G即 t i a肋 s c a b r a B u n g e 〔3〕和 东 北 龙胆
G
. 。 。 。 s加 r i o a K it ag 〔` 〕。 粗茎秦芜 的组织培养在国内外尚未见报澎。 粗茎秦充为国家药典
规定的 4种商品秦羌之一 。 近年来野生资源大量减少 , 应用组织培养方法繁殖和保存野 生 药
用植物种质已成为必需 。 今通过体细胞胚胎途径获得粗茎秦芜再生苗 , 具有诱导周期短 、 再
生苗频率高 、 无玻璃化苗 、 苗具有健状的根等优点 。 为粗茎秦苏的人工繁殖 , 选育药用成分
含量高的突变系提供可靠的实验基础 。
1 材料和方法
粗茎秦芜种子经 70 % 乙醇浸泡 30 5 , 0 . 1% 升汞浸泡 8 ~ 10 m in , 无菌水冲洗 3一 4 次 , 接
入无激素M S培养基 中 , 生长至子叶完全展开 , 苗高约 cZ m , 将子叶及下胚轴切成段 , 然 后
分别接入各种诱导培养基 ( 表 1 ) 上诱导形成愈伤组织 ( 图 , 1 、 2 ) 3周后统计形成愈伤组织
的外植体数 , 并计算出愈率 。 出愈率% 二 形成愈伤组织的外植体数 /接入外植体数 x 1 0 % 。
形成的愈伤组织继代保存于 M S + o . s m g / L Z , 4一 D + o . s m g / L B A + o . s m g / L N A A +
5 0 m g / L L H
+ 3倍M S有机物和维生素的培养基上 。 将形成的白色松软愈伤组织切割为直径
3 ~ 4 m m 的小块 , 分别放在不 同培养基 ( 表 2 , 3 ) 上进行对比实验 。 3周后统计在愈伤组织上
形成体细胞胚的情况 。 体细胞胚诱导率% = 形成体细胞胚的愈伤组 织 块数 /接种的愈伤组 织
块数 x 1 0 % 。 体细胞胚在实体显微镜 O P T O N 上观察并照相 ( 图 , 4 ) 。 形成体细胞的愈伤组
织块转入无激素 M S培养基上 , 在光照 15 0 0~ Z o 0 lx 下培养 , 2周 后 就 形成具有根的健壮 苗
( 图 , 5 ) 。 培养基均以 M S为基本培养基 , 用 l m o l / L N a 0 H调 p H S . 8~ 6 . 2 , 0 . 8% 琼 脂 固
化 。 在昼夜温 度 25 ℃ / 18 ℃ , 光强 8 0 ~ 1 0 0 lx , 光暗交替 1 4 / 1 h0 的条件下培养 。 所有统计
数据是 3次重复的平均值 。
2 结果和讨论
2
.
1 粗茎秦芜愈伤乡_ 织的诱写 : 子叶及下胚轴诱导形成愈伤组织的实验 结果 见 表 1 。 在 含
Z m g/ L Z
, 4一 D 和。 . s m g / L B A 的培养基上 , 下胚轴经大约 7 d培养后在其切口处形成 白色
松软愈伤组织 , 相比较 , 子叶切块形成愈伤组织较迟缓 , 形成的愈伤组织稍带黑色而且具粘
性 , 生长缓慢 。 无 2 , 4一 D 时 , 出愈率为零 , 只加 l m g / L Z , 4一 D 出愈率上升到 30 % ~ 4 % 。
. 人 d d r o s s : M e u g Y u l i n g , D e P a r t m e n t o f B i o l o g y , L a n 乞 h o u U n i v e r s i t y , L a n 落h o u
《中草药》 1 9 9 5年第 2 6卷第 1 0斯 . 5 3 7 -

可能与供试的植物种类和诱导材料有关 。 细胞分裂素对体细胞的诱导有较为显著的 促进 作
用 , l m g / L B A 与 l m g / L Z T配合 , 诱导率为 5% ~ 6% 这与 红豆草〔的体细胞胚的诱导结果
相一致 。 l m g / L N A A + 会m g / L B A + 3m g / L Z T + 3 m盯 L G A 3配合使用 , 可将诱导率
提高到 12 % ~ 20 % ,达到最佳诱导效果 。在体细胞胚的发生中激素起着非常重要的作用 , 这一
点已由大量的报道所证实 。 但对于不同的植物种类及不同的诱导材料来说 , 诱导体细胞胚所
要求的激素种类 、 组合和用量都不相同 。
2
.
3
.
2 蔗糖、 水解乳蛋白 ( L H ) 、 M s有机物和维生素及 F e s o ` ( N a Z一 E D T A ) 对体细胞
胚发生的影响 : 以下胚轴来源的愈伤组织为材料 , 选用诱导效果最好的激素组合 , 然后分别
加入蔗糖等 4类物质 , 结果见表 3 。 蔗搪浓度从 3%提高到 6% , 可使休细胞胚诱导率从 20 %提
高到 42 % 。 效果汲为显著 。 已有报道阐明高浓度蔗搪对体细胞胚的发生有显著的 促 进 作 用
〔9〕。 5 0 0琪 g / L L H , 3倍M S有机物和维生素和 3倍 F e S O ` ( N a : 一 E D T A ) 的加入刘体细胞
胚的发生有明显的促进作用 。 4种物质配合使用 , 可使诱导率提高到 5 ,% 。 复合添加物 质 对
体细胞胚发生的促进作用 已在许多实验中得到证实〔的 。 培养基中常常加入各种 生 长辅助物
质如肌醇 、 烟酸 、 V B : 、 V B。等 , 对培养未分化的幼胚是必须的〔7 〕。
2
.
3
.
3
、 体细胞胚植株的形成 : 将形成体细胞胚的愈伤组织转入无激素的M s培养基中 , 2周后
成形 cI m左右的具根小苗 ( 图 , 5 ) 。 外源激素的加入对体细胞胚的进一步发 育 不 利。 A l-
A b at 等〔功〕认为从细胞决定到球形胚阶段依赖于外源激素的存在 , 但球形胚以后的发育受到
外源激素的抑制 。 粗茎秦大的体细胞胚的发育符合上述规律 , 形成的体 细胞 胚 在无激素的
M S培养基上分化成苗率可达 9 0% 以上 。
致谢 ; 扭茎秦尤种于由西 书高原生物研究所刘建 全同志咭送 , 在此深表谢意 。
, 考 文 献
王晓燕 . 中草药 , i 。。s , 2魂 ( 一 ) : 1 5 ,
宋振玉 , 等 . 生理学报 , i , 5吕, 22 : 2 0 1
张治国 , 等 。 浙江人民卫生实验院院报 , 1 9 8 3
( 3 4 )
:
2 1 7
刘伟华 , 等 . 遗传 , i , , 2 , i 通 ( s ) : 2 7
庄承纪 , 等 。 实验生物学报 , 1 9 85 , 18 ( 3 》 : 2 75
谷祝平 , 等 。 实验生物学报 , 1 , 8 8 , 21 ( 2 ) : 1相
胡适宜 , 著 。 被子值物胚胎学 . 北京 : 人民教育出
版社 , 1 9 8 3 . 1 9 8
E v a n s D A
, e t a l

P l
a n t a T i s s u e C u l t u
·
r e , M e t h o d s a n d A P P l i c a t i o n i n 人 g r -
五c u l t u r e 。 N e w Y o r k : A e a d e m i o P r e s s ,
19 8 1

4 5
L u C Y
, e t a l

J

P l a n t a P h y s i o l
,
1 9 8 4
,
1 1 5
:
2 3 7
A I

A b r a S
, e t a l
.
N e w P h y s i o l o g i s t
,
19 79
, 8 2 : 2 9
4667
( 2 9 9 4
一 0 5一 16 `}觉稿 )
(上接 第5 2 3页 )
5
. 谁 紫外吸收光谱图一致 , 层析图谱 , 除了冷浸 正丁醇萃取 、 硅胶柱层 析 外 , 其余层析图
谱一致 。 因此 , 用甲醇冷浸法一步提取趁可作为葛根 总黄酮的提取工艺 。
5
.
5 通过对葛根总黄酮薄异层析巾 , 5神展开溶媒的比较说明 , 以氯仿一甲醇一水 ( 7 · 2 ` 5 :
0
.
2 5 ) 为最佳呢开挤媒 。 因此 , 可作为葛根总黄酮分离时的 哎开溶媒 。
参 考 文 献
i 李树珍 , 等 。 中草药 , l , 9 4 , 2 5 ( g ) : 4 , 6
2 郭建平 , 等 。 中草药 , 一, , s , 2 6 ( 3 ) : 1 6 5
3 顾学裘 主编 。 药 物制剂注解 . 北京 : 人民卫生出版
社 , 1 9 8 1 . 1 6 3
4 K i
n
j
o J F
, 七 t a l . C h e m P h a r m B u l l ,
1 9 8 1
,
3 5 ( 1 2 )
:
48 4 6
5 中国医学科学院药物研究所 。 药学通报 , 1 9 8 0 , 15
( 7 )
: 4 0
6 野原捻弘 , 他 . 现代东洋 医学 , l , 9 2 , 1 8 ( 3 ) : 7 9
7 中国药典 . 1 , , 0 . 2 9。
( 19 9 5
一 0 2一 1 5收稿 )
《中草药 》 1 9 9 5年第 26 卷第 10 期 5 3 9
f Ef ec to f

G y
no s t e爪脚 a户含” r a P几夕11:: tnM a ki no ex tr a e to nr hv ei tal i ty a nl di f e一 s P a no f t h -
r 0 nyu nd e b el l y wa tr ef l o a, a s s t u d i e d
.
R o s : 11 ; 、 h o , e l t 扭、 t 立 11 0 . 0 1 25丫, 0 . 0 2 5 0%, 0 . 0 5 0 0%
a n d o

1 0 0 0石 e x r r a e 亡 。 f G . P : l t J P I夕11 ,`川 s ;多 n i f i : n n r l y e f f o e t e d t h e g : o w t h , d e v e l o P m e n t ,
r e p r o d u c t i o
n a n d l i f e s p a n o f t h e w a t o r f l e a
.
( 0 r i g i n a l a r t i e l e o n P a g e 5 2 7 )
E f f e e t o f J i n y in g z i ( R
o s a l a e o i g a t a ) A 畏u o o u : E x t : a e 七 o n U : i n a : y S y s t e m
L u Y i n
,
S u n Z h i g u a n g
,
X u H u i q i
, e t a l
J 1n y i n g z i 15 t h e d r y r i P : f r u i r o f 尸 。 ; a l 召 J v g ; t J 从 i e h x 二 I t e o n t a i n s m a i n l y t a n n i e a c -
i d
,
m a l i o a c i d
, c i t r i c a c i d
, v i t a 盯 i n C a n d s a P o n i n s 。 I t s e f f e c t o n u r i n a r y s y s t e m w a s s t -
u d i e d o n m o u s e p o l l a k i u r i a m o d e l b y s e v e r i n g h y P o g a s t r i e n e r v e
.
R e s u l t s s h o w e d t h a t t h e
w a t e r e x t r a e r o f 尸 . l a e 口 s g a 才a c a n d e e r e a s e t h e f r o q u e n e y a n d P r o l o n g r h e i n t e r v a l o f u r i -
n a r i o n a n d i n e r e a s e 〔 h e q u 压 n r i 上y o f e 飞 : 恤 u r i d i t i 〕 几 . T 连己 5 1 11 弓 瓜 之厂毛 了 乙 e 飞 几 i n h i b i r t h e a u t -
o
m
a t i e ` o n t r a e r io n o f i s o l a t e d r a bb i t j e j u n a l s m o o t h m u s c le a n d a n t a g o n i z e t h e s p a s m o d i c
c o n t r a c , i o n a r o u s e d b y a c e t y l c h o l i n e a n d b a r i u m e h l o r i d e o f i s o l a t e d r a b b i t j
e
j
u n a l s m
o o -
t h m
u s c l e
, a n d i s o l a t e d v e s i e a l s m o o t h m u s c l e o f m o u s e
, a n d a n t a g o n i z e r e a e t i o n o f c o n t
-
r a c t i l i t y a r o u s e d b y n o r a d r e n a l i n o n i s o l a t e d t h o r a e i c a o r t a s t r i p s o f r a bb i t
.
A l l o f t h e t h e
t h r e e i n h i b i t i
o n s o f s m o o t h m
u s e l e c o n t r a e t i o n s h o w e d s i g n i e a n t d o s e
一 r e s P o n s e e u r v e
.
( 0 r i g i n a l a r l i e l e P a g e 5 2 9 )
i n f l u e n e e o f S a f f l o w ” : ( C a r t h a nt u s t ` n e t o r `u s )
o n C a
, +
T r a n s m e m b r a n e In f l u x i n R a t A o r t a
M o S h a n g w u
,
C h e n Z h i h
e n g
, e t a l
I n f l u e n e e o f C a r t h a 川 ,: 5 t f” e t o r f “ 5 L . h a s b e e n s t u d i e d o n C a “ 申 t r a n s m e m b r a n e i n f l u x
i n r a t a o r t a w h e n i t s e x t r a e t w a s u s e d a t s
,
5 0
,
5 0 0 卜g / m l
.
I t w a s s h o w n t h a t t h e r e s t i n g
` s
C a i n f l u x i n r a t a o r t a r i n g w a s n o t a l r e r e d b y C
.
t`。 e t o r f “ 5 b u t t h e ` 石 C a i n f l u x e v o k e d b y
n o r e p i n e p h r i n e ( 1
.
2 义 1 0 一 ’ m o l / L ) a n d K c l s o l u t i o n ( 1 0 o m m o l / L ) w a s i n h i b i t e d i n a c o n e e n
-
t r a t i o n

d e P e n d e n t m a n n e r
.
T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e c e P t o r
一 o P e r a t e d C a
2 . e h a
-
n n e l ( R O C ) a n d P o t e n r i a l

d e p e n d e n t C a
Z 申 e h a n n e l ( P D C ) i n e e l l m e xn b r a n e o f s m o o t h m u s
-
c l e c o u l d b e b l o e k e d b y C
.
t ` n 。 才o r ` 5 a s w e l l a s b y v e r a p a m i l .
( 0 r i g i n a l a r t i e l e o n p a g e 5 3 2 )
T s s u e
a n d
C u !
:

u : e 。 f T ’ : i e k : : e io e n G e n t i a n ( 仔。 n t `。 n a c r a s s £c a u l£s )
P la n t R e g e n e 犷a t i o n T I、 r o u g : ; S o m a t i e E : l b r y o g e n e s i s
M e n g Y u l i n g
,
J i a J i n g f e n
C a l l u s o f G
e ” t i a ” a c r a £ s : e e z` I f s w a s i n i t i a t e d f r o m h y p o e o t y l a n d e o r y l e d o n o n M S m e d i u m
s u P P l e m
e n t e d w i t h Zm g / L 2
.
4一 D a n d 0
.
5 m g / L B A
.
I n d u c t i o n f r e q u e n e i e s o f e a l l u s 下 。 r o 1 0 0% 。
s o m
a t i e e m b r y o : w e r e f o r m e d o n M S m e d i u m c o n t a i n i n g Z m g / L B A
,
3工n g / L Z T
, i m g / L N A A
,
3 m g / L G A
, t h r e o t i m o M S o r g a n i e s a n d y 圣t a m i n s , 6落 s u c r o s e a n d s q o m g / L L H a n d t h r e e t i m e
F e S O
`
( N a
:
E D T A )
。 4 0笼 C a l l u s P r o d u c e d s o m a t i e e 位b r y o s . l t d e v e l o P e d i n t o c o m P l e t e P l a -
n t s o n h o r m o n

f r e e M S m e d i u m

( o r i g i n a l a r t i c l e o n p a 吕e 5 3 7 )

5 6 0
-