全 文 :书广 西 植 物 Guihaia Feb.2015,35(1):92-98 http://journal.gxzw.gxib.cn
DOI:10.11931/guihaia.gxzw201310016
马林龙,顾辰辰,邓威威,等.大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆[J].广西植物,2015,35(1):92-98
Ma LL,Gu CC,Deng WW,et al.Determination of theanine and cloning of theanine synthetase gene in Dabieshan wild Camellia oleifera[J].Guihaia,
2015,35(1):92-98
大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆
马林龙,顾辰辰,邓威威,金 阳,宛晓春*
(安徽农业大学 农业部茶树生物学与茶叶加工重点实验室,合肥230036)
摘 要:茶氨酸是茶树叶片中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生理药理功能,但迄今仅在蘑菇、蕈和一些山
茶科(属)植物中检测到茶氨酸。茶氨酸因有一种独特的风味特色“umami鲜爽味”而被人类营养学广泛研究,
并发现合成茶氨酸的植物不仅在植物分类上具有积极意义,而且对于植物资源的有效发掘有巨大经济价值;
同时还可以间接去研究茶树中茶氨酸的代谢机理以及茶氨酸合成酶的分离纯化和TS基因的克隆表达。该
文运用 HPLC、LC-TOF/MS对大别山地区野生幼年与成年油茶根、叶中茶氨酸进行检测,并结合分子生物学
手段对油茶中茶氨酸合成酶(theanine synthetase,TS)基因进行克隆与生物信息学分析。结果表明:在幼年的
油茶根中检测到茶氨酸,含量为0.08mg·g-1(鲜重),而在幼年的油茶叶片和成年油茶根、叶中均未检测到茶
氨酸;在幼年油茶根中克隆出一条长为1 071bp油茶TS基因开放阅读框,其基因序列与茶树谷氨酰胺合成
酶(glutamine synthetase,GS,AB117934)基因和TS(DD410896)序列的同源性达到98%,氨基酸序列与茶树
中GS(AB117934)和TS(DD410896)的相似性高达99%。经生物信息学分析,该序列编码的TS蛋白具有20
个磷酸化位点,不存在信号肽序列与跨膜结构,含有卷曲螺旋结构的亲水性细胞质蛋白。该研究将为油茶新
经济价值的发掘,为茶氨酸在油茶中合成代谢途径的研究提供一定的理论基础,同时也为进一步研究茶氨酸
在茶树中代谢机理提供了新的研究思路。
关键词:油茶;茶氨酸;茶氨酸合成酶;基因克隆
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2015)01-0092-07
Determination of theanine and cloningof theanine
synthetase gene in Dabieshan wild Camelia oleifera
MA Lin-Long,GU Chen-Chen,DENG Wei-Wei,JIN Yang,WAN Xiao-Chun*
(Key Laboratory of Tea Biology &Processing of Ministry of Agriculture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)
Abstract:Theanine was discovered as the most abundant free amino acid in Camellia sinensis leaves with many physi-
ological and pharmacological function.However,only limited reports have subsequently been published about theanine
in the plant kingdom,for instance,mushroom,Xerocomus badius,and some theaceae plants.Theanine has been ex-
tensively studied about human nutrition for tea unique taste characteristic“umami”.Moreover,synthesize theanine
has not only positive significance in plant classification,but also great economic value for the effective exploration of
the plant resources.Furthermore,the mechanism of theanine synthesis in C.sinensis,separation and purification of
theanine synthetase and cloning and expression of TS gene were indirectly studied.And HPLC and LC-TOF/MS
were applied to determine theanine in the roots and leaves in the young and mature Dabieshan wild C.oleiferaplants
收稿日期:2014-02-25 修回日期:2014-09-18
基金项目:国家自然科学基金(31300576,31170283);2012年安徽省博士后研究人员科研活动经费资助项目;安徽农业大学青年科学基金自然
科学类重点项目(2011-15)。
作者简介:马林龙(1988-),男,安徽庐江人,硕士研究生,主要从事茶叶生物化学与分子生物学方面的研究,(E-mail)myth1367101@126.com。
*通讯作者:宛晓春,教授,博士生导师,主要从事茶叶生物化学、食品化学领域的研究,(E-mail)xcwan@ahau.edu.cn。
while molecular biology methods were used to clone theanine synthetase(TS)gene in C.oleifera;Bioinformatic a-
nalysis was carried out to analyze the gene sequence.The results revealed that the theanine content of roots in young
C.oleifera plants was 0.08mg·g-1(fresh weight).However,theanine was not detected in leaves of young plants.It
was also found there was no theanine in the roots and leaves in mature C.oleifera plants.One TS ORF(1 071bp)
was acquired from the roots in young C.oleifera plants.The homology of the cloned TS with glutamine synthetase
gene(GS,AB117934)and TS (DD410896)were up to 98%.Moreover,the cloned TSshowed a high similarity a-
bout 99%to GS (AB117934)and TS(DD410896)fromC.sinensis at the protein levels.We found that there were
20phosphorylation sites in the polypeptide chain after bioinformatic analysis.Bioinformatics prediction showed that
the protein contained hydrophilic and winded helix domain.However,there was neither signal peptide nor transmem-
brane in the sequences,and the protein was non-secreted which functioned in the cel.This paper would provide theo-
retical basis and new approach for study of the synthesis,metabolic pathways and metabolic mechanism of theanine.
Furthermore,it was beneficial to develop economical value of C.Oleifera.
Key words:Camellia oleifera;theanine;theanine synthetase;gene clone
茶氨酸(N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)是茶树中最丰
富的游离氨基酸(Yamaguchi et al.,2000),迄今仅
在蕈和某些山茶科(属)植物中有见报道(Casimir et
al.,1960;Li et al.,2008;Tsushida et al.,1984;
Deng et al.,2010)。目前,对于茶氨酸的健康功能
报道很多,主要基于茶氨酸的降压安神、缓解生理及
心理紧张、抗肿瘤以及拮抗咖啡碱引起的神经系统
兴奋等重要生理功能(Kakuda,2002;Kimura et
al.,2007;Smit et al.,2000;Hindmarch et al.,
2000;Shimbo et al.,2005)。因此,发现可以合成茶
氨酸的新植物不仅在植物分类上具有积极意义,同
时对于植物资源的有效发掘也具有巨大经济价值。
油茶(Camellia oleifera)是山茶科山茶属多年
生常绿乔木,是我国特有的木本油料树种,对我国生
态经济林的发展有着不可取代的作用(袁德义等,
2007),同时也是世界四大木本食用油料植物之一
(庄瑞 林,2008;胡 芳 名 等,2005)。Deng et al.
(2010)在21种山茶科(属)植物中检测到茶氨酸的
存在,但油茶叶片中是否含有茶氨酸,其自身是否具
有茶氨酸的合成机制至今并不十分明确。本研究以
大别山地区野生油茶苗(5个月)和油茶植株(3年
生)为研究材料,对其中的叶部和根中是否含有茶氨
酸进行了检测,并对油茶中的茶氨酸合成酶基因进
行了克隆与序列分析。这些结果将为明确油茶中的
茶氨酸代谢机制,提高油茶的经济价值具有重要
作用。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料 试验样品大别山野生幼年油茶苗
(5个月)根、叶和大别山野生油茶植株(3年生)根、
叶,属于油茶中普通油茶寒露籽型(庄瑞林,2008;陈
永忠,2008;金笑龙等,2011),采于安徽省舒城县河
棚镇安徽德昌苗木有限公司试验田。
1.1.2试剂与仪器 试剂:色谱级乙腈(TEDIA公
司),L-茶氨酸(源叶生物科技有限公司),三氟乙酸
(Sigma aldrich公司),PrimeScriptⅡ1st strand cDNA
Synthesis Kit(DRR019A)、PrimeSTAR HS DNA
Polymerase(DR010S)、La Taq(DRR002A*)、pMD18-
T Vector(D101A)、DL 2 000DNA Marker(D501S)购
于 TaKaRa 公 司。植 物 总 RNA 提 取 试 剂 盒
(DP432)、胶回收试剂盒(DP209-02)、质粒提取试剂
盒(DP103-02)购于TIANGEN公司。蒸馏水(屈臣
氏)。其它试剂均为分析纯。仪器:飞行时间质谱仪
(TOF-MS,美国Agilent公司),Waters 600高效液
相色谱,Phenomenex粒径5μm的ODS 250mm×
4.6mm C18反相柱。DK-8D型电热恒温水槽(上
海一恒科技有限公司),Eppendorf 5804R低温离心
机,Beckman AlegraTM 64R Cenfrifuge,DHG-
9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备
有限公司),电子天平 AR124CN(奥豪斯仪器上海
有限公司),BIO-RAD的S1010TM Thermal Cycler
和 Molecular ImagerChemiDocTM XRS+Imaging
System。
1.2方法
1.2.1样品中茶氨酸的检测 称取油茶根、叶组织鲜
重0.5g(准确至0.000 1g),微波炉内适度杀青,加
5mL沸水,于沸水浴中加热浸提30min(每隔5
min摇动1次),浸提完毕后进行研磨后,5 000r/
min离心10min,取上清,将沉淀再次重复进行浸
391期 马林龙等:大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆
提,将2次所得上清混合定容至10mL,摇匀。取一
部分试液,通过0.22μm水相滤膜过滤待测,采用三
氟乙酸方法对样品中茶氨酸检测(施倩等,2006)。
茶氨酸LC-TOF/MS检测色谱条件:美国Agi-
lent公司飞行时间质谱仪(TOF);真空脱气机;自
动进样器;二级阵列检测器(DAD);流速1mL/
min;流动相:A相0.2%乙酸,B相50%乙腈;线性
变化范围为0~20min:A相98%,B相2%;20~30
min:A相50%,B相50%;30~31min:A相10%,
B相90%;31~40min:A相98%,B相2%;二级阵
列检测器实时监测强度的波长定为280nm和340
nm。紫外光谱连续记录100到600nm的范围的波
峰。电喷雾离子源(ESI);雾化气压30Psi;氮气流
速12L/min;离子化电压为4 500V。
1.2.2茶氨酸合成酶基因的克隆与测序 按TIAN-
GEN公司的总RNA 提取试剂盒(DP432)说明书,
对幼年油茶根样品进行总 RNA 提取。用Prime-
Script Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Kit
(DRR019A)将提取的总RNA反转录成cDNA。根
据在 GenBank 已 登 录 的 茶 氨 酸 合 成 酶 TS
(DD410896)基因的ORF序列设计引物:TS-F1:5′-
CGCGGATCCATGTCTTTGCTATCAGATCT-3′
TS-R1:5′-TTGTCGACTCATGGCTTCCACAG-
CAGA-3′。按PrimeSTAR HS DNA Polymerase
(DR010S)说明书扩增目的片段,用 TIANGEN公
司胶回收试剂盒对目的条带纯化,将目的片段末端
加A然后连接到pMD18-T Vector(D101A)中,转
化到感受态细胞 DH5α中进行阳性克隆筛选送往
Invitrogen公司进行测序。用生物学软件(DNA-
MAN、DNASTAR)对测序结果与GenBank已登录
的相似序列进行比对分析。
1.2.3茶氨酸合成酶基因的生物信息学分析 用生
物学软件(DNAMAN、Mega4.0)对油茶TS蛋白氨
基酸序列进行比对和进化树生成与分析,用http://
web.expasy.org/protscale/、http://www.expasy.
org/tools/、http://web.expasy.org/protscale/(张
哲敏等,2013),http://www.cbs.dtu.dk/servicees/
signalP/、http://ch.embnet.org/software/tmpred_
form.html(王琦等,2013),Netphos 2.0Serve、ht-
tp://psort.nibb.ac.jp(李娟等,2011)在线分析软件
分别对油茶蛋白的亲/疏水性、信号肽、跨膜结构、磷
酸化位点、亚细胞定位进行预测与分析。
2 结果与分析
2.1油茶中茶氨酸HPLC和LC-TOF/MS分析
幼年油茶根与茶氨酸标样在5.5min左右都有
茶氨酸的特征峰出现(图1),笔者初步认为幼年油
茶根可能有茶氨酸的存在,但含量很低。为进一步
确定幼年油茶根中是否含有茶氨酸,将幼年油茶根
样品进行LC-TOF/MS检测分析,在保留时间3.8
min左右幼年油茶根和茶氨酸标样都有特征峰出现
(图2),MS分析结果显示,样品的母离子峰的质荷
比(m/z)为175.1(图3:A),母离子碎片峰的质荷比
(m/z)为158.1(图3:B),数据分别与标准品茶氨酸
数据一致(图3:C,图3:D),这证明幼年油茶根中有
茶氨酸的存在。用三氟乙酸方法对幼年油茶根、叶
和成年油茶根、叶样进行定量分析(图1),在幼年油
茶的根中检测到茶氨酸且含量为0.08mg·g-1
FW,而在幼年油茶叶和成年油茶根、叶中均未检测
到茶氨酸存在。山茶科某些植物中也有类似报道,
Tsushida et al.(1984)以山茶和茶梅为研究对象,指
出山茶和茶梅中的茶氨酸是种子萌发期间所特有并
随着山茶和茶梅的生长,茶氨酸含量减少,且在一年
生山茶和茶梅新梢和根中均未检测到茶氨酸。
图1 幼年油茶根及茶氨酸标样的 HPLC色谱图
1.茶氨酸标样;2.幼年油茶根样品。
Fig.1 HPLC chromatograms of theanine standard and
the root sample of young C.oleifera plants
1.Theanine standard;2.Identification of theanine
in roots of young C.oleifera plants.
表1 幼年和成年油茶中茶氨酸分析结果
Table 1 Determination of theanine in leaves and
roots in the young and mature C.oleifera plants
样品名称
Samples
幼年油茶 Young plant
根 Root 叶Leaf
成年油茶 Mature plant
根 Root 叶Leaf
茶氨酸含量
Content of
theanine
(mg·g-1FW)
0.08±0.02 未发现
Not
detected
未发现
Not
detected
未发现
Not
detected
49 广 西 植 物 35卷
图2 幼年油茶根(A)及茶氨酸标样(B)LC-TOF/MS色谱图
Fig.2 LC-TOF/MS chromatograms of the root sample of young C.oleifera plants(A)and theanine standard(B)
图3 幼年油茶根的LC-TOF/MS分析 A.幼年油茶根的一级 MS;B.幼年油茶根的二级 MS;
C.茶氨酸标品一级 MS;D.茶氨酸标品二级 MS。
Fig.3 LC-TOF/MS chromatograms of theanine in young C.oleiferaroot A.Identification of theanine in roots of young
C.oleifera plants by MS;B.Identification of theanine in roots of young C.oleifera plants by MS2;
C.Identification of theanine standard by MS;D.Identification of theanine standard by MS2.
2.2油茶TS基因克隆及序列分析
在幼年油茶根中克隆了一条约1 100bp的目
的片段(图3),经测序可得该片段长为1 071bp。
将该序列与 GenBank已登录的TS 序列进行比较
分析,所扩增的片段与GenBank中登录的TS 开放
阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长(1 071
bp)同源性很高。将测序结果在NCBI中比对发现,
其基 因 序 列 与 茶 树 GS (AB117934)和 TS
(DD410896)序列的同源性达到了98%,但与茶树
另一条TS(DD410895)一致性只有82%,氨基酸序
列与茶树GS(AB117934)和TS(DD410896)同源性
高达99%。对油茶与茶树中TS、GS蛋白序列进化
树分析可知,油茶TS 序列与茶树TS(DD410896)
序列聚类,而与茶树TS(DD410895)距离较远(图
5),推论油茶TS基因和茶树TS基因一样为GS基
因家族成员,但是由于进化上的突变导致蛋白结构
的变化从而改变了其催化的活性中心,形成新的催
化功能。油茶与茶树的亲缘关系非常近,有着共同
的进化祖先,其氨基酸序列和保守元件结构较为相
似。而所克隆的油茶TS基因与茶树TS基因差异
591期 马林龙等:大别山野生油茶中茶氨酸检测与茶氨酸合成酶基因克隆
可能由于种间关系的存在,在进化过程中基因突变
引起的。
图4 油茶TS全长cDNA的扩增
M.DNA分子量标准;1.幼年油茶根PCR产物。
Fig.4 Agarose gel electrophoresis for the cloned
ful length TSof C.oleifera by PCR
M.DNA Marker;1.PCR products of roots in young C.oleifera plants.
图5 油茶与茶树中TS、GS蛋白序列进化树分析比较图
Fig.5 Phylogenetic analysis on TS and GS in C.oleifera
and C.sinensis at the protein level
扩增得到的1 071bp碱基序列通过dnastar分
析,共编码356个氨基酸,分子量39 190.32Da,理
论等电点(PI)5.73,含有最丰富的氨基酸有甘氨酸
(Gly)11.2%、异亮氨酸(Ile)7.6%、丙氨酸(Ala)
7.6%、谷氨酸(Glu)6.7%,带负电荷的氨基酸数为
44,带正电荷的氨基酸数为38。根据分值中正值越
大,疏水性越高,负值越小,亲水性越高来判断蛋白
的亲/疏水性,(图6:A)中大多数的氨基酸是负值,
因而油茶TS蛋白为亲水性蛋白;按照几率>50%
就可形成螺旋的规则,以window=14、21、28为试
验参数,由(图6:B)可知油茶 TS蛋白氨基酸序列
中存在卷曲螺旋结构;根据分值大于0.5则预测为
分泌蛋白,存在信号肽;小于0.5预测为非分泌蛋
白,没有信号肽,由(图6:C)可知油茶TS蛋白是一
种非分泌蛋白,无信号肽存在;从(图6:D)可以看出
油茶 TS蛋白磷酸化位点数为20组成,丝氨酸
(Ser)磷酸化的位点有12个,苏氨酸(Thr)磷酸化
的位点有3个,酪氨酸(Tyr)磷酸化的位点有5个
且非均匀分布于整个多肽链中;跨膜结构一般由20
个疏水氨基酸残基形成α-螺旋,由(图6:E)可知,在
多肽链178~195、334~354位置有2个由内向外螺
旋结构,在178~196、339~356位置有2个由外向
内螺旋结构,但分值较低,没超过500,故油茶TS蛋
白不存在跨膜结构域,属于非跨膜蛋白,不发生跨膜
运动,在细胞内起作用;从(图6:F)看出油茶TS蛋
白在细胞质的过氧化物酶体中的可能性最大,可知
油茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。
3 讨论与结论
茶氨酸是茶树的特征性功能成分,迄今仅在蕈
和某些山茶科(属)植物中有见报道(Casimir et al.,
1960;Li et al.,2008;Tsushida et al.,1984;Deng et
al.,2010)。但油茶目前主要从事其油料方面研究,
对茶氨酸研究尚无文献报道。本研究表明,在幼年
油茶根中检测到茶氨酸,含量为0.08 mg·g-1
(FW),在幼年油茶叶和成年油茶根、叶中均未检测
到茶氨酸;或许是由于油茶中的茶氨酸含量极低,茶
氨酸可能是油茶种子萌发期间所特有的并随着生长
逐渐减少。这与山茶和茶梅中的茶氨酸是种子萌发
期间所特有并随着山茶和茶梅的生长,茶氨酸含量
减少,且在一年生山茶和茶梅新梢和根中均未检测
到茶氨酸报道较为相似(Tsushida et al.,1984),但
对其机理至今尚未明确。
目前除从茶树中克隆几条TS基因序列外(李
娟等,2011),其它关于 TS基因的克隆鲜有报道。
研究发现:在幼年油茶根中扩增一条长为1 071bp
基因片段与 GenBank中登录的 TS基因开放阅读
框(Open Reading Frame,ORF)全长(1 071bp)相
当,在 NCBI中比对发现,该基因序列与茶树GS
(AB117934)和TS(DD410896)序列的同源性达到
了98%,但与茶树另一条TS(DD410895)一致性只
有82%,氨基酸序列与茶树GS(AB117934)和TS
(DD410896)同源性高达99%,其蛋白质特征分析
结果与安吉白茶TS蛋白质特征(李娟等,2011)高
度相似。并对油茶与茶树中 TS、GS蛋白序列进
化树分析发现,油茶TS基因和茶树TS基因一样为
69 广 西 植 物 35卷
图6 油茶TS蛋白质特征分析 A.疏水性/亲水性预测;B.氨基酸序列卷曲螺旋预测;C.信号肽预测;
D.氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测;E.跨膜区预测;F.亚细胞定位预测。
Fig.6 Analysis of characteristics about TS protein of C.oleifera A.Hydrophobicity/hydrophilicity prediction;B.Winded helix
prediction of Amino acid sequence;C.Signal peptide prediction;D.Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence;
E.Prediction model for transmenbrane domain;F.Subcelular localization prediction.
GS基因家族成员,但是由于进化上的突变导致蛋
白结构的变化从而改变了其催化的活性中心,形成
新的蛋白功能。油茶与茶树的亲缘关系很近,它们
有共同的进化祖先,其氨基酸序列和保守元件结构
较为相似。所克隆的油茶TS基因与茶树TS基因
差异可能由于种间关系的存在,在进化过程中基因
突变引起的。
本研究用 HPLC法在油茶中检测到了茶氨酸,
并用LC-TOF/MS进行了质谱验证,首次在山茶科
(属)植物中克隆了一条 ORF长度为1 071bp的
TS基因序列。本研究为油茶新经济价值的发掘,
为茶氨酸在油茶中合成代谢途径的研究提供一定理
论基础。但对于茶氨酸为何仅存在于幼年的油茶根
中需要进行深层次的研究,本文从油茶中克隆出的
TS基因序列的表达和功能验证也需要继续深入。
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