全 文 :广 西 植 物 Guihaia Jan.2014,34(1):130-134 http://journal.gxzw.gxib.cn
DOI:10.3969/j.issn.1000G3142.2014.01.025
刘世彪,谭秀梅,彭小列,等.绞股蓝种子油的提取、成分分析和急性毒性实验[J].广西植物,2014,34(1):130-134
LiuSB,TanXM,PengXL,etal.Extraction,compositionanalysisandacutetoxicitytestofseedoilofGynostemmapentaphyllum[J].Guihaia,2014,
34(1):130-134
绞股蓝种子油的提取、成分分析和急性毒性实验
刘世彪1∗,谭秀梅1,彭小列1,杨 鹏1,吕江明2
(1.吉首大学 植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室,湖南 吉首416000;2.吉首大学 医学院,湖南 吉首416000)
摘 要:以石油醚为提取剂、料液比为1∶7,进行单因子和正交试验及急性毒性实验.结果表明:超声波辅助
提取绞股蓝种子油的最适工艺条件为提取的温度60℃、功率200W和时间50min,此条件下种子油提取率为
28.13%;绞股蓝种子油的密度为0.895gmLG1、折光值1.518nD20、酸值0.85和皂化值180.2mgKOHgG1、
碘值135.7gI2100gG1,为优良的干性油;绞股蓝种子油含有10种脂肪酸成分,主要为亚麻酸(80.49%)、油酸
(8.05%)、亚油酸(7.08%)、硬脂酸(1.79%)和棕榈酸(1.28%),不饱和脂肪酸质量分数达总脂肪酸的96.48%;
以剂量65mL(kgd)G1的绞股蓝种子油灌胃小鼠,在连续14d的实验期内,没有发现小鼠的中毒症状和死
亡现象.初步判定绞股蓝种子油无急性毒性,有望作为营养保健油源进一步开发.
关键词:绞股蓝;种子油;理化性质;脂肪酸组成;急性毒性实验
中图分类号:Q646.4 文献标识码:A 文章编号:1000G3142(2014)01G0130G05
Extraction,compositionanalysisandacutetoxicity
testofseedoilofGynostemmapentaphylum
LIUShiGBiao1∗,TANXiuGMei1,PENGXiaoGLie1,YANGPeng1,LÜJiangGMing2
(1.KeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandUtilizationofHunanProvince,JishouUniversity,
Jishou416000,China;2.CollegeofMedical,JishouUniversity,Jishou416000,China)
Abstract:Basedonpetroleumetherasextractionsolventandratioofmaterialtosolution1∶7,theultrasonicGassisted
extractionprocessonseedoilofGynostemmapentaphyllumwasoptimizedbysinglefactortestandorthogonaltest.
TheoptimalultrasonicGassistedconditionswereasfolows:extractiontemperature60℃,ultrasonicpower200Wand
extractiontime50min,underwhichtheextractionrateofseedoilcouldreach28.13%.Physicochemicalpropertiesof
theseed oilincluding density,dioptre,acid value,saponification valueandiodine value wererespectively
0.895gmLG1,1.518nD20,0.85,180.2mgKOHgG1and135.7gI2100gG1,whichrevealedthatG.pentaphyllum
seedoilwasafinedryingoil.GCGMSanalysisrevealedthattherewere10kindsoffattyacidsinG.pentaphyllum
seedoil,andthemassfractionwerelinolenicacid(80.49%),oleicacid(8.05%),linoleicacid(7.08%),stearicacid
(1.79%)andpalmiticacid(1.28%).Theunsaturatedfattyacidsaccountedfor96.48%oftotalfattyacids.Inthe
acutetoxicitytest,adoseof65mL(kgd)G1ofseedoilwerefiledintomice’sstomach,andnoevidentpoisoning
symptomsandanimaldeathweredetectedafter14dcontinuousobservation,whichpreliminarilyindicatedthatG.
pentaphyllumseedoilwasofnontoxicity,andexpectedtobedevelopedasaresourceofhealthoil.
Keywords:Gynostemmapentaphyllum;seedoil;physicochemicalproperty;fattyacidcomposition;acutetoxicity
收稿日期:2013G08G28 修回日期:2013G12G26
基金项目:国家自然科学基金(31260039);湖南省科技计划项目(2012NK3100);湖南省高校产业化培育项目(10CY015).
作者简介:刘世彪(1965G),男(土家族),湖南保靖人,博士,教授,从事资源植物学研究,(EGmail)liushibiao_1@163.com.
∗通讯作者
绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)为葫芦科
多年生草质藤本植物,又名小苦药、五叶参、七叶参、
七叶胆、遍地生根等,主要分布于我国秦岭以及长江
以南地区,因体内富含人参皂苷类成分而被称为
“南方人参”和“第二人参”.绞股蓝入药具有明显的
降血压、滋补保健、抗癌防衰、增强体质和改善脂质
代谢等功能(史琳等,2011),是著名的药食两用保健
植物,生产上得到了多方面的开发利用.绞股蓝为
雌雄异株植物,其雌株所产生的种子主要作为繁殖
育苗的种源,相关的研究较多(赵瑜等,2007;彭小列
等,2011;甘赞琼等,1993),但有关种子主要化学成
分研究则未见报道.绞股蓝种子成熟后含有油脂,
我们通过单因子试验和正交设计,探讨了超声波辅
助提取法提取绞股蓝种子油的最优条件,用GCGMS
技术分析了其油脂的脂肪酸成分,并用昆明小鼠测
试绞股蓝种子油的急性毒性,检验其食用安全性,以
期为绞股蓝种子的开发利用提供基本数据.
1 材料与方法
1.1材料
成熟的绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)果
实于2011年12月12日采自于湖南省吉首市河溪
乡婀娜村,晾干越冬,于2012年4月3日搓去果皮,
选取成熟饱满的种子用于实验.在60℃干燥箱中
将绞股蓝种子烘干48h至衡重,然后用粉碎机粉碎
至粒度约1.0mm,置于干燥器中.
小白鼠:健康的昆明种小白鼠购自于湖南斯莱
克景达实验动物有限公司(许可证号SCXK(湘)
2009G0004).体重(20±2)g,雌雄鼠数量各半.
1.2试剂和仪器
甲醇、95%乙醇、乙醚、正已烷、石油醚(沸程60~
90℃)、浓盐酸、NaOH、KOH、KI,使用试剂均为分
析纯.阿贝氏折射计、GCGMSGQP2010气相色谱-
质谱-电脑联用仪(日本岛津公司),配 NIST05标
准质谱、RE52G99旋转蒸发器、FAG2004电子分析天
平、LD25GZ低速自动平衡离心机、KQG250DB型数
控超声波清洗器.
1.3实验方法
1.3.1种子油的提取及理化性质测定 参照刘举等
(2013)的提取方法,在以石油醚为提取剂、料液比
1∶7的条件下,采用单因子试验探讨超声波辅助提
取法提取绞股蓝种子油的最优条件.将精密称取的
10g种子粉碎原料(m)置于150mL带塞的试剂
瓶,加入70mL石油醚浸提12h.设定超声波清洗
器的温度和功率,将试剂瓶置于清洗槽中进行油脂
的超声提取.到设定时间后,将试剂瓶中的提取液
及原料渣转入离心管,以3000rminG1的速度离心
4min,将上清液转入旋转蒸发器中进行油脂浓缩.
将蒸馏瓶中的油脂置于50℃干燥箱3h,以除去油
脂中残留的溶剂.种子油在干燥器中冷却至室温,
称重,得油脂重量m1.平行实验3次取平均值.
提取率(%)=m1/m×100%
通过单因子试验初步得到提取温度、功率和时
间3个参数的大致范围,在此基础上确定每个因素
的3个水平,设计三因素三水平正交试验L9(33),
优化绞股蓝种子油提取的工艺参数.按照中国药典
«脂肪与脂肪油检验法»测定油样的理化性质.实验
重复3次,取平均值.
1.3.2种子油的成分分析 绞股蓝种子油甲酯化的
方法参照胡开封等(2006)文献:称取油样0.2g,转
入20mL的容量管中,加1mL乙醚G正己烷(2∶1)
的溶液,再加入1mL0.5molLG1氢氧化钠G甲醇
溶液,摇匀,加水至刻度,静置30min,取上层清液
进行GCGMS测定.
GCGMS条件:色谱柱为 RTXG5MS弹性石英
毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱温为50
℃(5℃ min)→240℃(2min);载气为 He;载气流
量为2mLminG1;气化室温度为220℃;连接线温
度为230℃;进样量0.5μL;分流比为40∶1;溶剂
延迟4min;离子源温度为200℃;电离方式为EI,
电子能量70eV;质量扫描范围为30~500u.质谱
条件:电离方式为电子轰击EI,电子能量为0.9kV,
扫描范围18~50μm.采用峰面积归一化法定量,
测得油脂中各脂肪酸的相对含量.
1.3.3小鼠的急性毒性实验 参照刘世彪等(2011)
方法进行.将挑选的健康昆明种小白鼠,分为实验
组和对照组,每组20只,雌雄数量各半.在灌胃前
16h,对小鼠禁食而不禁水.实验组以最大耐受量
的油脂灌胃,首次剂量0.8mL,6h后的第二次灌胃
剂量0.5mL,折合成小鼠灌胃体积65mL(kg
d)G1或灌胃剂量58.18g(kgd)G1.对照组同时
灌以同体积的蒸馏水.灌胃后两组的雌雄鼠分笼饲
养,饲养条件一致,自由饮水,饲以公司配套的固体
饲料,保持室温25℃.连续观察并记录小鼠14d
的生长活动及死亡情况,其中每隔7d称重1次.
1311期 刘世彪等:绞股蓝种子油的提取、成分分析和急性毒性实验
2 结果与分析
2.1绞股蓝种子油的提取率和理化性质
2.1.1提取温度对绞股蓝种子油提取率的影响 在
以石油醚为提取剂、料液比1∶7的基础上,设置超
声波辅助提取的条件为超声功率200W、超声时间
40min,考察不同超声温度对种子油提取率的影响.
所提取的绞股蓝种子油呈亮黄色,有香味.随着温
度升高,种子油的提取率也增高,不过后期提取率的
增高幅度有所减少,如提取温度为30,40,50,60,70
℃时,提取率分别为24.87%、25.43%、26.54%、
26.78%、26.86%.出于对成本及效率的综合考虑,
认为50℃为最佳提取温度.
2.1.2提取功率对绞股蓝种子油提取率的影响 在
设定提取温度50℃、提取时间40min条件下,显示
了绞股蓝种子油的提取率与不同超声功率作用的关
系,即种子油的提取率随着超声功率的增加而有所
增加,但250W以后上升幅度较小.如提取功率为
150、200、250、300、350 W 时,提 取 率 分 别 为
24.87%、25.15%、25.40%、25.52%、25.60%,取250
W为最适提取功率.
2.1.3提取时间对绞股蓝种子油提取率的影响 在
设定提取温度50℃、超声功率200W 的条件下,显
示了超声提取时间对种子油提取率的影响.当提取
时间分别为30、40、50、60、70min时,提取率分别为
24.88%、25.67%、25.76%、25.83%、25.84%.这些
数据表明种子油的提取率是随着超声波的处理时间
加长而逐渐提高的,但40min后的提取率增加幅度
是递减的,且70min与60min相近.考虑到成本
等因素,确认40min为最适提取时间.
2.1.4正交试验优化 在绞股蓝种子油提取过程中,
提取温度、提取功率和提取时间是影响油脂得率的
重要因素,以该三因素为变量的正交试验设计及结
果如表1所示,其方差分析结果见表2.
正交试验结果表明,影响超声波辅助提取绞股
蓝种子油因素的大小顺序为RC>RA>RB,即提取
时间>提取温度>提取功率.表5方差分析表明,
超声提取时间和温度对提取率的影响达显著水平
(P<0.05),由此确定其优化水平为 A3和C3,而提
取功率对提取率几乎无影响,从经济角度考虑,选
B1.因此,绞股蓝种子油的最适超声提取优化组合
为A3B1C3,即提取温度60℃,提取功率200W,提
表1 绞股蓝种子油提取正交试验及结果
Table1 Orthogonalarraydesignmatrixandresultsfor
optimizingseedoilextractionfromG.pentaphyllum
编号
No.
温度 (℃)
Temperature
功率 (W)
Power
时间 (min)
Time
空列
Empty
提取率 (%)
Extractionrate
1 1(40) 1(200) 1(30) 1 20.11
2 1 2(250) 2(40) 2 24.39
3 1 3(300) 3(50) 3 24.91
4 2(50) 1 2 3 23.98
5 2 2 3 1 26.32
6 2 3 1 2 21.31
7 3(60) 1 3 2 27.80
8 3 2 1 3 23.27
9 3 3 2 1 27.50
K1 23.14 23.96 21.56 24.64
K2 23.87 24.66 25.29 24.50
K3 26.19 24.57 26.34 24.05
R 3.05 0.70 4.78 0.59
表2 正交试验结果的方差分析
Table2 Varianceanalysisoforthogonaltest
差方来源
Sourcesof
variation
离差平方和
SS
Sumof
squaresof
deviations
自由度
DF
Degreeof
Freedom
均方 MS
Mean
square
F值
Variance
ratio
显著水平
ConspicuG
ousness
A 18.11 2 9.06 31.24 显著
B 0.87 2 0.44 1.52 不显著
C 37.85 2 18.93 65.28 显著
误差Error 0.57 2 0.29
总和 Total 57.40
F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00.
表3 绞股蓝绞股蓝种子油理化常数
Table3 Physicochemicalcharacteristicsof
seedoilfromG.pentaphyllum
密度
Density
(gmLG1)
折光值
Indexof
refraction
(nD20)
酸值
Acidvalue
(mg
KOHgG1)
皂化值
Saponification
value
(mg
KOHgG1
碘值
Iodinevalue
(gI2
100gG1)
0.895 1.518 0.85 180.2 135.7
取时间50min.在此条件下验证种子油的提取率,
3次重复的平均提取率为28.13%.
2.1.5绞股蓝种子油的理化性质 表3显示,绞股蓝
种子油的相对密度较低,说明油脂相对分子质量小,
不饱和度高.种子油折光值1.518高于多数植物油
的折光率,显示其不饱和脂肪酸含量较多.0.85mg
KOHgG1的酸值低于油菜籽油和大豆油等,表明油
中游离脂肪酸含量较低,油脂质量较好.180.2mg
KOHgG1的皂化值低于一般油脂,说明游离脂肪酸
含量较低.135.7gI2100gG1的碘值相对较高,说
明种子油中含有的不饱和脂肪酸较多,品质较好,但
会影响贮存的稳定性.
231 广 西 植 物 34卷
图1 绞股蓝种子油的总离子流图
Fig.1 TotalionchromatogramoftheseedoilfromG.pentaphyllum
表4 绞股蓝种子油的脂肪酸成分
Table4 FattyacidcompositionsoftheseedoilfromG.pentaphyllum
峰号
PeakNo.
保留时间
TR(min)
化合物
Compound
分子式
MF
相似度 (%)
Similarity
相对含量 (%)
Relativecontent
5 13.380 十六酸甲酯 C17H34O2 97 1.28
6 17.171 9,12G十八碳二烯酸甲酯 C19H34O2 97 7.08
7 17.300 9G十八碳烯酸甲酯 C19H36O2 97 7.68
8 17.392 16G十八碳烯酸甲酯 C19H36O2 88 0.37
10 17.821 十八酸甲酯 C19H38O2 98 1.64
11 18.075 十八酸甲酯 C19H38O2 89 0.15
12 20.648 6,9,12G十八碳三烯酸甲酯 C19H32O2 95 75.47
13 20.732 6,9,12G十八碳三烯酸甲酯 C19H32O2 92 1.50
14 21.256 9,12,15G十八碳三烯酸甲酯 C19H32O2 89 3.52
16 21.563 二十碳烯酸甲酯 C21H40O2 92 0.72
17 22.071 二十酸甲酯 C21H42O2 92 0.30
18 22.417 二十碳四烯酸甲酯 C21H36O2 90 0.14
20 26.020 二十二酸甲酯 C23H46O2 90 0.14
表5 绞股蓝种子油的急性毒性实验
Table5 AcutetoxicitytestoftheseedoilfromG.pentaphylluminmice
组别
Group
性别
Gender
动物数
Micenumber
起始体重
Firstweight
(g)
7d体重
Weightafter7d
(g)
14d体重
Weightafter14d
(g)
死亡数
Numberofdeath
中毒反应
Poisoningresponse
实验组
Testgroup
对照组
Controlgroup
雄 10 19.8±0.5 29.6±1.4 31.8±1.5 0
雌 10 20.2±0.8 29.9±1.5 31.5±1.6 0
雄 10 19.9±0.8 29.4±1.2 31.4±1.8 0
雌 10 20.1±0.5 30.2±1.8 32.1±1.4 0
无明显中毒反应,
活动正常,内脏正常
2.2绞股蓝种子油的脂肪酸组成分析
采用GCGMS分析绞股蓝种子油甲酯化后的脂
肪酸成分,得到了图1所示的样品总离子流图.经
过NIST05的质谱数据库检索,确认绞股蓝种子油
的脂肪酸种类及相对含量如下(图1,表4).
图1显示绞股蓝种子油中共检测出20个峰,其
中峰面积较大、所代表脂肪酸成分的相对含量大于
0.1%的有13个峰.表4显示了它们分别代表10
种脂肪酸成分.各种脂肪酸的相对含量从高到低依
次为:6,9,12G十八碳三烯G酸甲酯 (αG亚 麻 酸,
76.97%),十八碳烯酸(油酸,8.05/%)、9,12G十八碳
二烯酸(亚油酸,7.08%)、9,12,15G十八碳三烯酸(αG
亚麻酸,3.52%),十八酸(硬脂酸,1.79%)、十六酸
(棕榈酸,1.28%)、二十碳烯酸(花生烯酸,0.72%)、
二十酸(花生酸,0.30%)、二十碳四烯酸(花生四烯
酸,0.14%)和二十二酸(山嵛酸,0.14%).其中饱
3311期 刘世彪等:绞股蓝种子油的提取、成分分析和急性毒性实验
和脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山嵛酸)占总脂
肪酸的质量分数为3.51%,不饱和脂肪酸(亚麻酸、
油酸、亚油酸、花生烯酸和花生四烯酸)占总脂肪酸
的质量分数为96.48%,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸
的比例为27.5∶1.
2.3绞股蓝种子油的小鼠急性毒性实验
将65mL(kgd)G1的体积剂量的绞股蓝种
子油灌胃小鼠后,14d的连续观察记录表明,各组
小鼠活动正常,体重增加较为均衡,没有明显的中毒
症状,也没有死亡的现象发生(表5).实验期满时
处死小鼠,进行大体解剖,没有发现肺、肝、胃、肠、肾
脏等主要器官产生可见的异常变化.按«保健食品
检验与评价技术规范(2003版)»的急性毒性分级标
准(黄雨三,2003),为无毒级.
3 结论与讨论
在以石油醚为溶剂、料液比为1∶7时,超声波
辅助提取绞股蓝种子油的最佳提取条件为提取温度
60℃,提取功率200W,提取时间50min.在此条
件下,绞股蓝种子油的提取率可达28.13%,这种含
油率水平是较高的.绞股蓝种子油中的饱和脂肪酸
占3.51%,其中硬脂酸的相对质量分数仅为1.79%,
而不饱和脂肪酸总量达96.48%,与饱和脂肪酸的比
例为27.5∶1,接近于30∶1.尤其是亚麻酸质量分
数达80.49%,这超过了亚麻籽油中的亚麻酸含量,
且绞股蓝种子油中的亚油酸质量分数也达7.08%,
两种总量达87.57%.亚油酸是人体必需的脂肪酸,
它和亚麻酸等多不饱和脂肪酸对人体具有多种生理
功效(王萍等,2008),极受人们的重视,如优质的茶
籽油中的亚油酸含量为8.05%,油酸81.62%,棕榈
酸和硬脂酸分别为8.49%和1.84%(吴小娟等,
2006).但茶籽油与绞股蓝种子油相比,硬脂酸含量
相当,却缺乏了亚麻酸这一重要的功能性成分.又
如油 菜 籽 油 富 于 油 酸 (69.54%)和 亚 油 酸
(15.70%),但亚麻酸的含量只有8.45%(沈明星等,
2009),远低于绞股蓝种子油中的亚麻酸,可见绞股
蓝种子油的品质是优良的.同时,绞股蓝种子油的
折光值和碘值较高,属优良的干性油.绞股蓝种子
油对小鼠的急性毒性实验表明,在剂量为65mL
(kgd)G1时,连续14d小鼠没有表现出明显的中毒
症状和死亡现象,因此初步判定其无急性毒性.综
合来看,绞股蓝种子油具有生产开发的潜力,精炼后
可以作为优质的营养保健植物食用油.
参考文献:
黄雨三.2003.保健食品检验与评价技术规范实施手册[M].北
京:清华同方电子出版社:177-188
GanZQ(甘赞琼),LiF(李锋),WeiX(韦宵),etal.1993.Studies
onpropagationofGynostemmapentaphyllum(绞股蓝繁殖试验
研究)[J].Guihaia(广西植物),13(1):84-86
HuKF(胡开峰),HouXY(侯秀云),GongYT(宫玉婷),etal.
2006.AnalysisofphysicalGchemicalpropertiesandfattyacid
compositionsofHibiscustrionumL.seedoil(野西瓜苗种子油
理化性质和脂肪酸成分分析)[J].FoodSci(食品科学),27
(11):455-456
LiuJ(刘举),ChenJF(陈继富).2013.Extractionofseedoiland
fattyacidanalysisfromfourspeciesinMagnoliaceae(木兰科四
种植物种子油的提取及脂肪酸成分分析)[J].Guihaia(广西
植物),33(2):208-213
LiuSB(刘世彪),LüJM(吕江明),LiuZX(刘祝祥),etal.2011.
Studyonextraction,compositionanalysisandacutetoxicitytest
onseedoilofSaviasplendens(一串红种子油的提取、成分分
析及其急性毒性研究)[J].JChinCerOilsAss(中国粮油学
报),26(9):6-59
PengXL(彭小列),WangSS(王莎莎),LiuSB(刘世彪),etal.
2011.Effectsoftemperatureandplantgrowthregulatoronseed
germinationofGynostemmapentaphyllum(温度和植物生长调
节剂对绞股蓝种子萌发的影响)[J].HunanAgricSci(湖南农
业科学),19:28-30
ShenMX(沈明星),WuTD(吴彤东),ChenFS(陈凤生),etal.
2009.EffectsofreturningstrawtofieldonfattyacidcomposiG
tionandkeycommercialqualityofrapeseed(稻草还田对油菜籽
脂肪酸组成和主要品质的影响)[J].ActaAgricJiangxi(江
西农业学报),21(12):17-19
ShiL(史琳),ZhaoH(赵红),ZhangLY(张璐雅),etal.2011.
AdvancesinstudiesonthepharmacologicaleffectsofGynostemG
mapentaphyllum(绞股蓝药理作用研究进展)[J].DrugEval
Res(药物评价研究),34(2):125-129
WangP(王萍),ZhangYB(张银波),JiangML(江木兰).2008.
Researchadvanceinpolyunsaturatedfattyacid(多不饱和脂肪酸
的研究进展)[J].ChinOilsFats(中国油脂),33(12):42-46
WuXJ(吴小娟),LiHB(李红冰),PangY(逄越),etal.2006.
AnalyseoffattyacidscompositionintheseedsofC.japonica
andC.oleiferaAbel(山茶和油茶种子中脂肪酸的分析)[J].
JDalianUniv(大连大学学报),27(4):56-58
ZhaoY(赵瑜),XiaoYP(肖娅萍).2007.EffectsongerminaG
tionandgrowthofseedling withdifferenttreatmentsfor
seedsofGynostemmapentaphyllum(不同处理对绞股蓝种
子萌发的影响)[J].ChinTradHerbDrugs(中草药),38
(11):1724-1725
431 广 西 植 物 34卷