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Effects of different exogenous hormones on chlorogenic acidcontent and the growth of biomass in callus of Loniceramacranthoides ‘Yulei 1‘

不同外源激素对灰毡毛忍冬“渝蕾1号”愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响



全 文 :广 西 植 物 Guihaia Oct.2015,35(5):692-696           http://journal.gxzw.gxib.cn 
DOI:10.11931/guihaia.gxzw201404027
李群,谭韵雅,梁红英,等.不同外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响[J].广西植物,2015,35(5):692-696
LiQ,TanYY,LiangHY,etal.EfectsofdifferentexogenoushormonesonchlorogenicacidcontentandthegrowthofbiomassincalusofLoniceramacG
ranthoides‘Yulei1’[J].Guihaia,2015,35(5):692-696
不同外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’
愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响
李 群1∗,谭韵雅1,梁红英2,唐 明1,马丹炜1,王亚男1
(1.四川师范大学 生命科学学院,成都610101;2.成都市林业局 龙溪—虹口国家级自然保护区,成都611830)
摘 要:为探索外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生长及其代谢产物绿原酸含量的影响,该研究通
过在培养基中添加不同种类和浓度的外源激素,以诱导其愈伤组织的产生及增殖生长,并采用称量法和高效
液相色谱法分别检测愈伤组织生物量和绿原酸含量.结果表明:不同外源激素及其组合对愈伤组织生物量和
绿原酸含量的积累产生不同的影响;培养基中添加单一外源激素时,对愈伤组织生物量影响最大的为TDZ激
素;和对照相比,不同浓度的TDZ均使生物量显著提高,其中0.5mg􀅰LG1的TDZ使生物量达最大,为0.62g;
对绿原酸积累影响的结果不太一致,除TDZ激素影响最小以外,0.5mg􀅰LG1的NAA使愈伤组织中的绿原酸
含量积累最多,为11.18mg􀅰gG1;外源激素组合中,含有TDZ激素的组合生物量偏高,但绿原酸含量偏低,这
与单一外源激素的结果一致.MS+0.5mg􀅰LG1TDZ+0.5mg􀅰LG12,4GD培养基使愈伤组织中绿原酸含量
积累较多,为15.53mg􀅰gG1,且生物量达最高,为0.65g,因此该激素组合为该研究最适培养基组合.通过筛
选适宜的外源激素及其组合能促进灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量的提高和次生代谢产物绿原酸的
积累.研究结果对从灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织中获得大量的绿原酸提供了重要依据.
关键词:灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’;愈伤组织;绿原酸;生物量
中图分类号:Q943.1  文献标识码:A  文章编号:1000G3142(2015)05G0692G05
Effectsofdifferentexogenoushormonesonchlorogenic
acidcontentandthegrowthofbiomassincalusof
Loniceramacranthoides‘Yulei1’
LIQun1∗,TANYunGYa1,LIANGHongGYing2,TANG Ming1,
MADanGWei1,WANGYaGNan1
(1.SichuanNormalUniversityofLifeSciences,Chengdu610101,China;2.ChengduForestry
BureauofLongxiGhongkouNationalnatureReserve,Chengdu610101,China)
Abstract:Influenceofexogenoushormonesonthegrowthofbiomassandthegenerationofchlorogenicacidincalus
ofLoniceramacranthoides‘Yulei1’wasinvestigatedinthisstudy.Diferentkindsandconcentrationsofexogenous
hormoneswereaddedinculturemediatoinducetheproliferationanddiferentiationofcalus.ThebiomassandaG
mountofchlorogenicacidincaluswereanalyzedbyweightandHPLC.Theresultshowedthatthebiomassofcalus
andamountofchlorogenicacidwereafectedbyvariationofhormones.TDZinalhormoneshadthestrongestinfluG
收稿日期:2014G10G16  修回日期:2015G03G24
基金项目:四川省教育厅成果培育项目(12ZZ009);四川师范大学实验技术项目(SYJS2014G12).
作者简介:李群(1971G),女,重庆秀山人,副教授,硕士生导师,主要从事植物细胞工程方面的研究,(EGmail)liqun01234@163.com.
∗通讯作者
enceonthebiomassofcaluswhensingleexogenoushormonewasadded.Itreachedthemaximumof0.62gin0.5
mg􀅰LG1TDZ.Ontheotherhand,TDZhadtheleastinfluenceonthegenerationofchlorogenicacid,whereas0.5
mg􀅰LG1ofNAAhadthehighestamount(11.18mg􀅰gG1).Inthegroupsofcombinationofhormones,theoneswith
TDZgeneratedabundantbiomassbutlowchlorgenicacid.ThegroupofMS+TDZ0.5mg􀅰LG1+2,4GD0.5mg􀅰
LG1whichhadthehighestbiomass(0.65g)andrelativelyhighchlorogenicacid(15.53mg􀅰gG1),wasthemostapproG
priateculturemedia.Therefore,thisstudyprovidesanimportantbasisonobtainingenormouschlorogenicacidfromcalG
lusofL.macranthoides‘Yulei1’throughscreeningthediferentexogenoushormonesandtheircombinations.
Keywords:Loniceramacranthoides‘Yulei1’;calus;chlorogenicacid;biomass
  金银花是我国中医临床使用的常用名贵药材,
药用历史悠久(国家药典委员会,2010;徐建伟等,
2011),中医1/3的方剂中要用到金银花.灰毡毛忍
冬‘渝蕾 1 号’(Lonicera macranthoides Hand.G
Mazz.‘Yulei1’)是2008年经重庆市林木品种审定
委员会专家审定的金银花新品种,也是重庆市审定
通过的首个药用植物新品种(黄昌银,2009).与传
统的灰毡毛忍冬相比较,该品种具有产量高、抗逆性
强、易采摘的特点,更重要的是该品种的绿原酸含量
较高(5.16%~7.37%).
绿原酸是金银花质量的主要成分指标(于生兰
等,2002;Iwanhas,1986).它具有清除自由基、抗
菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效
(Huetal.,2001;Chiangetal.,2002;Rodriguez,
2002;Franketal.,2003).近年来发现绿原酸类物
质有抗癌、抗艾滋病的作用(Linetal.,2004).作
为良好的抗氧化剂,绿原酸在医药、日用化工、食品
等领域都有广泛应用.尽管我国绿原酸产量增长很
快,但仍低于需求量的增长,供需缺口相当大.国内
高纯绿原酸市场仍然依赖于进口,尤其是下游医药
行业市场持续看好,绿原酸增长势必会持续相当长
的时间(杨大坚等,2011).传统提取金银花中绿原
酸的原材料为金银花的全植株,会消耗大量的再生
资源.要获得大量药用植物次生代谢产物,细胞培
养是一个非常有效的方法.因为植物细胞培养是在
离体条件下,将愈伤组织或其它易分散的组织置于
液体培养基中进行震荡培养,得到分散成游离的悬
浮细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量细
胞群体的一种技术.由于悬浮细胞中含有多种有用
的次生代谢产物,因此培养大量的悬浮细胞即可获
得大量有用的次生代谢产物.到目前为止,通过药
用植物细胞培养研究过的药用植物超过400种,从
培养细胞中分离到的次级代谢产物在600种以上,
其中60多种药用植物代谢物含量超过或等于原植
物的含量(王娟等,2012).
本研究以‘渝蕾1号’叶片为外植体,诱导出愈
伤组织,观察记录愈伤组织生长情况,待愈伤组织生
长稳定后继代培养3代,第三代的愈伤组织作为测
定材料.采用称重法测定愈伤组织中的生物量和高
效液相色谱法测定愈伤组织中绿原酸的含量,以期
筛选能够提高‘渝蕾1号’愈伤组织生长和绿原酸含
量的外源激素或激素组合,为利用灰毡毛忍冬‘渝蕾
1号’愈伤组织生产绿原酸奠定基础.
1 材料
本研究所用材料为重庆市秀山自治县隘口镇农
民张胜海发现的,经过多年的栽培和比较,最后经重
庆市林木品种审定委员会定名为灰毡毛忍冬‘渝蕾
1号’(Loniceramacranthoides‘Yulei1’).
2 方法
2.1‘渝蕾1号’叶片愈伤组织的诱导及继代培养
取金银花新品种‘渝蕾1号’的幼嫩叶片为外植
体.将外植体先用自来水清洗表面,然后在洗衣粉
溶液中浸泡15min,流水冲洗1h后,移至超净工作
台.再把预处理好的外植体用75%酒精浸泡30s,
无菌水冲洗2次,再用0.1%升汞溶液加2滴吐温
80灭菌1~4min,根据灭菌时间长短用无菌水冲洗
4~6次,每次停留3min.在无菌条件下切割材料
至0.5cm×0.5cm大小,分别将材料接种到不同浓
度激素的培养基上,25℃条件自然光照培养.3周
左右可见大部分材料在边缘均开始出现愈伤组织,1
个月左右将诱导出的愈伤组织进行继代培养,继代
培养基同诱导培养基.培养基中基本培养基均为
MS.外源激素的设计如下:单一外源激素中,采用
单因素设计,均考虑外源激素2,4GD、NAA、6GBA及
3965期  李群等:不同外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响
TDZ分别在0mg􀅰LG1、0.5mg􀅰LG1、1.0mg􀅰LG1
和2.0mg􀅰LG1浓度条件下对愈伤组织生物量生长
和绿原酸含量的影响(表1);在外源激素组合中,固
定6GBA的浓度为1.0mg􀅰LG1,TDZ的浓度为0.5
mg􀅰LG1,生长素2,4GD和 NAA 的浓度选择0.5
mg􀅰LG1、1.0mg􀅰LG1、2.0mg􀅰LG1三个浓度并分别
与6GBA和TDZ组合(表2),观察并测定这些培养
基条件对愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影
响.继代培养时,连续继代培养3次,继代培养时间
为25d左右,最后一次继代培养时,用千分之一的
电子天平称取1.5g左右愈伤组织进行继代,培养
完成后的愈伤组织用来测定生物量和绿原酸含量.
每种相同的培养基选择3瓶进行生物量和绿原酸含
量的测定,取平均值.整个实验重复2次.
2.2生物量的测定
称量法:收获的愈伤组织于50℃烘箱中烘干至
恒重,放入干燥器内冷却,称其干重.
2.3绿原酸含量的测定
2.3.1色谱条件 美国戴安低压双三元高效液相色
谱仪的色谱条件AltechC18色谱柱(4.6mm×150
mm);流动相甲醇∶冰乙酸溶液(28∶72)(pH
2.60);检测波长328nm;柱温35℃;流速1mL􀅰
minG1;进样量10μL.
2.3.2供试样品液的制备 渝蕾愈伤组织50℃烘干
至恒重,粉碎过60目,分别精密称取0.2g,各自加
入到有10mL60%的甲醇试管中,称其重量并记
下,在超声波清洗仪下超声30min,用60%的甲醇
补足其重量,取上清进行检测.
2.3.3对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品
(购自中国药品生物制品检定所,批号:110753G
200413)1mg,用60%的甲醇溶解,摇匀、定容在干
燥精确的10mL容量瓶中,制成浓度为100mg􀅰
LG1的溶液作为母液.在100mg􀅰LG1母液中分别取
5、4mL分别定容在10mL容量瓶,配制成50、40
mg􀅰LG1溶液,然后从40mg􀅰LG1溶液中分别取5、
1、2.5mL分别定容在10mL容量瓶,配制成20、4、
10mg􀅰LG1溶液.取上述6种浓度梯度溶液依次取
10μL注入色谱仪,测定绿原酸的峰面积,绘制其标
准曲线.以进样浓度和峰面积进行回归分析,并求
其回归方程和相关系数(r).通过回归方程计算出
待测样品中绿原酸含量.
2.4数据统计与分析
采用SPSS17.0软件进行方差分析,数据以x±s
表示,在P≤0.05下多范围Duncan检测数据显著性.
表1 不同浓度的单一外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量和绿原酸含量的影响
Table1 Effectsofdifferentconcentrationsofsingleexogenoushormonesonbiomassand
chlorogenicacidofLoniceramacranthoides‘Yulei1’calus
外源激素
Exogenous
hormone
实验项目
Experimentalproject
浓度Concentration(mg􀅰LG1)
0 0.5 1.0 2.0
2,4GD 接种量Inoculumsdensity(g􀅰bottleG1) 1.50±0.01 1.52±0.03 1.50±0.02 1.51±0.01
干重 Dryweight(g) 0.31±0.003a 0.35±0.003b 0.44±0.01d 0.38±0.003c
绿原酸Chlorogenicacid(mg􀅰gG1) 3.20±0.01a 10.23±0.07d 8.53±0.17c 7.65±0.05b
NAA 初始接种量Initialinoculumsdensity(g􀅰bottleG1) 1.50±0.02 1.51±0.02 1.51±0.02 1.49±0.01
干重Dryweight(g) 0.31±0.01a 0.36±0.02b 0.40±0.01bc 0.44±0.02c
绿原酸Chlorogenicacid(mg􀅰gG1) 3.27±0.03a 11.18±0.11d 9.47±0.11c 8.64±0.08b
6GBA 初始接种量Initialinoculumsdensity(g􀅰bottleG1) 1.50±0.02 1.50±0.01 1.50±0.01 1.53±0.02
干重Dryweight(g) 0.31±0.02a 0.37±0.02b 0.37±0.01b 0.38±0.01b
绿原酸Chlorogenicacid(mg􀅰gG1) 3.33±0.02a 7.36±0.11c 10.25±0.05d 6.35±0.12b
TDZ 初始接种量Initialinoculumsdensity(g􀅰bottleG1) 1.52±0.02 1.51±0.01 1.51±0.01 1.50±0.02
干重Dryweight(g) 0.32±0.01a 0.62±0.01c 0.59±0.01bc 0.57±0.02b
绿原酸Chlorogenicacid(mg􀅰gG1) 3.32±0.02a 6.09±0.05c 5.95±0.05c 5.15±0.06b
 注:字母相同表示无差异,字母不同表示具有显著差异(P≤0.05);字母顺序按所对比数据从小到大排列.下同.
 Note:Commonlettersarenotsignificantlydifferent,anddifferentlettersshowcontraryresults(P≤0.05).Thesamebelow.
3 结果与分析
3.1绿原酸标准曲线建立及待测样品绿原酸色谱图
在2.3.1色谱条件下,按2.3.3方法,以浓度4、
10、20、40、50、100mg􀅰LG1为进样体积,以进样体积
和峰面积进行回归分析,求得标品回归方程为y=
2.063574x+1.104074,r=0.9999278.
按2.3.2的方法提取绿原酸,在2.3.1的色谱条
件下,某一待测样品绿原酸色谱图如图1所示:色谱
496 广 西 植 物                  35卷
峰4为绿原酸.从图1看出,绿原酸分离良好.
图1 某样品绿原酸色谱峰图
Fig.1 Chlorogenicacidchromatographicpeakofsample
3.2不同浓度的单一外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1
号’愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响
从表1看出,不同浓度的外源激素对灰毡毛忍
冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量和绿原酸含量的影响
是有差异的.具体如下:添加不同浓度的2,4GD对
‘渝蕾1号’愈伤组织生物量影响较大,各浓度之间
差异显著,1.0mg􀅰LG1时生物量最大,为0.44g;同
时不同浓度间绿原酸的积累均是显著的,实验组中
的绿原酸均高于对照组,其中添加质量浓度为0.5
mg􀅰LG1的2,4GD对绿原酸积累作用最为显著,绿
原酸含量是对照组的3.20倍.添加不同浓度的
NAA对‘渝蕾1号’愈伤组织生物量的影响除0.5
mg􀅰LG1和1.0mg􀅰LG1之间差异不显著以外,其余
浓度之间差异是显著;对绿原酸的积累来说,各浓度
之间差异显著,其中添加质量浓度为0.5mg􀅰LG1的
积累作用最为显著,绿原酸含量是对照组的3.42
倍,随着激素浓度的增大,绿原酸积累逐渐减弱.添
加不同浓度的6GBA对‘渝蕾1号’愈伤组织生物量
影响除对照以外,各实验组之间差异不显著,但与对
照组相比均差异显著;对绿原酸的积累影响显著,其
中添加质量浓度为1.0mg􀅰LG1的6GBA对绿原酸
积累作用最为显著,绿原酸含量为对照组的3.08
倍.添加不同浓度的TDZ对‘渝蕾1号’愈伤组织
生物量影响较大,除0.5mg􀅰LG1和1.0mg􀅰LG1浓
度之间没有显著差异以外,其余各浓度之间差异显
著;愈伤组织生长较快较好;对绿原酸的积累影响显
著,其中添加质量浓度为0.5mg􀅰LG1的TDZ对绿
原酸积累作用最为显著,绿原酸含量是对照组的
1.83倍,但0.5mg􀅰LG1和1.0mg􀅰LG1TDZ浓度之
间绿原酸积累差异不显著.
3.3外源激素组合对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组
织生物量生长和绿原酸含量的影响
按以上单一激素实验结果设定实验方案(表
2).从表2看出,整体上对生物量生长来说,部分实
验组之间有显著差异,特别是TDZ实验组与6GBA
实验组之间差异显著,添加TDZ激素的效果明显好
于添加6GBA 激素的效果,且 MS+0.5mg􀅰LG1
TDZ+0.5mg􀅰LG12,4GD的组合使生物量达最大
值0.65g;对绿原酸积累来说,除 MS+1.0mg􀅰LG1
6GBA+1.0mg􀅰LG12,4GD和 MS+1.0mg􀅰LG16G
BA+2.0mg􀅰LG12,4GD两个实验组之外,其余各实
验组间绿原酸的积累差异均显著,但添加6GBA的
效果明显好于添加TDZ.由此看出,最有利于绿原
酸积累的最佳激素组合为MS+1.0mg􀅰LG16GBA+
0.5mg􀅰LG1NAA,绿原酸含量达17.67mg􀅰gG1,但
综合生物量和绿原酸积累量,得出最佳的激素组合
为 MS+0.5mg􀅰LG1TDZ+0.5mg􀅰LG12,4GD.
表2 外源激素组合对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’
愈伤组织生物量和绿原酸含量的影响
Table2 Effectsofdifferentcentrationsofexogenous
hormonecombinationonbiomassandchlorogenic
acidofLoniceramacranthoides‘Yulei1’calus
外源激素
Exogenous
hormone
(mg􀅰LG1)
初始接种量
Initialinoculum
density
(g􀅰bottleG1)
干重
Dryweight
(g)
绿原酸
Chlorogenic
acid
(mg􀅰gG1)
MS+6GBA1.0+
2,4GD0.5
1.50±0.01 0.39±0.01b 11.32±0.06h
MS+6GBA1.0+
2,4GD1.0
1.53±0.02 0.31±0.02a 10.23±0.05g
MS+6GBA1.0+
2,4GD2.0
1.50±0.02 0.33±0.02a 10.01±0.10g
MS+6GBA1.0+
NAA0.5
1.51±0.02 0.44±0.02c 17.67±0.06j
MS+6GBA1.0+
NAA1.0
1.53±0.02 0.32±0.20a 8.97±0.28e
MS+6GBA1.0+
NAA2.0
1.49±0.01 0.50±0.01d 9.43±0.04f
MS+TDZ0.5+
2,4GD0.5
1.50±0.02 0.65±0.01e 15.53±0.05i
MS+TDZ0.5+
2,4GD1.0
1.51±0.01 0.52±0.02d 6.31±0.03b
MS+TDZ0.5+
2,4GD2.0
1.52±0.01 0.59±0.02e 5.19±0.07a
MS+TDZ0.5+
NAA0.5
1.51±0.01 0.51±0.01d 9.59±0.29f
MS+TDZ0.5+
NAA1.0
1.53±0.01 0.57±0.02e 7.74±0.08d
MS+TDZ0.5+
NAA2.0
1.51±0.01 0.61±0.01ef 6.79±0.01c
5965期  李群等:不同外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量生长和绿原酸含量的影响
4 讨论
植物激素是植物组织培养中的关键因子,不仅
影响细胞生长,还影响细胞次生代谢产物的合成
(Meyeretal.,1995).目前在培养基中加不同种类
和浓度的激素仍是应用最广泛的提高次生代谢产物
方法.本研究选用常用的几种生长素和细胞分裂素
及其组合诱导灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物
量生长和次生代谢产物绿原酸的积累.结果表明,
不同激素间的诱导效果差异较大.本研究得到两个
明确的结果:一是添加激素以后,生物量和绿原酸的
积累都高于对照(表1),而且激素不同,绿原酸积累
量差异显著,说明灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织
的生长和次生代谢产物绿原酸的积累对激素比较敏
感.这与何文广等(2009)、唐建军等(2002)、万贵香
等(2012)的研究结果一致.另一个是添加TDZ激
素以后,灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈伤组织生物量明
显高于其它三种激素,但绿原酸的积累又明显低于
其它三种激素(图2,图3).说明TDZ能诱导愈伤
组织的快速生长,但绿原酸的积累没有同步合成和
积累.这在其它物种中使用其它激素的研究中有所
报道(Zhaoetal.,2001;张广辉等,2002).
通过添加外源激素对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’愈
伤组织生物量影响程度进行比较得出TDZ>NAA>
2,4GD>6GBA;对绿原酸含量的积累程度比较得出
NAA>2,4GD>6GBA>TDZ.前人研究表明,适当
浓度的外源激素组合明显优于单独使用一种外源激
素.因此,本研究在前期研究的基础上,设计了如表
2的实验方案,并得到了相应的结果.综合生物量
和绿原酸含量两个因素,适合灰毡毛忍冬‘渝蕾1
号’愈伤组织生物量和绿原酸积累的最佳外源激素
组合为 MS+0.5mg􀅰LG1 TDZ+0.5mg􀅰LG1
2,4GD,此时,生物量达到每瓶0.65g,绿原酸含量为
15.53mg􀅰gG1.同时,该组合中的激素浓度与单因
素实验所得的激素浓度相吻合,并且组合以后生物
量和绿原酸含量都大大提升,再次证明了激素的协
同作用.值得注意的是,在本研究中,如果仅考虑绿
原酸的积累,从表2可以看出最大的积累量为17.67
mg􀅰gG1,是在 MS+1.0mg􀅰LG16GBA+0.5mg􀅰
LG1NAA培养基条件下得到的.在本研究中,17.67
mg􀅰gG1相当于1.767%,远低于该品种报道中的含
量(5.16%~7.37%),但和其它研究结果比较(含量
仅0.51%~1.44%)(Wu,2007),认为也是正常的.
推测由两个原因造成:一是报道中的数据是花中绿
原酸的含量,而本研究分析的是叶片诱导的愈伤组
织中绿原酸的含量.据报道,叶片含量本身就远低
于花中的含量;第二个原因是在诱导愈伤组织并用
愈伤组织进行继代培养过程中并没有对愈伤组织进
行目标产物绿原酸含量方面的筛选,而是随机接种,
有可能接种的愈伤组织本身绿原酸含量较低.当然
也不排除其它因素如绿原酸提取、检测方面的误差.
如果与经济效益结合起来,在以后的研究中可以考
虑两个方面的研究内容:一是用花做外植体诱导愈
伤组织的产生,其次选择绿原酸含量高的愈伤组织
进行继代培养,再结合适当的培养条件,包括外源激
素组合、物理培养条件等等,可能会提高绿原酸的产
量,但有待下一步的研究.
参考文献:
ChiangLC,ChiangW,ChangMY,etal.2002.Antiviralactivity
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FrankJ,KamalGEldinA,RazAanA,etal.2003.Thedietary
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696 广 西 植 物                  35卷