全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):７９６－８０１　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０３０２３
赵欢,莫长明,唐其,等．罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达[J]．广西植物,２０１５,３５(６):７９６－８０１
ZhaoH,MoCM,TangQ,etal．Cloning,bioinformaticsanalysisandprokaryoticexpressionofSgHMGRinSiraitiagrosvenori[J]．Guihaia,２０１５,
３５(６):７９６－８０１
罗汉果SgHMGR 基因的克隆、分析及原核表达
赵　欢１,莫长明２,唐　其３,白隆华２,马小军１∗
(１．中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所,北京１００１９３;２．广西药用植物园,
南宁５３００２３;３．湖南农业大学 园艺园林学院,长沙４１０１２８)
摘　要:罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实
中,３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于
甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点.为了深入了解罗汉果甜苷V的
生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR 的unigene,以授粉后３d的幼果作为实
验材料,通过RACE技术获得了１９２６bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有１７４９bp
的开放阅读框,编码５８２氨基酸残基,含２段跨膜区,分别位于５０~７２aa和９３~１１５aa,亚细胞定位预测位于
质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR 基因的同
源性最高.该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL２１(DE３),经IPTG诱导
在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在２５℃诱导过夜后上清中表达最明显.该文是首次对SgHMGR
基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR 基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中
的功能及分子调控研究打下基础.
关键词:罗汉果;３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶;克隆;原核表达
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０７９６Ｇ０６
Cloning,bioinformaticsanalysisandprokaryotic
expressionofSgHMGRinSiraitiagrosvenori
ZHAOHuan１,MOChangＧMing２,TANG Qi３,BAILongＧHua２,MAXiaoＧJun１∗
(１．InstituteofMedicinalPlantDevelopmentofChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,
Beijing１００１９３,China;２．GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants,Nanning５３００２３,China;３．College
ofHorticulture&Landscape,HunanAgricultureUniversity,Changsha４１０１２８,China)
Abstract:Siraitiagrosvenori,belongingtoCucurbitaceae,isanherbaceousperennialplantnativetoSouthChina
andnorthThailand,andmostlyprevalentinGuilinCityofGuangxiZhuangAutonomousRegion．Thefruitsare
widelyusedasChinesetraditionalmedicineandmeanwhiletheycontainextremelysweetflesh．Asthemainactive
componentandsweetneringredient,mogrosideVisakindofcucurbitanetypetetracyclictriterpeneswhichonlyexＧ
istsintheripefruitsofS．grosvenori．IntheproposedmogorosideVbiosyntheticpathway,therearetwoindependＧ
entpathwaysfortriterpenoidbiosynthesis(MVApathwayandMEPpathway)．３ＧHydroxyＧ３ＧmethylglutarylcoenＧ
zymeＧAreductase(HMGR),thefirstrateＧlimitingenzymeinmevalonate(MVA)pathwayofterpenesbiosynthesis,
istheimportantregulatorysiteinmogrosideVbiosyntheticpathwayinS．grosvenori．However,thereislittle
收稿日期:２０１４Ｇ０７Ｇ１３　　修回日期:２０１４Ｇ１２Ｇ１６
基金项目:国家自然基金面上项目(８１３７３９１４);广西自然科学基金青年基金(２０１１GXNSFB０１８０８８).
作者简介:赵欢(１９８６Ｇ),女,河北行唐人,博士研究生,主要从事罗汉果分子生物学研究,(EＧmail)５３５２２７２２＠１６３．com.
∗通讯作者:马小军,研究员,主要从事药用植物分子育种研究,(EＧmail)mayixuan１０＠１６３．com.
knowledgeaboutfunctionstudyofkeygenesinvolvedinthispathway．InordertofurtherunderstandmogrosideVbiＧ
osyntheticpathway,thefulＧlengthofSgHMGR wasobtainedbyRACEＧPCRmethodfrom３dafterfertilization
(DAF)ofS．grosvenori fruitsbasedontheunigeneofHMGRintranscriptomedata,andfurtherconductedby
bioinformaticanalysis．TherecombinantprokaryoticvectorwasconstructedusingpETＧ３２aandthentransformedinto
EscherichiacoliBL２１(DE３)forexpression．TheresultsshowedthatafulＧlengthSgHMGRcDNAwasclonedwith
１９２７bpanditcontained１７４９bpopenreadingframe(ORF)encodingaproteinof５８２aminoacids(aa)(GenBank
No．HQ１２８５５６．１)．Thetheoreticalmolecularweight(MW)andisoelectricpoint(PI)ofthispredictedproteinwere
６２．６kDand８．１８,respectively．ThepredictedproteincontainedtheconserveddomainofHMGRandprovedittobe
amemberofHMGRfamily．SgHMGRproteinhadthehighhomologywithCucumissativusandCucumismeloof
Cucurbitaceaeplants,whichwereboth８８％．ItssubcelularlocalizationwaspredictedinplasmamembraneorendoＧ
plasm．ByHMGRgenestructurepredictionanalysis,thepredictedSgHMGRproteinhadtwotransmembranedoＧ
mainsinNＧterminalwhichwerelocatedin５０Ｇ７２aaand９３Ｇ１１５aa,respectively．Besides,therewerenopredictedsigＧ
nalpeptidesforSgHMGRprotein．InordertoavoidtheinfluenceoftransmembranedomainsontheheterologousexＧ
pression,SgHMGRfrom１１６aminoacidswithnotransmembranedomainswasclonedandnamedas‘SgHMGRＧ１’
inthisstudy．TheMWandPIofSgHMGRＧ１were４９．６kDand５．９５．Therecombinedvectorwastransformedinto
E．coliBL２１(DE３)andexpressedbyIPTG．ThepredictionindicatedthattheMWandPIoftherecombinedprotein
ofSgHMGRＧ１andHiswere６５．８kDand５．９５．TheresultsofSDSＧPAGEandWesternblottingdemonstratedthat
thefusionproteincouldbeexpressedinbothsupernatantandpeletafterinductionbyIPTGovernightandithad
highestexpressioninsupernatantat２５°C．ThisisthefirstreportaboutcloningoffulＧlengthSgHMGRcDNAand
itsprokaryoticexpression,andtherecombinedprokaryoticexpressionvectorofSgHMGRwasconstructedsuccessＧ
fulyandcouldbeexpressedinBL２１(DE３)ofE．coli,whichwouldlayfoundationforfurtherunderstandingofSgHＧ
MGRgenefunctionandmolecularregulationinmogrosideVbiosynthesisandprovidereferenceaboutHMGRgene
functionstudyforothernonＧmodelplants．
Keywords:Siraitiagrosvenori;HMGＧCoAReductase;cloning;prokaryoticexpression
　　罗汉果甜苷属于葫芦烷型四环三萜类物质,本
课题组根据罗汉果转录组数据,推导出甜苷可能的
生物合成途径(Tangetal．,２０１１).罗汉果甜苷生
物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和３,３Ｇ二
甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP),二者是通过甲羟戊
酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径
形成,MVA途径发生在胞质中,MEP途径发生在
质体中.这是三萜皂苷生物合成共有的途径,其中
在 MVA途径中HMGR(３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酸单酰
辅酶A还原酶)催化３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酸单酰辅酶
A(HMGＧCoA)生成甲羟戊酸(MVA),这一步反应
是需要依赖于NADP的不可逆转的过程(HaralamＧ
pidisetal．,２００２),HMGR是该途径中的关键限速
酶,可以受洛伐他汀的专一性抑制(Mrayametal．,
２０１２).异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的
严格调控,一直被认为在其生物合成途径中起着重
要的调控作用.
HMGR 基因广泛存在于细菌、真菌、动物和植
物中.目前 HMGR 基因已在多种植物中得以克
隆,如土木香(Aquilariasinensis)(Xuetal．,２０１３),人
参(Panaxginseng)(Luoetal．,２０１３),甘草(GlyＧ
cyrrhizauralensis)(Liuetal．,２０１２),拟南芥(ArＧ
abidopsisthaliana)(Enjutoetal．,１９９４),荔枝
(Litchichinensis)(Ruietal．,２０１２),甜瓜(CucuＧ
mismelo)(KatoＧEmorietal．,２００１)和黄瓜(CucuＧ
missativus)(AccessionNo．XM_００４１７０８５０).罗汉果
作为药用植物和甜料作物具有食用药用双重价值,
已对其生化、分子及遗传转化等方面开展了研究
(Chiuetal．,２０１３;Fuetal．,２０１２;Liuetal．,
２０１１;莫长明等,２０１４;韦荣昌等,２０１４;曾黎辉等,
２００５).但目前关于罗汉果甜苷生物合成途径中关
键酶的研究鲜有报道,尤其对第一个限速酶SgHＧ
MGR的克隆及功能研究尚未见有报道.本课题组
完成了对罗汉果的转录组测序,分析找到了罗汉果
甜苷生物合成过程中几乎所有的基因,从中发现了
编码HMGR 的unigene.本研究对SgHMGR 进
行了RACE全长的克隆和生物信息学分析以及原
核表达的研究,对于鉴定SgHMGR蛋白的功能,完
善罗汉果甜苷生物合成途径及利用基因工程手段调
控甜苷含量具有重要参考价值.
７９７６期　　　　　　　　　赵欢等:罗汉果SgHMGR 基因的克隆、分析及原核表达
１　材料与方法
１．１材料与试剂
以罗汉果品种‘农院B６’F０１４为材料,种植于
广西药用植物园中,于８月份取授粉后３d幼果,迅
速置于液氮中冷冻保存,随后Ｇ８０℃冰箱中存放以
备后用.Trizol试剂购自Invitrogen公司,第一链
反转录试剂盒、pMD１９ＧT载体、DH５α感受态细胞
均购自 Takara公司,RACE试剂盒与 Advantage
cDNAPCR试剂盒购自Clontech公司,质粒提取试
剂盒及胶回收试剂盒均购自 Axygen公司,Taq
PlusDNAPolymerase购自天根生化科技公司,其
他试剂如乙醇、氯仿、异戊醇等均购自北京化工厂.
１．２罗汉果RNA提取及SgHMGR的RACE全长克隆
利用Tangetal．(２０１１)的改良 Trizol法提取
罗汉果３d果实的总RNA.２００９年获得了罗汉果
高通量测序,根据SgHMGR 的unigene片段设计
５′ＧRACE 引 物 (TTACAGCAGCAGGTTTCTTＧ
GTCGGCAC)和 ３′ＧRACE 引物(GCCGATGGCＧ
TACGACGGAGGGTTGCTTG),利用RACE试剂
盒操作说明进行PCR扩增.对目的片段进行胶回
收,T载体连接转化大肠杆菌DH５α,挑选菌落PCR
阳性克隆进行测序拼接.根据拼接序列,采用
Primerpremier５．０软件设计引物,５′引物和３′引物
分别 为 ATGGACCGCCGGCGTCCT 和 CTAGＧ
GAGGAGACAGTGGT,PCR克隆出完整的开放阅
读框SgHMGRＧORF.PCR总反应体系为２５μL,
其中TaqPlusMix１２．５μL,上下游引物各１μL,模
板１μL,此外１０．５μL用ddH２O补齐.该PCR反
应程序为９４℃５min;９４℃３０s,５８℃３０s,７２℃
７０s,４０个循环;７２℃１０min.
１．３罗汉果HMGR 基因的生物信息学分析
利用ExPAEyProteomicsServer的在线软件
Protparam(http://web．expasy．org/protparam/)对
SgHMGR 基因编码的蛋白进行理化性质的预测,
通过SignalP４．１Server(http://www．cbs．dtu．dk/
services/SignalP/),PSORT (http://wolfpsort．
org/)和TMHMMServerv．２．０(http://www．cbs．
dtu．dk/services/TMHMM/)软件来预测SgHMGR
蛋白的信号肽,亚细胞定位及跨膜区的位置.利用
NCBI的 BLAST 来分析 SgHMGR 与其他物种
HMGR蛋白的同源性,PROSITE 软件(http://
prosite．expasy．org/)用来分析其保守结构域,并通
过 MEGA６软件构建NeighborＧjoining系统进化树
(Tamuraetal．,２０１３).
１．４重组质粒的构建及鉴定
TMHMM软件预测到SgHMGR蛋白的 N端
１１５个氨基酸内有２端跨膜区,因此在构建原核重
组质粒前,回避前面１１５个氨基酸.从１１６个氨基
酸开始设计含有酶切位点(BgIII/XhoI)F引物
(AGATCTCAGTCTTTCATAGCGCGT)和R引
物(CTCGAGCTAGGAGGAGACAGTGGT),PCR
反应体系同全长克隆PCR,得到目的片段用１．０％
琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收.回收PCR产
物,连接pMD１９ＧT载体,转化大肠杆菌DH５α感受
态细胞,Amp筛选阳性克隆,经上海生工生物技术
有限公司测序验证.用BgIII和XhoI双酶切重组
质粒和原核表达载体pETＧ３０a(＋),分别回收目的
片段和表达载体,经 T４DNA连接酶连接,反应体
系:原核表达载体pETＧ３２a载体１μL,目的片段１
μL,３μL的ddH２O补齐至５μL.在１６℃连接反
应过夜.连接产物全部转化到大肠杆菌 LB２１
(DE３)中,利用载体上游引物(T７promoter)和目的
基因的下游引物(R引物)通过菌落PCR鉴定,将阳
性克隆测序验证.
１．５目的蛋白表达
挑取单菌落于５mL含有kan(２０μg􀅰mLＧ１)的
LB培养基中,３７℃培养过夜,按１％接种量转接至
５瓶２０ mL 的 LB 培养基中,３７ ℃振荡培养至
OD６００＝０．６,其中２瓶加入IPTG 终浓度为０．１
mmol􀅰LＧ１,２瓶加入２０％乳糖至终浓度为１％,剩
余１瓶不加任何诱导剂作为阴性对照.加入相同诱
导剂的２瓶菌液分别置于３７℃和２０℃培养箱中振
荡培养诱导蛋白表达;阴性对照瓶于３７℃中继续培
养４h.３７℃的菌液培养４h,２０℃的菌液培养１６
h后,分别吸取１０mL菌液离心收集菌体,加入２
mL破壁缓冲液(２０mmol􀅰LＧ１ TrisＧHCl,pH８．０,
３００mmol􀅰LＧ１ NaCl,１ mmol􀅰LＧ１ DTT,０．１
mmol􀅰LＧ１EDTA)超声破碎菌体.１２０００r􀅰minＧ１
离心１０min,上清液作为细胞破碎液的上清蛋白,
沉淀加１mL灭菌水作为沉淀蛋白.分别取１０μL
上述蛋白液,加SDSＧPAGE上样缓冲液,１００℃煮５
min进行电泳.浓缩胶和分离胶的浓度分别为５％
和１２％,恒压８０V进行浓缩胶电泳,待指示剂进入
分离胶之后调至恒压１２０V,电泳完毕经考马斯亮蓝
８９７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
检测.
１．６蛋白纯化和 Westernblotting检测
将SDSＧPAGE胶内蛋白转移到 NC膜上,用
TBST漂洗２次加入封闭液,室温封闭１h.倒掉封
闭液加入一抗鼠抗ＧHis单抗,４℃孵育过夜.洗净
一抗后加入二抗HRP标记的羊抗鼠IgG,室温孵育
１h.加入ECL工作液,反应５min,放入暗盒进行
X光压片,再进行显影.
２　结果与分析
２．１罗汉果SgHMGR 基因的RACE克隆
通过RACE手段,克隆获得了SgHMGR 基因
的５′ＧRACE和３′ＧRACE的片段,经胶回收后测序
验证分别为１２７６bp和１０８１bp(图１).测序拼接
后得到SgHMGR 的全长为１９２６bp包含８１bp的
５′ＧUTR和９６bp的３′ＧUTR,预测 ORF为８２~
１８３０bp共计１７４９bp,编码的蛋白质包含５８２aa.
该基因已登录GenBank,登录号为HQ１２８５５６．１.
图１　罗汉果SgHMGR 基因５′ＧRACE,
３′ＧRACE和ORF扩增片段
Fig．１　５′ＧRACE,３′ＧRACEandORFamplification
ofHMGRgeneinS．grosvenori
２．２SgHMGR蛋白的生物信息学分析
SgHMGR编码的蛋白质分子式为 C２７５４H４４１９
N７６９O８３２S３０,理论分子量为６２．６kD,等电点为８．１８,
带正电残基(Arg和Lys)为５７,带负电残基(Asp和
Glu)为５４,不稳定系数为３７．１５,归为稳定类别,脂
肪系数为９２．０３,亲水性系数为０．０５９.ProSite软件
分析该蛋白属于 HMGR家族成员,有一段保守结
构域位于１６８~５７２aa(图２).
SignalP４．１Server软件预测SgHMGR蛋白不
具有信号肽,PSORT软件预测该蛋白的亚细胞定
位:质膜的定位系数为５．０,内质网的定位系数为
５．０,叶绿体的定位系数为３．０,因此该蛋白很可能位
于质膜或者叶绿体中.TMHMMServerv．２．０软
件预测该蛋白有２段跨膜区,分别位于５０~７２aa
和９３~１１５aa.将SgHMGR的蛋白序列提交到
NCBI数据库经BLAST进行相似性比对,结果显示
SgHMGR与葫芦科的黄瓜(XP００４１４６７６２．１)和甜
瓜(BAA３６２９１．１)相似性均最高达８８％,与荔枝
(ABF５６５１８．２)和 烟 草 (Nicotiana attenuate)
(AAL５４８７８．１,AAO８５５５４．１)的同源性分别达８３％
和７３％.我们从NCBI的Nr数据库中选取了６个
物种的６条 HMGR序列绘制系统进化树,包括黄
瓜的 HMGR(XM ００４１７０８５０．１),甜瓜的 HMGR
(GU１７６３２０．１),拟南芥的 HMGR(NM１０６２９９．３),
烟 草 的 HMGR (U６０４５２．１),荔 枝 的 HMGR
(JN０３４５８９．１)和 蓖 麻 (Ricinuscommunia)的
HMGR(XM ００２５１０６８６．１),进化树如图３所示,
SgHMGR与葫芦科黄瓜和甜瓜同源性最近,与蓖
麻同源性较远.
２．３　原核表达载体重组质粒的构建及鉴定
经预测,SgHMGR蛋白 N端１１５aa内存在２
段跨膜区极可能影响原核表达,因此从１１６个氨基
酸开始设计含有酶切位点的引物来扩增ORF,我们
将去掉N端１１５aa的ORF片段命名为SgHMGRＧ
１,PCR 产物经１％的琼脂糖凝胶电泳分析,在
１４０４bp左右出现特异性条带,大小与预期相符,测
序正确.扩增产物与pETＧ３２a载体连接转化到
BL２１(DE３)感受态细胞中,用载体的上游引物和目
的片段的下游引物进行PCR扩增,电泳结果得到单
一的１４０４bp左右条带,阳性质粒送往睿博公司测
序,结果表明重组表达质粒构建成功.Protparam
在线软件预测SgHMGRＧ１的理论分子量为４９．５
kD,等电点为５．９６.构建到原核表达载体中含有
Trx和His标签的融合蛋白理论分子量为６５．８kD,
等电点为５．９５.
２．４重组质粒的诱导表达产物SDSＧPAGE分析
０．１mmol􀅰LＧ１的IPTG诱导含有重组质粒的
菌液,分别在１６、２５、３０和３７℃下诱导过夜,菌液离
心分别将上清和沉淀进行SDSＧPAGE电泳检测,以
未诱导的菌液上清和沉淀做对照,结果除了１６℃诱
导温度下无特异条带外,在其余３组温度诱导的上
清和沉淀中,在４５．０~６６．２kD之间均有明显的特
异条带,与融合蛋白SgHMGRＧ１预测大小６５．８kD
９９７６期　　　　　　　　　赵欢等:罗汉果SgHMGR 基因的克隆、分析及原核表达
图２　ProtSite软件预测SgHMGR保守结构域
Fig．２　ConserveddomainsofSgHMGRproteinpredictedbyProtsite
图３　SgHMGR系统进化树分析
Fig．３　PhylogeneticanalysisofSgHMGR
一致,随着诱导温度升高,上清中的特异条带越来越
少而沉淀中的越来越多.这表明重组质粒的上清和
沉淀中均存在SgHMGR酶(图４).
２．５Westernblotting鉴定
以未诱导的菌液作对照,显影结果表明对照没
有任何条带,诱导处理的上清和沉淀均出现特异条
带(图５).
３　讨论
HMGR最初是在动物中发现,长期以来被认为
是胆固醇合成中的限速酶,随着研究范围的扩大及
深入,发现 HMGR同样在植物萜类和甾醇合成途
径中起着至关重要的调节作用,催化 MVA途径中
一步重要的限速反应.本文是首次在罗汉果中克隆
到１条SgHMGR 全长基因,然而目前罗汉果的遗
传转化体系尚不完善,因此通过体外实验(如原核表
达系统)来鉴定其功能是可行的.对SgHMGR 原
核表达及纯化是探索其功能及甜苷生物合成途径的
图４　重组质粒不同温度下诱导表达的SDSＧPAGE
分析　M．生工蛋白标记;１．未诱导(上清);２．未诱导(沉
淀);３．１６℃诱导过夜(上清);４．１６℃诱导过夜(沉淀);５．２５
℃诱导过夜(上清);６．２５℃诱导过夜(沉淀);７．３０℃诱导过
夜(上清);８．３０℃诱导过夜(沉淀);９．３７℃诱导过夜(上清);
１０．３７℃诱导过夜(沉淀).
Fig．４　SDSＧPAGEanalysisofrecombinantplasmidafter
inducedexpressionatdiferenttemperatures　M．Sangon
proteinmarker;１．NoIPTG(Supernatant);２．NoIPTG(PrecipiＧ
tate);３．１６℃overnight(Supernatant);４．１６℃ (Precipitate);５．
２５℃ (Supernatant);６．２５ ℃ (Precipitate);７．３０ ℃ (SupernaＧ
tant);８．３０℃ (Precipitate);９．３７℃ (Supernatant);１０．３７℃
(Precipitate)．
前提和基础,将来可以借助转基因手段导入罗汉果
中提高甜苷合成.研究人员试图通过过量表达
HMGR 基因来提高三萜类物质的含量,已经在多种
植物中取得很大进展(Harkeretal．,２００３;Kimet
al．,２０１３;Aquiletal．,２００９).通过生物信息学分
析,我们预测到SgHMGR 基因与葫芦科其他植物
HMGR 基因同源性较高,在其ORF的N端存在２
段跨膜区,很大程度上将影响该蛋白在原核系统中
的表达,我们采取了回避N端跨膜区的方法克隆到
００８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图５　目的蛋白的Westernblotting　１．在２５℃经IPTG
诱导的上清;２．在２５℃经IPTG诱导的沉淀;３．未经诱导的上
清;４．未经诱导的沉淀.
Fig．５　DetectionoftargetproteinbyWesternblotting　
１．SupernatantinducedbyIPTGat２５℃;２．Precipitateinducedby
IPTGat２５℃;３．SupernatantwithnoIPTG;４．Precipitatewithno
IPTG．
SgHMGRＧ１片段,成功诱导了其在E．coli 菌株
BL２１(DE３)中的表达,并在上清和沉淀中均检测到
融合蛋白的存在.IPTG在不同温度下的诱导,发
现SgHMGRＧ１融合蛋白在２５℃中的表达最好,此
时上清中该蛋白的表达最高.本研究,在罗汉果中
我们首次详细报道了 MVA途径中SgHMGR 的全
长克隆、生物信息学分析及原核表达,明确了该基因
序列,初步确定了该基因编码３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酸
单酰辅酶A还原酶.目前的研究结果将有助于我
们阐述罗汉果甜苷生物合成机制,从某种程度上对
于植物分类进化提供参考依据.
目前HMGR 基因在药用植物的研究多集中在
丹参、甘草和阳春砂等物种上(刘雨佳等,２０１３),
HMGR 通常是由多基因家族的形式存在,而且不同
植物同源基因的数目不同.这些基因在不同部位或
不同生长发育期的表达模式不同,这种差异性表达
决定了“碳流”的流向.我们将继续从转录组数据中
发掘是否存在HMGR 的同家族基因,拟开展SgHＧ
MGR 基因的表达模式研究及真核表达,进一步探
讨罗汉果甜苷合成途径,为通过基因工程手段有效
促进三萜类生物合成进而提高甜苷含量奠定基础.
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１０８６期　　　　　　　　　赵欢等:罗汉果SgHMGR 基因的克隆、分析及原核表达