全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Mar． 2013，33(2) :203 － 207 http:/ / journal． gxzw． gxib． cn
DOI:10． 3969 / j． issn． 1000-3142． 2013． 02． 013
魏振园，汤若风，王晋飞，等． pH对槐角愈伤组织黄酮类化合物产量的影响［J］． 广西植物，2013，33(2) :203 －207
Wei ZY，Tang RF，Wang JF，et al． Effects of pH value on yield of flavonoids in callus tissues of Sophora japonica fruits［J］． Guihaia，2013，33(2):203 －207
pH对槐角愈伤组织黄酮类化合物产量的影响
魏振园，汤若风，王晋飞，董倩倩，范亚丽，刘忠华*
(北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083 )
摘 要:培养基酸碱度是影响植物生长和次生代谢的重要因素之一。将生长稳定的国槐槐角愈伤组织在不同
pH值的 B5悬浮培养基中培养，比较其生长状况、生物量及苯丙氨酸转氨酶活性和黄酮类化合物的产量。结果
表明:pH为 6． 6时，国槐细胞生长状况好，且不同 pH下的苯丙氨酸转氨酶活性差异显著;培养基呈弱酸性(即
6． 6 ±0． 05)时，细胞黄酮类化合物含量较高。综合生长天数和产量，最佳的收获时期为继代后的第 25 ～30天。
关键词:槐角愈伤;pH值;PAL活性;黄酮类化合物
中图分类号:Q946． 83 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2013)02-0203-05
*
Effects of pH value on yield of flavonoids in
callus tissues of Sophora japonica fruits
WEI Zhen-Yuan，TANG Ruo-Feng，WANG Jin-Fei，
DONG Qian-Qian，FAN Ya-Li，LIU Zhong-Hua*
(College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China )
Abstract:The pH value of the medium is one of the important factors that affects plant growth and secondary metabo-
lism． The stable growth callus tissues of Sophora japonica fruits were respectively cultured in B5 liquid medium with dif-
ferent pH values． The growth state and production，phenylalanine ammonialyase(PAL)activity and total yields of fla-
vonoids were compared． The results showed 6． 6 was suitable for the growth of callus tissues． PAL activity could be sig-
nificantly affected by the pH value． Weak acid(6． 6 ±0． 05)medium was better for the most flavone compounds accumu-
lation;in consideration of growth days and total yields，the best harvest period should be chosen at the 25th － 30th day
after subcultured．
Key words:callus tissues of fructus sophorae;pH value;PAL activity;flavonoids
槐角为豆科植物国槐(Sophora japonica)的果
实，荚果，念珠状。其性寒、味苦，有清热泻火、凉血
止血﹑清肝明目的功效，始载于《神农本草经》，是
常用中药材品种。黄酮类化合物是槐角中的主要活
性成分之一(王景华等，2002) ，药理作用主要表现
为抗生育﹑抗癌、降低血压和转氨酶等，为《中华人
民共和国药典》历版所收载的品种。国槐原产我
国，多用作行道或庭院树种，槐角中含有较高的黄酮
类物质，但其受污染及病虫害影响较大，药用资源开
发利用率低，难以满足需求，因此采用槐角愈伤组织
大规模培养技术生产黄酮类化合物是解决药用植物
资源有限及满足需要的最佳途径。早期周立刚等
(1991)进行了人参细胞培养合成皂苷的研究，研究
显示当 pH 稳定在 5． 8 ± 0． 2 时有利于人参细胞的
生长和皂苷产生，皂苷合成高峰出现在细胞生长对
数期稍后，结果表明细胞生长和皂苷累积需要一个
* 收稿日期:2012-11-24 修回日期:2013-01-26
基金项目:国家自然科学基金(子项目编号:ZD008)
作者简介:魏振园(1986-) ，女，甘肃靖远县人，在读硕士研究生，研究方向为药用植物及其次生代谢，(E-mail)janrywei@ 163． com。
* 通讯作者:刘忠华，博士，副教授，研究方向为植物生长发育及系统进化，(E-mail)liuzh6@ bjfu． edu． cn。
稳定而适宜的 pH 值环境。培养基的 pH 影响细胞
次生代谢产物的积累和释放，降低培养基 pH 能有
效诱导高山红景天细胞释放红景天苷。怀槐子叶或
下胚轴产生的无菌苗在 B5 + 2，4-D 2． 0 mg /L + 6-
BA0． 5 mg /L的培养基上可诱导出愈伤组织且经过
筛选建立了稳定的细胞培养体系，表明怀槐愈伤组
织具有合成异黄酮的能力(罗建平等，2003)。培养
基的酸碱度对植物的生长及次生代谢有一定的影响
(李品等，2007)。本文以培养基 pH 为变化因子，比
较了不同 pH 培养下国槐愈伤组织生长的鲜重干
重，苯丙氨酸转氨酶(phenylalanine ammonialyase，
PAL)的活性以及总黄酮的产量，为更好建立国槐愈
伤组织高效生产黄酮类化合物的研究打下基础。
1 材料和方法
1． 1 材料
实验材料于 2010 年 9 月 20 日采自北京圆明园
外行道两旁的国槐树上。挑选无病虫害、生长饱满
的国槐槐角，以其胚诱导出愈伤组织。该愈伤组织
在含蔗糖 2%，琼脂 0． 6%的 B5 + 1． 0 mg /L 2，4-D +
0． 2 mg /L 6-BA 固体培养基中继代培养，待生长稳
定后接入含蔗糖 3%的 B5 + 2． 0 mg /L 2，4-D + 0． 5
mg /L 6-BA + 0． 05 mg /L NAA 悬浮培养基中，建立
槐角愈伤组织细胞悬浮培养体系。该悬浮体系每隔
30 d继代 1 次，光照强度 2 000 lx，光照 12 h，温度为
(25 ± 1)℃，转速 125 r /min。
实验仪器有 UV-2102 型紫外分光光度计(尤尼
柯上海仪器有限公司)、梅特勒-托利多电子分析天
平(上海精密科学仪器有限公司)、电热恒温水浴锅
(北京市永光明医疗仪器厂)、高速离心机(sigma 公
司)、数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗
设备厂)。槐角苷标准品纯度 ＞ 98%(上海同田生
物技术有限公司提供) ，其它试剂均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 供试材料的制备 选用上述悬浮培养基，以
0． 1 mol /L NaOH和 1 mol /L HCl调节 pH值分别为
5． 6、6． 1、6． 6、7． 1、7． 6;取生长 25 d 后活性较高的
愈伤继代在不同 pH 液体培养基中，上述相同条件
下培养，每隔 5 d测定 1 次鲜重干重、PAL 活性及槐
角苷含量，共 35 d结束，每个样品 3 个重复。
1． 2． 2 生长量的测定 供试材料收获:去离子水冲
洗 2 次、以滤纸吸干测鲜重 FW (g) ;70 ℃烘干 10 h
至恒重后测干重 DW (g)。
1． 2． 3 PAL活性的测定 称取 0． 3 g 新鲜材料液氮
固定后置于-80 ℃冰箱保存备用。测定时将材料放
入预冷研钵中，迅速加入 4 mL 0． 2 mol /L 预冷的硼
酸缓冲液(pH8． 8，含 0． 02 g /mL水溶性聚乙烯吡咯
烷酮，0． 35 μL /mL 巯基乙醇) ，冰浴研磨至匀浆，8
000 r /min 4 ℃离心 20 min 得上清，即为酶粗提取
液。测定 PAL活性参照申宏波等(2005)的方法并
加以改进，即 5 mL反应介质(0． 02 mol /L 苯丙氨酸
2 mL，2 mL ddH2O，1 mL 酶液;对照不加底物，加 1
mL ddH2O) ，测定初始吸光值，之后 40 ℃恒温水浴
60 min，加 1 mol /L HCl终止反应，测定 OD290nm值，每
个样品重复测定 3 次，PAL 活性表示为 OD290nm /g·
fr·w·min·cm。即 PAL活性(OD290nm /g·fr·w·
min· cm)= OD290nm· N /W· T· n· d。其中，
OD290nm为反应后和反应前的吸光度差值，N 为酶提
取液总体积(mL) ，W 为样品鲜重(g) ，T 为反应时
间(min) ，n为反应体系中所用酶液体积(mL) ，d 为
比色皿直径(cm)。
1． 2． 4 黄酮类化合物含量的测定 异黄酮含量的测
定采用紫外分光光度法(溥丽华等，2012) ，选用槐
角苷为标准品。称取烘干后的粉末 0． 1 g，加入 7
mL 60%的乙醇，75 ℃水浴提取 9 h 后离心，取上清
稀释 30 倍后测 OD261． 5nm值，每个样品 3 次重复。异
黄酮的含量以槐角苷计:
槐角苷含量(mg /g)= 30 CV /1000W
式中，C 为稀释后的提取液中槐角苷的浓度
(μg /mL) ，V为提取槐角苷溶液的体积(mL) ，W 为
精确称取的供试材料的质量(g)。
2 结果与分析
利用 SPSS11． 5和 Excel 软件处理数据，第 5 天、
第 10天、第 15 天、第 20 天、第 25 天、第 30 天、第 35
天收获测定分别表示为 T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7。
2． 1 培养基 pH值对国槐细胞生长及生物量的影响
接入新鲜培养基后细胞进入新一轮的增殖阶
段，不同 pH下的干重生长曲线如图 1。从图 1 可以
看出，不同 pH 下的生长量积累随着生长时期的增
加差异越来越明显，T5、T6 时期 pH 为 6． 6，细胞干
重积累高于其它 pH值。
如图 1 所示，适应期代谢较慢，初生生长和次生
代谢都保持平稳，T1 ～ T2 时期细胞生长缓慢，颜色
402 广 西 植 物 33 卷
图 1 不同 pH下的细胞干重
Fig． 1 Dry weight under different pH values
浅褐色，培养基少见浑浊;T2 ～ T3 时期除 pH6． 1 时
细胞生长较慢，其它均迅速生长、材料表面附着淡黄
色新生愈伤;T3 ～ T4 时期各 pH 下的细胞生长无明
显差异，颜色继续加深;T4 ～ T5 时期整体生长变缓，
瓶壁有大量附着，培养基浑浊，材料褐色加深，pH6．
6 下的干重积累最大;T5 ～ T7 时期培养基渐呈糊
状，球状愈伤为深褐色，小颗粒状愈伤接近黑褐色，
pH为 5． 6 和 6． 6 下的鲜重干重下降幅度较低;T7
时期后营养物质消耗殆尽，细胞开始死亡。
2． 2 培养基 pH值对国槐细胞 PAL活性的影响
测定不同 pH 下的 PAL 活性结果见表 1，5 种
pH间酶活性差异显著。
表 1 pH对 PAL活性的影响
Table 1 Effect of pH value on PAL activity
不同时期
Different periods T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
不同 pH处理 5． 6 45． 63 ± 0． 08c 42． 41 ± 0． 26d 11． 16 ± 0． 05c 35． 73 ± 0． 18b 58． 71 ± 0． 29c 37． 59 ± 0． 50c 21． 68 ± 0． 22c
pH value 6． 1 46． 67 ± 0． 38b 44． 92 ± 0． 81b 13． 79 ± 0． 11a 37． 54 ± 0． 25a 59． 38 ± 0． 11b 54． 44 ± 0． 09b 31． 84 ± 0． 13b
6． 6 47． 41 ± 0． 36a 46． 67 ± 0． 36a 12． 27 ± 0． 16b 37． 37 ± 0． 11a 62． 75 ± 0． 06a 56． 41 ± 0． 28a 45． 06 ± 0． 06a
7． 1 44． 17 ± 0． 28d 42． 41 ± 0． 26c 12． 31 ± 0． 07b 23． 35 ± 0． 11c 28． 28 ± 0． 28d 25． 25 ± 0． 12d 17． 75 ± 0． 10d
7． 6 42． 47 ± 0． 30e 41． 46 ± 0． 29e 9． 48 ± 0． 17d 12． 17 ± 0． 18d 15． 43 ± 0． 45e 13． 58 ± 0． 29e 12． 43 ± 0． 06e
平均 Average 45． 27 ± 1． 85 43． 76 ± 1． 93 11． 80 ± 1． 48 29． 23 ± 10． 38 44． 91 ± 19． 99 37． 45 ± 17． 11 25． 75 ± 11． 96
注:表中数据后的不同字母表示在 0． 05 水平差异显著。
Note:Values in each column followed by different letters mean significant difference at P ＜ 0． 05．
PAL活性总体变化趋势为 0 ～ 5 d 内 PAL 活性
较初始值稍有下降，T1 时继续保持平稳，T2 时 PAL
活性急剧下降，T3 ～ T4 时细胞已吸收大量养分，随
着次生代谢的加强，PAL 活性开始上升，T4 ～ T5 时
酶活性继续上升、趋势相比前一时期变缓;T1、T2、
T5 ～ T7 时期表现为 pH6． 6 时最大，第 25 天 时，
pH6． 6 下的酶活性达到整个过程中酶活性的最大
值;T5 ～ T6 和 T6 ～ T7 间测 PAL 活性亦呈现下降状
态，表明这两个时期次生代谢十分缓慢。
2． 3 培养基 pH值对国槐细胞黄酮类化合物含量的
影响
收获不同时期材料，提取槐角苷并测定其含量，
不同 pH值下的槐角苷变化趋势如图 2 所示。首先
快速上升，之后再下降，出现低峰后再次上升，整个
周期呈现两次高峰。
从图 2 可以看出，T1 时不同 pH 下的槐角苷含
量差异:pH为 7． 1 和 7． 6 时的槐角苷含量较 5． 6、6．
1、6． 6 的多。T2 时 5 种 pH下的差异不明显。T3 和
T4 时期表现为 pH6． 1 时的含量较高。随着生长天
数的增加，细胞生长状态日趋稳定，表现为 T5、T6
图 2 不同 pH下的槐角苷含量
Fig． 2 Contents of total sophoricoside
under different pH values
和 T7 时 pH 值为 5． 6 和 6． 6 下槐角苷含量明显高
于其它。
2． 4 培养基 pH对国槐细胞培养中黄酮类化合物产
量的影响
不同 pH条件下槐角愈伤组织悬浮培养体系中
材料的生长状况有所不同，在实际的生产过程中，应
权衡生长量和黄酮类化合物含量选择适当 pH 及收
5022 期 魏振园等:pH对槐角愈伤组织黄酮类化合物产量的影响
获时期。本实验从代谢水平深入研究槐角细胞生产
黄酮类化合物所需的最佳 pH，选取 pH 为 6． 6 时的
槐角苷含量和 PAL活性加以比较(图 3)。
图 3 pH6． 6时的槐角苷含量及 PAL活性
Fig． 3 Contents of sophoricoside and
PAL activity under pH6． 6
结果显示愈伤组织在接种后第 5 天 PAL 活性
迅速上升，出现第一个高峰，而槐角苷合成则相对滞
后;5 ～ 15 d 槐角苷含量和 PAL活性都为下降状态，
此时细胞适应了环境并积累干重;第 15 天二者均降
至最低，槐角 2 含量变化相比 PAL 酶活变化平缓;
第 15 ～ 25 天二者开始上升，至第 25 天 PAL 活性出
现第二个高峰并且为最高峰，槐角苷积累第 30 天达
到稳定。另外，槐角苷含量和 PAL 活性变化趋势基
本一致:从第 10 天起愈伤适应了新环境快速积累重
量，PAL 活性急剧下降、槐角苷积累也下降;随着生
长稳定期的到来，PAL 活性和槐角苷含量均表现为
上升状态;第 30 天以后营养物质消耗殆尽，生长过
程基本结束，PAL活性槐角苷产量都开始下降，细胞
褐化、衰老死亡。
黄酮类化合物的产量是选择最佳 pH 值和收获
时间的良好参考，其值为愈伤组织干重和槐角苷含
量(%)的乘积，不同 pH下的产量见表 2。从表 2 看
出，pH6． 1 时，第 35 天收获可得最大黄酮类化合物
产量为 0． 969 g，这同 pH6． 6 时，第 25 天收获产量
0． 655 g和第 30 天收获产量 0． 922 g差异不显著。
表 2 不同 pH下黄酮类化合物的产量
Table 2 Yields of total flavonoids under different pH
pH值
pH
value
槐角苷产量 Yields of total sophoricoside (g)
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
6． 1 0． 073 ± 0． 004a 0． 127 ± 0． 016ab 0． 235 ± 0． 032a 0． 41 ± 0． 027a 0． 556 ± 0． 062ab 0． 868 ± 0． 042a 0． 969 ± 0． 049a
6． 5 0． 075 ± 0． 017a 0． 088 ± 0． 022b 0． 118 ± 0． 004c 0． 286 ± 0． 067b 0． 587 ± 0． 040ab 0． 773 ± 0． 092a 0． 545 ± 0． 013c
6． 6 0． 074 ± 0． 014a 0． 095 ± 0． 015ab 0． 155 ± 0． 029bc 0． 322 ± 0． 012b 0． 655 ± 0． 191a 0． 922 ± 0． 123a 0． 875 ± 0． 077ab
7． 1 0． 095 ± 0． 030a 0． 119 ± 0． 026ab 0． 192 ± 0． 05ab 0． 296 ± 0． 045b 0． 408 ± 0． 142b 0． 549 ± 0． 146b 0． 793 ± 0． 063b
7． 6 0． 078 ± 0． 011a 0． 130 ± 0． 019a 0． 219 ± 0． 041ab 0． 3345 ± 0． 01b 0． 435 ± 0． 049ab 0． 448 ± 0． 018b 0． 637 ± 0． 125c
注:表中数据后的不同字母表示在 0． 05 水平差异显著。
Note:Values in each column followed by different letters mean significant difference at P ＜ 0． 05．
3 结论和讨论
利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物受多
种因素的影响，包括培养基的种类、酸碱度、组分及
营养物质的含量、光照、温度、外植体自身特性、添加
外源刺激物(Udomsuk et al．，2011)等。培养基的不
同酸碱度影响细胞对养分(例如铁离子)的吸收利
用，很大程度上影响细胞的次生代谢。
本实验探究了 5 种 pH 下悬浮细胞的生长量及
生长状态，结果表明，从细胞生长的对数期开始，不
同 pH下细胞重量积累开始有差异，但并不显著;最
利于细胞增殖的 pH随着细胞生长进程的变化而不
同;至稳定期，弱酸性环境更利于生长。盛长忠等
(2001)研究了南方红豆杉愈伤组织在 5 种 pH
(5. 0、5． 5、6． 0、6． 5、7． 0)下的 PAL 活性和紫杉醇含
量的实验表明，随着 pH值的增大，细胞的 PAL活性
变大、紫杉醇含量积累增多;pH 为 5． 5 时对生长最
为有利，而紫杉醇的含量较低;pH 为 7． 0 时生长量
有所下降，但紫杉醇含量却达到 pH5． 5 时的两倍
多。毛玉东等(2011)研究了土壤不同 pH下的滇重
楼生长状况、各器官营养元素含量和根茎总皂苷含
量，结果表明随 pH增加，根茎生长状况呈先增后降
的趋势;新老根茎的总皂苷含量随土壤 pH 升高而
增加;本研究中不同 pH 下的 PAL 活性差异显著但
没有呈现随 pH变大而变大的规律，不同 pH能显著
影响细胞的 PAL活性，可能与细胞受到外界刺激后
迅速做出应激反应，加强次生代谢有关。总体而言，
酶活性变化趋势同次生代谢产物含量的变化趋势一
致，一定程度上反映了槐角苷含量的高低;最适于细
602 广 西 植 物 33 卷
胞生长的 pH 不一定有利于黄酮类化合物的积累。
当植物受到外界刺激或是伤害时体内 PAL 活性快
速升高，黄酮类和木质素等次生代谢物质增多有助
于细胞的存活，这是一种应激反应。
槐角愈伤组织合成黄酮类化合物的最佳 pH 为
6． 6，同杜仲细胞产生桃叶珊瑚苷的最佳 pH5． 8 相
比较高(王亚琴等，2007) ，但都为弱酸性，其原因是
弱酸性环境下黄酮类化合物的羰基更易结合溶液中
的氢离子形成羟基(徐璐等，2005) ，使得结构更稳
定。实际应用中应考虑生长天数和槐角苷的产量，
选择最佳收获时间以节约成本。综合不同 pH 下槐
角苷的积累及生长天数，选择 pH 值为 6． 6 ± 0． 05，
第 25 ～ 30 天收获。
目前对槐角药用成分的利用是通过槐花、槐角
直接提取，通过测定槐角细胞在不同 pH 下的生物
量、PAL活性和黄酮类化合物的产量为植物组织培
养生产药用成分的开发与利用奠定基础，在一定程
度上打破地域和季节的限制，为今后的研究提供科
学合理的依据。
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7022 期 魏振园等:pH对槐角愈伤组织黄酮类化合物产量的影响