全 文 ：第 27卷 第 4 期
Vol.27 , No.4 广 西 农 业 生 物 科 学Journal o f Guangx i Ag ric.and Biol.Science 2008 年 12 月Dec., 2008
　　收稿日期:2007-05-10;　　　修回日期:2007-11-29。
　　基金项目:国家自然科学基金项目 (30470020);广西自然科学基金项目 (桂科青 0728002)。
　　作者简介:曹金如 (1974-), 女 , 湖南湘潭人 , 硕士研究生;E-mail:cao jinru102@sina.com。
通讯作者:唐纪良 , 教授 , 博士生导师;E-mail:jltang@gxu.edu.cn。
文章编号:1008-3464 (2008)04-0456-05
十字花科黑腐病菌 RNA提取与质量鉴定
曹金如1 , 廖洁1 , 廖青1 , 梁晓夏1 , 2 , 何勇强1 ,2 , 唐纪良1 ,2
(1　广西大学 生命科学与技术学院;2　广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 , 广西 南宁 530005)
摘要:十字花科黑腐病菌 , 学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (X anthomonas campestris
pv.campestris , 简称 Xcc), 是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌 , 能在世界范围内侵染十字花科植物 , 给
农业生产造成重大损失。 RNA 是分子生物学的主要研究对象之一 , 提取高质量的 RNA 是研究十字花科黑
腐病菌基因表达调控机理的基础。由于 X cc能产生大量胞外多糖及黄单胞色素 , 且细菌 RNA 半衰期较短 ,
目前尚缺少一种大量提取 X cc高质量 RNA 的有效方法。该研究在参考多种 RNA 提取方法的基础上 , 建立
了一种简单 、 有效的适合十字花科黑腐病菌 RNA 的提取方法。得到的 RNA 样品经过紫外分光光度法和甲
醛变性凝胶电泳检测 , 证实为完整 、 均一的总 RNA , 达到了表达谱分析及 cDNA 文库构建的要求。
关键词:十字花科黑腐病菌;总 RNA 提取;热酸性酚法
中图分类号:Q782　　　文献标识码:A
Isolation and quality assay of total RNA from
Xanthomonas campestris pv.campestris
CAO Jin-ru1 , LIAO Jie1 , LIAO Qing1 , LIANG Xiao-xia1 , HE Yong-qiang1 , 2 , TANG Ji-liang1 , 2
(1　Co lleg e of Life Science and Technolog y;2 　Guangxi Key Labo ra to ry of Subt ropical Bio resources
Conserv ation and U tiliza tion ;Guangx i Unive rsity , Nanning 530005 , China)
Abstract:Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc) is a yellow pigmented gram-
negat ive bacterium that belongs to the γ-subdivision of proteobacteria.This bacterium can infect
cruciferous plants w o rld-w ide , causing severe losses in ag ricul tural production.RNA is an impo rtant
genet ic material , thus the isolation and purification of RNA samples is a key step fo r elucidat ing the
mechanisms of g ene expression and regulation in Xcc.However , Xcc can produce more
exopoly saccharides and xanthomonadin than many other bacteria;the isolation of high quality RNA
from this bacterium is dif ficult.There is no an ef ficient me thod fo r isolating high quali ty RNA from
Xcc.In this study , a simple and ef fective method fo r ex t racting total RNA from Xcc was
e stablished.The isola ted RNA sample w as de termined in integ rity and purity by using formaldehyde
agarose gel elect ropho resis and UV spectrophotometer and w as found to be sui table fo r const ruct ing
cDNA library and screening dif fe rential expressed genes by RT-PCR o r microarray analy sis.
Key words:Xanthomonas campestris pv.campestris;isolation o f to tal RNA;hot acidic pheno l
method
核糖核酸 (Ribonucleic Acid , RNA)在生物体内主要参与遗传信息的传递及加工 、 基因表达与
调控等生命过程 , 是分子生物学的主要研究对象之一 , 提取高质量的 RNA是在分子水平上研究生物
体基因表达与调控机理的基础 。随着分子生物学和基因组学研究的发展 , 从多种动植物组织 、细胞中
和一些细菌 、真菌菌体中提取高质量 RNA 的提取方法已建立起来[ 1-4] 。十字花科黑腐病菌 , 学名野
油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv.campestris , Xcc), 是一类 γ-变形菌纲
的革兰氏阴性细菌 , 是十字花科植物重要的病原物[ 5] , 该菌易于培养 、保存 , 具有较好的遗传可操作
性 , 因此 , 自 20世纪 80年代初 , Xcc即成为研究微生物与寄主相互作用分子机理的重要的模式细菌
之一[ 6] 。由于 Xcc能产生大量胞外多糖 , 且细菌 RNA 半衰期较短[ 7] , 给提取高质量 RNA 增加了一
定的难度。以往本实验室主要使用的 RNA 提取试剂有两种 , 即市售的 T 试剂和 S 试剂 。T 试剂属于
一步法 RNA 提取试剂 , 操作简便 , 成本较低 , 然而用该试剂提取的 RNA 质量不稳定 , 经乙醇沉淀 、
低温保存后的 RNA样本 , 加超纯水溶解时 , 易产生白色不溶物 , 直接影响了下游实验的质量 。S 试
剂提取的 RNA 质量较高 , 但操作步骤较多 , 每次提取的 RNA 数量较少 , 成本也比较高。针对以上
问题 , 我们在对十字花科黑腐病菌的培养特性 、 不同提取试剂的化学特性 、 操作步骤分析的基础上 ,
建立了一种简单 、有效的适合十字花科黑腐病菌 RNA 的提取方法 。
1　材料与方法
1.1　材料
十字花科黑腐病菌 (Xanthomonas campestris pv.campestris , Xcc)Xcc 8004菌株 , 具有利福
平抗性。
1.2　培养基
NYG (Nutrient Yeast Glyce ro l):聚蛋白胨 5.0 g , 酵母提取物 3.0 g , 甘油 20.0 g/L , 调整pH
至 7.0。XVM2 (Xanthomoas vesicatoria medium 2):氯化钠20 mmol/L ,硫酸铵 10 mmol/L , 硫酸
镁 5 mmo l/L , 氯化钙 1 mmol/ L , 磷酸二氢钾 0.16 mmo l/L , 磷酸氢二钾 0.32 mmol/ L , 硫酸亚铁
0.01 mmol/ L , 果糖 10 mmol/ L , 蔗糖 10 mmol/ L , 酪氨酸 0.03%, 蒸馏水定容至 1 L , 调整 pH 至
6.7。萝卜叶片组织液培养基:满身红萝卜 (Raphanus sat ivus L.var.rad iculus Pers.)的叶片用
75%乙醇表面消毒 , 在超净台中研磨叶片 500 g , 提取萝卜组织原液 , 用 0.45 μm 滤膜除菌;以萝卜
叶片组织原液和 XVM2以 1/10比例混合。
1.3 主要试剂
TES 液 (Tris EDTA SDS):10 mmol/L 的 T ris-HCl , pH 7.5 , 1 mmol/ L 的 EDTA
(Ethy lenediamine Tetraace tic Acid), pH8.0 , 0.5%的 SDS (Sodium Dodecy l Sulfate)。 1 ×TE
(T ris EDTA)溶液:10 mmol/ L Tris HCI , pH 7.5 , 1 mmo l/L EDTA , pH 8.0 , 3 mol/L NaAc。
焦碳酸二乙酯 (DEPC)水:去离子水或M illi-Q 系统制备的高纯水 , 加入 DEPC至终浓度 0.1%, 放
置过夜 , 高压灭菌。酸性酚:pH 小于 5.0的水饱和酚 。其他化学试剂:氯仿 、 无水乙醇及 70%乙
醇。RNA 提取试剂盒:试剂盒 T (Trizo l试剂盒 , 美国 Invit rogen 公司)和试剂盒 S (SV 总 RNA
提取试剂盒 , 上海 Promega 公司)。
10×MOPS 缓冲液:0.2 mol/L MOPS (3-N-吗啉-丙磺酸), 80 mmo l/L NaAc , 10 mmo l/L
EDTAN a2 , 先用 400 mL DEPC 水溶解 20.6 g MOPS 和 4.1 g NaAc 后 , 加入 10 mL 0.5 mo l/L
EDTA , 定容 500 mL 。用 0.22 mm 滤器过滤除菌 , 避光保存 。1×MOPS 电泳缓冲液:取 150 mL
10×MOPS , 加入 80 mL 的 37%甲醛 , 加 DEPC 水至 1 500 mL。
5×甲醛凝胶电泳缓冲液:0.1 mo l/L MOPS (pH 7.0), 40 mmo l/L NaAc , 5 mol/ L EDTA
(pH 8.0)。甲醛凝胶加样缓冲液:50%蔗糖 , l mmo l/L EDTA (pH 8.0), 0.25%溴酚蓝 , 0.25%
二甲苯青 。
以上试剂含 T ris HCI的用DEPC水配制 , 其余试剂均用 0.1%DEPC处理过夜 , 然后高压灭菌。
所用塑料物品均为 RN ase-f ree 一次性耗材 , 研钵 、 手术剪刀 、 镊子 、试剂瓶等玻璃 、 金属以及陶瓷
制品用铝箔纸严密包裹后 , 180°C干烤过夜 。
457第 4 期 　　　　曹金如等:十字花科黑腐病菌 RNA 提取与质量鉴定
1.4 实验方法
1.4.1　细菌培养及菌体收集 　十字花科黑腐病菌 Xcc 8004 菌株接种于 NYG 在 28°C培养到
OD 600 =1.0 , 接种于 XVM2 , 在 28°C培养到OD600=0.6 , 或接种于萝卜叶片组织培养液 , 在 28°C
培养到 OD6 00 =1.0。各取细菌 100 mL 菌液分装入 50 mL 离心管中 , 4°C , 5 300 r/min , 5 min , 弃
上清 。加 8 mL 1×TE/管重悬混匀 ,每管 1 mL 分装到 1.5 mL 的 EP(eppendorf)管中 ,12 000 r/min ,
2 min , 弃上清 , 洗去胞外多糖。液氮冻存 15 m in后转至-80°C保存。
1.4.2　RNA提取
(1)用试剂盒提取 RNA:用 T 试剂盒和 S试剂盒提取 RNA 时 , 按照相应产品的使用操作步骤
说明进行 。
(2)酸酚法提取 RNA:冻存的细胞融化 , 加 400 μL T ES 液 , 混匀后加 400 μL 酸性酚 , 剧烈振
荡 2 min。60°C振荡 1 h (1 400 r/min , 间隔 10 s 振一次)。冰浴 5 min , 4°C , 12 000 r/min ,
10 min。取上清 , 加 400 μL 氯仿 , 剧烈振荡 2 m in , 4 °C , 12 000 r/min , 10 m in。取上清 , 加
30 ～ 35μL 3 mol/L NaAc , 2.5倍体积预冷的无水乙醇 , -20°C , 静置 30 min。4°C , 12 000 r/min ,
离心 15 min , 沉淀溶于 30 μL DEPC水中。
TES与酸酚的体积比为 1∶1 , 可以根据细胞量增加或减少。
1.4.3　RNA纯度及完整性的检测
(1)RNA 甲醛变性凝胶电泳法检测:配制 1.2%琼脂糖凝胶 , 制胶时溴化乙锭直接加入凝胶中 ,
将提取出的 RNA 经琼脂糖凝胶电泳 , 电泳槽用 0.3% H 2O2 浸泡 30 m in , DEPC 水冲洗晾干 。铺胶
材料 (20 mL):0.24 g (1.2%)琼脂糖 , 17.4 mL DEPC水 , 2.0 mL 10×MOPS , 0.6 mL 37%甲
醛 , 1 mL 溴化乙锭 (EB)。将琼脂糖加水融化后 , 加 10×MOPS , 待胶冷却至 60°C左右 , 再加甲醛
和溴化乙锭。加 2.0 mL 甲醛凝胶加样缓冲液 (10×)。加样和电泳 , 电泳液为 1×MOPS 电泳缓冲
液。将凝胶预电泳 5 min , 电压降为 5 V/cm 。随后加样品和标准物 , 以 3 ～ 4 V/cm 电压降电泳 。电
泳结束后 , 在紫外灯上 , 用核酸凝胶成像系统拍照。
(2)紫外分光光度法检测:取 RNA样品用紫外/可见光分光光度计于 230 nm 、 260 nm 、 280 nm
处测定 A 值 。以式:RNA 浓度 (μg/mL)=A 260值 ×40×稀释倍数 , 计算样品中 RNA 浓度 , 以
A 260/A 280和 A 260/A 230的比值评估 RNA的纯度 。
1.4.4　基因表达分析　在基因表达分析中 , 总 RNA 的质量包括完整性和纯度是相当重要的 , 制备
高质量的 RNA是试验的一个关键。本实验将热酸性酚法提取十字花科黑腐病菌 Xcc 8004 菌株总
RNA 用于 RT-PCR以及芯片杂交来检测此法对合成总 RNA 的质量。
2　结果与分析
2.1　不同提取方法十字花科黑腐病菌 RNA产量
采用试剂盒 T 、 试剂盒 S和热酸性酚法分别提取三种常用培养基培养的十字花科黑腐病菌的总
RNA , 总 RNA 产量列于表 1 , 结果表明:在三种培养条件下 , 热酸性酚法获得的总 RNA 量均最高 ,
而试剂盒 T 得到的总 RNA 量最少 , 试剂盒 S 稍高于试剂盒 T , 均显著低于热酸性酚法 。结果还表
明 , 三种提取方法中 , 均以 NYG培养的 RNA产量最高 , 萝卜叶提取液培养次之 , XVM2培养条件
的产量最低。
2.2　不同提取方法十字花科黑腐病菌 RNA质量
提取的 RNA 溶液 A260/A 280的比值介于 1.7 ～ 2.0时 RNA 纯度高 , 如果小于 1.7则说明有蛋白质
的污染或是 RNA 发生降解;提取的 RNA 溶液 A 260/A 230的比值大于 2.0 时 RNA 纯度高 , 如果远小
于 2.0 , 则表明其中有大量的小分子或盐存在。三种方法提取的 RNA 样品的纯度检测分析(见表 1)。
从表 1中的 A 260/A 280和 A 260/A 230数据表明 , 热酸性酚法与试剂盒 S提取的总 RNA 纯度较高 , 而试
剂盒 T 提取的总 RNA 纯度很低 , 蛋白质含量较高 。
458 广 西 农 业 生 物 科 学 　　　　 第 27 卷
表 1　不同提取方法十字花科黑腐病菌 RNA质量 、 浓度比较
Tab.1　The quality and concentration of RNA samples isolated by different methods
培养基
Medium
RN A浓度/μg.μL -1
Concent ration of RNA
试剂盒 T
Reagent
ki t T
试剂盒 S
Reagen t
kit S
热酸酚法
Acid
phen ol
A 260/A 280
试剂盒 T
Reagent
kit T
试剂盒 S
Reagent
ki t S
热酸酚法
Acid
phenol
A 260/A 230
试剂盒 T
Reagen t
kit T
试剂盒 S
Reagent
ki t S
热酸酚法
Acid
phenol
NYG 2.01±0.10 2.31±0.21 4.11±0.15 1.64±0.05 2.04±0.08 2.01±0.03 2.03±0.05 2.04±0.06 2.03±0.02
XVM2 0.95±0.06 1.16±0.02 2.14±0.14 1.74±0.04 2.04±0.06 2.05±0.05 1.97±0.03 2.21±0.09 2.09±0.06
萝卜叶提取液
Ext ract of
radish leaves
1.84±0.06 2.27±0.03 3.92±0.08 1.63±0.06 2.13±0.07 2.04±0.05 1.97±0.08 2.01±0.04 2.08±0.02
2.3　三种方法提取十字花科黑腐病菌总 RNA完整性
采用三种不同的提取方法 , 对 RNA 样品的完整性分析见图 1。RNA 琼脂糖凝胶电泳结果明显可
见 , 试剂盒 T 提取的总 RNA 明显拖尾 、 亮度较暗 , 小分子量区域量多 (图 1-A), 表明该法提取的
总 RNA 不完整且产量低。而热酸性酚法和试剂盒 S 提取的总 RNA , 每个泳道都有三条清晰的条带
(图 1-B和图 1-C), 它们分别为 23S 、 16S和 5S rRNA , 泳带整齐 、 边界清晰。表明这两种方法提取
的十字花科黑腐病菌总 RNA 具有较好的完整性 。
图 1　三种 RNA提取方法提取的 Xcc 的 RNA甲醛变性凝胶电泳图谱
Fig.1　RNA samples isolated by different methods were analyzed by formaldehyde agarose gel electrophoresis
A、 B 、 C 分别为采用试剂盒 T 法 、 试剂盒 S 法 、 酸酚法提取的 RNA 样本;泳道 1 、 2、 3 分别代表采用 NYG、
XVM2及萝卜叶提取液培养条件下的 X cc菌体
A.Reagent kit T;B.Reagent kit S;C.Acid pheno l method;Lane 1 , NYG;Lane 2 , XVM2;Lane 3 , ex tract o f
radish leaves
2.4 热酸性酚法提取总 RNA用于基因表达分析
由于热酸性酚法提取总 RNA 无论在浓度 、 完整性上都较为理想[ 8] , 而且费用比试剂盒低 , 适合
批量处理材料 , 我们采用热酸性酚法提取十字花科黑腐病菌 Xcc 8004菌株总 RNA , 去除 DNA 后用
来做芯片杂交和 RT-PCR。RT-PCR验证结果显示 , 此法提取的总 RNA 质量能满足 RT-PCR的需要
(图 2-A), 用于芯片杂交结果也很理想 (图 2-B)。
459第 4 期 　　　　曹金如等:十字花科黑腐病菌 RNA 提取与质量鉴定
图 2　热酸性酚法提取总 RNA用于基因表达分析
Fig.2　Total RNA isolated by using hot acidic phenol method for gene expression analysis
A.用于 RT-PCR 分析。M 为 DNA marker;泳道 1 ～ 10 为目标基因表达产物 , 1 、 3 、 5、 7 、 9分别表示 XC0241、
XC3810、 XC1879 、 XC1556 、 XC2458 在 NYG 中的表达情况;2、 4 、 6、 8 、 10 分别表示 XC0241、 XC3810、 XC1879、
XC1556、 XC2458在 XVM2中的表达情况。
B.芯片杂交基因表达分析。每一个圆点代表一个基因的杂交结果。在原始图中 , 红色:基因表达上调;黄色:
基因表达水平和野生型一致的;绿色:基因表达下调。
A.RT-PCR analy sis result.M , DNA marker;Lane 1 ～ 10:RT-PC R re sults of the ta rget genes.Lane 1 , 3 , 5 , 7 ,
9 show the RT-PCR results o f the ta rge t g ene s XC0241 , XC3810 , XC1879 , XC1556 , and XC2458 when Xcc 8004 w as
cultured in NYG.Lane 2 , 4 , 6 , 8 , 10 show the RT-PCR results of the above genes w hen Xcc 8004 w as cultured in
XVM2.
B.Micro arr ay analy sis result.Each circle indica tes the hybridization result of one gene.I n the o rig inal figure , red
indica tes the up-regulated expression;yellow , equal expre ssional lev el;g reen , dow n-regulated expression.
3　讨论
总 RNA 的提取不仅是分子生物学技术的重要组成部分 , 也是功能基因组学技术的重要基础 。随
着细菌的后基因组时代的到来 , 寻求一种有效的提取细菌 mRNA 的方法成为迫切需要解决的问题。
Xcc在生长过程中产生大量胞外多糖及黄单胞色素[ 9-11] , 影响总 RNA 的分离和提取。在本研究中对
Xcc的三种 RNA提取方法进行了比较 , 试剂盒 T 提取的总 RNA 中存在大量的杂质和沉淀 , 质量不
能满足我们实验的要求 , 试剂盒 S提取的总 RNA 的质量比试剂盒 T 提取的总 RNA质量好 , 但是成
本价格较高。采用的热酸性酚法提取的总 RNA 不仅成本价格便宜 , 而且质量好 , 达到了表达谱分析
及 cDNA 文库构建的要求。胞外多糖是一种酸性杂多糖 , 黄色素具有杂环结构 , 两者在提取细菌
RNA 时 , 影响 RNA的产率 , 而本研究所采用的热酸性酚能降低胞外多糖及黄色素对提取细菌 RNA
过程中的影响。本研究建立了一种简单 、有效的适合十字花科黑腐病菌 RNA 的提取方法 , 为下一步
进行基因表达分析奠定了技术基础 。
致谢　感谢北京博奥生物芯片有限责任公司暨生物芯片北京国家工程研究中心提供的技术帮助。
(下转第 476页)
460 广 西 农 业 生 物 科 学 　　　　 第 27 卷
分量作相关性分析 , 其相关系数为 0.93464 , 这表明 SMA 能有效地分离了荒漠化土地信息。
本研究利用裸沙占地百分比分量评价研究区域的荒漠化程度 , 与外业调查结果比较 , 其精度可达
86.7%, 并且错分的程度不大 。使用此方法评价土地荒漠化是可行的 , 具有较高的科学性。
基本组分的选取是决定模型分析精度的关键 , 这有待作进一步的研究 。
参考文献:
[ 1] 　朱俊凤 , 朱震达.中国沙漠化防治 [ M] .北京:中国林业出版 , 1999.
[ 2] 　周劲松 , 蹼励杰.沙漠化概念及实践意义雏议 [ J] .中国沙漠 , 1996 , 16 (2):191-195.
[ 3] 　李清河 , 孙保平 , 孙李达.荒漠化动态监测与评价研究进展 [ J] .北京林业大学学报 , 1998 , 20 (3):67-73.
[ 4] 　林进 , 周卫东.中国荒漠化监测技术综述 [ J] .世界林业研究 , 1998 , 11 (5):258-63.
[ 5] 　慈龙骏.世界防治荒漠化新进展 [ C] //中国治沙暨沙业学会.中国治沙暨沙业学会论文集.北京:北京师范
大学出版社 , 1995:36-39.
[ 6] 　吴薇.沙漠化遥感动态监测的方法与实践 [ J] .遥感技术与应用 , 1997 , 12 (4):14-20.
[ 7] 　吕长春 , 王忠武 , 钱少猛.混合像元分解模型综述 [ J] .遥感信息 , 2003 (3)55-59.
[ 8] 　游晓斌 , 游先祥 , 相莹莹.混合像元及混合像元分析 [ J] .北京林业大学学报 , 2003 , 25 (3):28-32.
[ 9] 　S ETTLE J J.Linear mixing and the e stimation of gr ound cove r propo rtions [ J] .I nt J Remo te Sens , 1993 ,
14 (6):1159-1177.
[ 10] ALFERDO D.Satellite remo te sensing analysis to monito r deser tification pro cesses in the crop-rangeland
bounda ry o f A rgentina [ J] .Journal of A rid Environments , 2002 , 52:121-133.
[ 11] BATEON A , CU RTISS B.A method for manual end-membe r selection and spectral unmixing [ J] .Remo te
Sensing o f Environment , 1996 , 60:229-243.
(责任编辑　裴润梅)
　　(上接第 460页)
参考文献:
[ 1] 　BOOM R , SOL C J , SALIM ANS M M , e t al.Rapid and simple method fo r purification of nucleic acids [ J] .
Clin M icrobiol , 1990 , 28:495-503.
[ 2] 　ZOLFAGHARI R, CH EN X , FISH ER E A.Sim ple method fo r ex tracting RNA f rom cultured cells and tissue
w ith guanidine salts [ J] .Clin Chem , 1993 , 39:1408-1411.
[ 3] 　NUYTS S , VAN M ELLAERT L , LAMBIN P , et al.Efficient isolation of total RNA from Clostridium without
DNA contamination [ J] .Microbio l Methods , 2001 , 44:235-238.
[ 4] 　Di CELLO F , XIE Y , PAUL-SA TYASEELA M , et al.Approaches to bacte rial RNA isolation and purifica tion
fo r microa rray analy sis o f Escherichia coli K1 inter action with human brain micr ovascular endo the lial cells [ J] .
Clin M icrobiol , 2005 , 43:4197-4199.
[ 5] 　WILLIAMS P H.Black ro t:A continuing threat to wo rld crucifer s [ J] .Plant Dis , 1980 , 64:736-742.
[ 6] 　DANIEL M J , BARBER C E , T URNER P C , e t al.Isolation o f mutants of X anthomonas campestris pv.
campestris showing alter ed pathogenicity [ J] .Gen M icrobiol , 1984 , 130:2447-2455.
[ 7] 　LI-KOROTKY H S , KELLY L A.Evaluation of microbial RNA ex tractions from S trep tococcus pneumoniae [ J] .
Microbiol M ethods , 2007 , 68:342-348.
[ 8] 　奥斯伯 F.精编分子生物学实验指南 [ M] .北京:科学出版社 , 1998.
[ 9] 　WENGELNIK K , MA RIE C , RUSS EL M , e t a l.Expression and localization of H rpA1 , a pro tein o f
Xanthomonas campestris pv.vesicatoria essential fo r pathogenicity and induc tion of the hypersensitive r eac tion
[ J] .Bac teriol , 1996 , 178:1061-1069.
[ 10] DANIEL M J , BARBER C E , TURNER P C , e t al.Cloning of g enes invo lved in pathogenicity of X anthomonas
campestris pv.campestris using the br oad ho st range co smid pLAFR1 [ J] .EMBO , 1984 , 3:3323-3328.
[ 11] SWINGS J G , CIVEROLO E L.X anthomonas [ M] .London:Chapman and Hall , 1993.
(责任编辑　梁健)
476 广 西 农 业 生 物 科 学 　　　　 第 27 卷