全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 45(6):606-618(2015)
收稿日期:2014-06-06;修回日期:2015-05-14
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31260443) ;广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019097;2013GXNSFBA019088)
通讯作者:姜伯乐，研究员，主要从事植物病原物分子相互作用研究;Tel:0771-3239255，E-mail:jbl1971@ gxu．edu．cn
第一作者:曾献莹，女，广西南宁人，硕士研究生，主要从事植物病原物分子相互作用研究;E-mail:342442133@ qq．com。
doi:10．13926 / j．cnki．apps．2015．06．007
十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
曾献莹1，李婉莲1，杨丽超1，蒋国凤2，王 凛1，3，甘永亮1，阳丽艳1，姜伯乐1，4*
(1广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004;2广西大学林学院，南宁 530004;3桂林医学院生物技术学院，桂林 541004;
4亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁 530004)
摘要:通过对 Xcc 8004菌株的 hrp 基因进行逐一敲除，系统研究单个 hrp 基因对 Xcc 致病性的贡献。结果表明，9 个 hrc
(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒 ECW-10R上激发 HR的能力完
全丧失;9个 hrp 基因中，hrpW 突变后在辣椒 ECW-10R上仍能产生 HR，满身红萝卜上致病性减弱，其余 hrp 基因突变后致
病性和过敏反应均丧失;4个 hpa (hrp associated protein)基因突变后，hpaA 和 hpaB 突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒
性也不能在辣椒 ECW-10R上引起 HR，hpa1和 hpaP突变后致病性和 HR显著减弱。另外，通过 RT-PCR对 Xcc 8004 hrp 基
因簇的每个基因受 hrpX和 hrpG 的调控情况进行分析，结果表明所有 hrp 基因在不同程度上都受到 hrpG、hrpX的正向调控。
关键词:十字花科黑腐病菌;hrp 基因;致病性;HR反应
Pathogenesis analysis of hrp genes in Xanthomonas campestris pv． campestris
ZENG Xian-ying1，LI Wan-lian1，YANG Li-chao1，JIANG Guo-feng2，WANG Lin1，3，GAN Yong-liang1，
YANG Li-yan1，JIANG Bo-le1，4 (1 College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，
China;2College of Forest，Guangxi University，Nanning 530004，China;3College of Biotechnology，Guilin Medical University，
Guilin 541004，China;4State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning
530004，China)
Abstract:Xanthomonas campestris pathovar campestris (Xcc)causes serious black rot in all cruciferous plants
worldwide． Gram-negative phytopathogenic bacteria including Xcc cause disease in host plants and trigger a HR
(hypersensitive response) in non-hosts or resistant host plant through injecting type III secreted effectors
(T3SEs)into host cells． T3SEs are a class of proteins secreted by the conserved type III secretion system
(T3SS)which is encoded by hrp cluster． To investigate the functionality of hrp genes per se in hrp cluster，the
deletion mutants for each hrp gene were constructed． The results showed that each mutation of the nine hrc genes
abolished virulence in Chinese radish and lost HR induction in pepper ECW-10R． As for the nine hrp genes，only
the knockout of hrpW triggered a tardy HR and decreased virulence，others lost virulence and HR induction com-
pletely． The virulence and the ability to trigger HR abolished in hpaA and hpaB mutants，while the deletion of
hpa1 and hpaP reduced virulence and HR significantly． Furthermore，transcription analysis through RT-PCR
demonstrated that all members of hrp cluster in Xcc 8004 were activated by hrpG and hrpX at different levels．
Key words:Xanthomonas campestris pathovar campestris;hrp ;pathogenicity;HR
中图分类号:S432．1 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2015)06-0606-13
大多数动植物致病细菌中广泛存在一个能将
细菌蛋白(主要是效应物蛋白)直接分泌到寄主细
胞内的蛋白质分泌系统，即 III 型分泌系统(Type
III secretion system，T3SS)［1］。T3SS 分泌系统装
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
置是类似于注射器的针状结构复合体，病原细菌利
用其将胞质内的 III 型效应物蛋白(Type III secre-
ted effectors，T3SEs)直接“注射”到寄主细胞内，
从而干扰寄主防卫反应信号途径和影响寄主细胞
正常功能来帮助植物病原菌感染寄主植物［2，3］。
在植物病原菌中，保守的 T3SS 系统由成簇的存在
于染色体上的 hrp (hypersensitive reaction and
pathogenicity)基因编码。hrp 基因控制植物病原
菌对寄主植物的致病性和诱导非寄主植物或抗性
植物产生过敏性反应［4］。
十字花科黑腐病菌即野油菜黄单胞菌野油菜
致病变种(Xanthomonas campestris pv． campestris，
Xcc) ，是造成十字花科植物病害最严重的致病菌
之一，能够在全球范围内引起所有十字花科植物产
生黑腐病［5，6］。Xcc 8004 hrp 基因簇全长 23 kb，由
25个核心基因和附属的 2个调控基因组成。25 个
核心基因由 10个 hrp 基因，9个保守的 hrc 基因以
及 6个 hpa 基因构成［6］。根据文献［7］及实验室
未发表数据，推测 Xcc 8004 的 hrp 基因簇至少由
10个操纵子组成:hpa2、hpa1、hrcC、hrpB (8 个基
因)、hrpC (3个基因)、hrpD (6 个基因)、hrpE (2
个基因)、hrpW、XC3024 和 hrpF。高度保守的 hrc
基因通常编码 T3SS 的核心装置部分，hpa 基因产
物有些属于依赖 Hrp T3SS 系统的外泌蛋白，对分
泌过程起辅助作用，而大多数非保守 hrp 基因产物
的功能目前还不清楚［8］。除 Hpa1、HpaA、HpaP、
HpaA 蛋白和 hrp 基因簇内唯一的保守性假定蛋白
(XC3024)同源性较低外，其余 Hrp 蛋白都相当
保守［6］。
Xcc 的 hrp 基因调控属于第 II 类 hrp 调控系
统［9］。该类调控中 hrpG 正向调控 hrpX，其它下游
hrp 基因和效应物基因的转录则受到 hrpX 调
控［10～12］，表达的 Hrp和 Hrc蛋白组装成 III 型分泌
系统装置。但这一调控网络目前还不完整，具体的
调控作用及调控机理尚未明确。
目前大多数植物病原菌先后鉴定了 hrp 基因
簇，而在十字花科黑腐病菌中，Arlat 等［13］最早报
道 hrp 基因簇与致病有关。Chao 等［11］和 Jiang
等［14］曾报道了 Xcc 8004 hrp 基因的关键调控基因
hrpG、hrpX，易位子蛋白 HrpF 和分子伴侣蛋白
HpaB 控制 T3SEs 转运［15，16］，Hpa2［17］和 Hpa4［18］
与 Xcc 8004致病无关，但 Xcc hrp 基因簇中其他核
心组成基因的功能研究未见报道。为了进一步明
确 Xcc 8004中各 hrp 基因的功能，完善 hrp 基因簇
的调控机理，本研究通过构建 hrp 基因簇核心组成
基因的突变体，对其在寄主植物满身红萝卜上的致
病性及在非寄主植物辣椒 ECW-10R上激发 HR反
应的能力进行定性、定量检测，并通过 RT-PCR 检
测了每个 hrp 基因簇核心成员的转录受 hrpG 和
hrpX的调控情况。
1 材料与方法
1．1 菌株、质粒及培养条件
所用菌株、质粒(表 1)。十字花科黑腐病菌
的培养基为 NYG (Nutrient Yeast Glycerol) ，
诱导培养基为 XCM1［19］，培养温度为 28℃［20］。大
肠杆菌(Escherichia coli)的培养基为 LB (Lysoge-
ny Broth) ，培养温度为 37℃［21］;抗生素用量参见
文献［19］。
Table 1 Strains and plasmid used in this study
Strain or plasmid Relevant characteristics Source or reference
Strain
Xcc 8004 Wild type strain，Rif r ［20］
DM3002 The XC3002 (hpa1)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r Our lab’s collection
DM3003 The XC3003 (hrcC)insert mutant of Tn5-gusA5;Rif r，Kanr Our lab’s collection
DM3004 The XC3004 (hrcT)integration mutant of pK18mob，Rif r，Kanr Our lab’s collection
DM3005 The XC3005 (hrpB7)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3006 The XC3006 (hrcN)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
706
植物病理学报 45卷
Table 1 Strains and plasmid used in this study (Continued)
Strain or plasmid Relevant characteristics Source or reference
DM3007 The XC3007 (hrpB5)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3008 The XC3008 (hrpB4)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3009 The XC3009 (hrcJ)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3010 The XC3010 (hrpB2)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3011 The XC3011 (hrpB1)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3012 The XC3012 (hrcU)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3013 The XC3013 (hrcV)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3014 The XC3014 (hpaP)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3015 The XC3015 (hrcQ)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3016 The XC3016 (hrcR)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3017 The XC3017 (hrcS)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3018 The XC3018 (hpaA)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3019 The XC3019 (hrpD5)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3020 The XC3020 (hrpD6)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3021 The XC3021 (hrpE)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r This work
DM3022 The XC3022 (hpaB)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r Our lab’s collection
DM3023 The XC3023 (hrpW)deletion mutant of Xcc 8004，Rif r Our lab’s collection
ΔhrpX The hrpX deletion mutant of Xcc 8004，Rif r ［16］
ΔhrpG The hrpG deletion mutant of Xcc 8004，Rif r ［16］
ΔavrBs1 The avrBs1 deletion mutant of Xcc 8004，Rif r ［16］
CDM3002 The XC3002 complementation strain of DM3002，Rif r，Tcr Our lab’s collection
CDM3003 The XC3003 complementation strain of DM3003，Rif r，Kanr，Tcr Our lab’s collection
CDM3004 The XC3004 complementation strain of DM3004，Rif r，Kanr，Tcr Our lab’s collection
CDM3005 The XC3005 complementation strain of DM3005，Rif r，Tcr This work
CDM3006 The XC3006 complementation strain of DM3006，Rif r，Tcr This work
CDM3007 The XC3007 complementation strain of DM3007，Rif r，Tcr This work
CDM3008 The XC3008 complementation strain of DM3008，Rif r，Tcr This work
CDM3009 The XC3009 complementation strain of DM3009，Rif r，Tcr This work
CDM3010 The XC3010 complementation strain of DM3010，Rif r，Tcr This work
CDM3011 The XC3011 complementation strain of DM3011，Rif r，Tcr This work
CDM3012 The XC3012 complementation strain of DM3012，Rif r，Tcr This work
CDM3013 The XC3013 complementation strain of DM3013，Rif r，Tcr This work
CDM3014 The XC3014 complementation strain of DM3014，Rif r，Tcr This work
CDM3015 The XC3015 complementation strain of DM3015，Rif r，Tcr This work
CDM3016 The XC3016 complementation strain of DM3016，Rif r，Tcr This work
CDM3017 The XC3017 complementation strain of DM3017，Rif r，Tcr This work
806
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
Table 1 Strains and plasmid used in this study (Continued)
Strain or plasmid Relevant characteristics Source or reference
CDM3018 The XC3018 complementation strain of DM3018，Rif r，Tcr This work
CDM3019 The XC3019 complementation strain of DM3019，Rif r，Tcr This work
CDM3020 The XC3020 complementation strain of DM3020，Rif r，Tcr This work
CDM3021 The XC3021 complementation strain of DM3021，Rif r，Tcr This work
CDM3022 The XC3022 complementation strain of DM3022，Rif r，Tcr Our lab’s collection
CDM3023 The XC3023 complementation strain of DM3023，Rif r，Tcr Our lab’s collection
Plasmid
pK18mobsacB Suicide plasmid，Kanr ［22］
pK18mobsacB3002
A 1400 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3002 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
Our lab’s collection
pK18mobsacB3005
A 1436 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3005 locus was ligated into pK18mobsacB Kanr
This work
pK18mobsacB3006
A 1442 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3006 locus was ligated into pK18mobsacB ，Kanr
This work
pK18mobsacB3007
A 1439 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3007 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3008
A 1448 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3008 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3009
A 1442 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3009 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3010
A 1440 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3010 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3011
A 1443 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3011 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3012
A 1446 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3012 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3013
A 1436 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3013 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3014
A 1449 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3014 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3015
A 1438 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3015 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3016
A 1437 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3016 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3017
A 1437 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3017 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3018
A 1438 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3018 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
906
植物病理学报 45卷
Table 1 Strains and plasmid used in this study (Continued)
Strain or plasmid Relevant characteristics Source or reference
pK18mobsacB3019
A 1447 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3019 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3020
A 1443 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3020 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3021
A 1536 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3021 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
This work
pK18mobsacB3022
A 1380 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3022 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
Our lab’s collection
pK18mobsacB3023
A 1400 bp fusion of the left and right flanking fragment of the
XC3023 locus was ligated into pK18mobsacB，Kanr
Our lab’s collection
pLAFRJ
Shuttle plasmid pLAFR3 derivate containing the multiple cloning sites of
pUC19，Tcr
［16］
pLJC3002 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3002，Tcr Our lab’s collection
pLJC3003 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3003，Tcr This work
pLJC3004 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3004，Tcr This work
pLJC3005 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3005，Tcr This work
pLJC3006 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3006，Tcr This work
pLJC3007 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3007，Tcr This work
pLJC3008 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3008，Tcr This work
pLJC3009 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3009，Tcr This work
pLJC3010 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3010，Tcr This work
pLJC3011 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3011，Tcr This work
pLJC3012 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3012，Tcr This work
pLJC3013 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3013，Tcr This work
pLJC3014 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3014，Tcr This work
pLJC3015 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3015，Tcr This work
pLJC3016 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3016，Tcr This work
pLJC3017 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3017，Tcr This work
pLJC3018 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3018，Tcr This work
pLJC3019 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3019，Tcr This work
pLJC3020 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3020，Tcr This work
pLJC3021 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3021，Tcr This work
pLJC3022 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3022，Tcr Our lab’s collection
pLJC3023 pLAFRJ harboring the complementary fragment of XC3023，Tcr Our lab’s collection
1．2 引物和试剂
Taq DNA 聚合酶，总 RNA 提取和反转录试剂
盒购自 TaKaRa公司(中国大连) ，T4 DNA 连接酶
和限制性内切酶购于 Promega 公司(中国上海) ，
PCR产物纯化试剂盒、DNA 片段回收试剂盒、质粒
提取试剂盒等购于杭州博日公司，根据 KEGG 上提
供的 Xcc 8004菌株 III 型分泌系统基因的核苷酸序
列，按照试验需要设计出的引物见表 2。
016
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
Table 2 Primes used in this study
Primer name Sequence (5-3) Primer name Sequence (5-3)
For deletion construction For deletion construction
3005L-F
3005L-R
gggggatcc atgattcttggcccggacgg
gggtctaga acgcatcgtcgatcacgccg
3014L-F
3014L-R
ggggaattcagtgttgatccacgatgtgcc
gggggatcc catggcggaccggtggcttg
3005R-F
3005R-R
gggtctaga ggctgcgtctgcatcgtgcc
gggaagctt gtccagcttgtcggcggcgc
3014R-F
3014R-R
gggggatcc cgaggtcgtctagcgctgca
gggtctaga tgccccagagcagctcgccg
3006L-F
3006L-R
gggggatcc cggagctgccatgcgtcttt
gggtctaga agcatccggcaccgcctgcg
3015L-F
3015L-R
ggggaattc cgcgtgcgacgcaacgtgtc
gggtctaga gcggatcgcagagcactctg
3006R-F
3006R-R
gggtctaga cgatgcgtgagcgtgtcagc
gggaagctt ttgtccgtaggcgatgaacg
3015R-F
3015R-R
gggtctaga cctgatgtcggctcgctgct
gggaagctt caccttgaggcacagcaaca
3007L-F
3007L-R
ggggaattc gcctgcgcgcgttgtccagaa
gggtctaga gtcaaggccgaccgcttccg
3016L-F
3016L-R
ggggaattc cgatgatctgcgcgccctgg
gggggatcc atgcgcagtctccgacatgc
3007R-F
3007R-R
gggtctaga cgcaggcggtgccggatgct
gggaagctt gatcggaggtcgcgcacacc
3016R-F
3016R-R
gggggatcc cggtgacgccatggaccatg
gggaagctt gcgtagcggtcgagcacttc
3008L-F
3008L-R
ggggaattc cgggctgaccgagaacgacgc
gggtctaga ccatccgccggcctcacccc
3017L-F
3017L-R
ggggaattc gcgtgcagatcctcagcatg
gggggatcc ccagatcgtcatggtccatg
3008R-F
3008R-R
gggtctaga gccggagctgccatgcgtct
gggaagctt agcatccggcaccgcctgcg
3017R-F
3017R-R
gggggatcc ttccatgatccggcgcatttc
gggaagctt cggcagcagcagatggaaac
3009L-F
3009L-R
ggggaattc cctgctgcgtgagctggagg
gggtctaga atctgagcgttcgcatgcta
3018L-F
3018L-R
ggggaattc tgggcatggaggcgttcaag
gggggatcc tggaaacgccgcctgcatca
3009R-F
3009R-R
gggtctaga gcctgcgcgcgttgtccaga
gggaagctt gcagtcaaggccgaccgctt
3018R-F
3018R-R
gggggatcc aggagattcgcgcatgacca
gggaagctt gctcaggtcgcggtcggcca
3010L-F
3010L-R
ggggaattc cgatctccggccgctattgc
gggggatcc catggcatgttccgcaggct
3019L-F
3019L-R
ggggaattc ggcggacacggcacatcatg
gggggatcc catgcgcgaatctcctgagc
3010R-F
3010R-R
gggggatcc cagacactgttcaagaacca
gggaagctt ctgccgcagcgaccgccacg
3019R-F
3019R-R
gggggatcc cagcaagcggcgccatgaga
gggaagctt atcgggtgctgctcatctgt
3011L-F
3011L-R
ggggaattc tgagtgcacgaaggccgtac
gggggatcc taccgcacctcttcattcaa
3020L-F
3020L-R
aaaggatcc gattggccggacgatgttgcgct
aaatctaga ggtgcggctctcatggcgccgct
3011R-F
3011R-R
gggggatcc ctgcgcgcctgacccgaact
gggaagctt gaacatctcgccgagattgg
3020R-F
3020R-R
gggtctaga tcatcgatttccttggccacgttg
gggaagctt caatccgagttgcgcctggtcct
3012L-F
3012L-R
ggggaattc ggcatgttccgcaggctgggt
gggggatcc tcatccgacatggcgatctc
3021L-F
3021L-R
ggggaattc gcacaactgcatcgggatca
gggggatcc tataaatactccttagctga
3012R-F
3012R-R
gggggatcc gcggtccgctgccctgctag
gggaagctt ggcctcgcccgcgctcatgc
3021R-F
3021R-R
gggggatcc agcagctggttggccagtaa
gggaagctt cgaagtcctgcggcgggaaa
3013L-F
3013L-R
gggggatcc aaaacttttttcgttacgcag
gggtctaga cgcgcatgccatctcctagc
3002L-F
3002L-R
ggggaattc atcgaattgatctgcatctt
gggggatcc aaaatttgtttccgatagat
3013R-F
3013R-R
gggtctaga agtggtggcctgatgcgcaa
gggaagctt ctgttgacaacacggcgtcc
3002R-F
3002R-R
gggggatcc atgcttgaacaggttgccgaccaatgga
gggaagctt gctgctgcagatcgatgccaccatcat
116
植物病理学报 45卷
Table 2 Primes used in this study (Continued)
Primer name Sequence (5-3) Primer name Sequence (5-3)
For complementation For RT-PCR
C3002F
C3002R
gggggatcc tctctttcatgcctgtcacct
gggaagctt cccgtcatcacctccagcgag
XC3002F
XC3002R
atggactcatctatcggaaac
acaggttggcattgaagcc
C3003F
C3003R
gaaggatcc acatgggagcgatcggcgagt
gggaagctt gcacgttgtacccgtatcgc
XC3003F
XC3003R
gtgcgtgtcagcggttatgc
gtgcgtgtcagcggttatgc
C3004F
C3004R
gaaggatcc cgtgtcagcacctggaggacgtt
gggaagctt gccgttggtgtctcaacaag
XC3004F
XC3004R
gaatcgtttcgctggtggcc
tggaagtggaggaagccgag
C3005F
C3005R
ggggaattc ggctcgatcaccgcgttctacac
gggggatcc aacaacacgaacacgcgcaca
XC3005F
XC3005R
atgcgtgagcgtgtcagcacc
cgcgttgggcttgccaggc
C3006F
C3006R
gggtctaga ccatccttcaggatgcccacgacag
gggaagctt tccagcgcacgcctgcagtcg
XC3006F
XC3006R
atgggcattttcgccgcag
atggtgtcatagtcgctgagc
C3007F
C3007R
ggggaattc gtatgcgcgtgatccaggcct
gggaagctt gccgatcacttcgaccacctt
XC3007F
XC3007R
ttcaggatgcccacgacagg
gatcacgcagatcggtctcg
C3008F
C3008R
ggggaattc aagacggcctgatctccacac
gggaagctt ctgcgtccagttccagcacac
XC3008F
XC3008R
tggcttcaacgatggacggcgg
tgggcaccacacgggcagcg
C3009F
C3009R
ggggaattc cgatggacgttcccaacgcccagta
gggaagctt atccagcgattgcgccagcgt
XC3009F
XC3009R
gcttcccaataacgacccgc
gtcagtccttccacgctgtg
C3010F
C3010R
ggggaattc gaagaggtgcggtatggaaaa
gggaagctt ggaatacagctgctggtcgca
XC3010F
XC3010R
cgctcattcctcctgttgtac
ttgaaaccgaccatcgtcagc
C3011F
C3011R
ggggaattc tcacgaagggcagcgtcagca
gggaagctt ggccggtacttgcagtgatcg
XC3011F
XC3011R
tggaaaagattgaatgtcccgg
accgcaaacaggcaacacgc
C3012F
C3012R
gggggatcc caaacaggcaacacgcgtaca
gggaagctt tcaagccgatgaccgccacca
XC3012F
XC3012R
gttacgcagtctcatcaacctg
gcgctttcccttcacttccg
C3013F
C3013R
gggtctaga cggactggagcgtgcagcatt
gggaagctt atgggcaggatgcgcacatgg
XC3013F
XC3013R
atcctgtcggtaggcgatgc
cctttgcggctggttgatgg
C3014F
C3014R
ggggaattc gatgtgttgcggcgactgctg
gggaagctt cgtcaggctcggctctgttga
XC3014F
XC3014R
cgcatcctgcccattgccgg
agctggtctggcgaaagccgc
C3015F
C3015R
ggggaattc acggcaatcgtcgacagatcg
gggaagctt ctaccatcgctgcgaagggca
XC3015F
XC3015R
cctggaaccactgggactag
cagcacggatagagacagcg
C3016F
C3016R
ggggaattc tgagcgcactgcgggtgacta
gggaagctt cgacaccttgaggcacagcaa
XC3016F
XC3016R
cgacaacagccgtgtagtgg
ttggcgtcacctgcgaaagg
C3017F
C3017R
ggggaattc gtcgcgttgctggtgtcgtgctt
gggaagctt gcatctgcgtggtggtgcgat
XC3017F
XC3017R
tccgaagccttgttgctgtgcc
agccaccaccaccaccagc
C3018F
C3018R
ggggaattc atcttctggtgctggcaccgg
gggaagctt atcgtgcgccggcatggattc
XC3018F
XC3018R
atcgcaggtagacgacagcg
gtggtgttcaatcaatagcgtg
C3019F
C3019R
ggggaattc tgccagcgtccaggaagtgct
gggaagctt tcgctcgcctgagagatcctg
XC3019F
XC3019R
tggtcaagtgtgttatcgcagc
gccgtttcagcacgaatcgc
C3020F
C3020R
aaaggatcc ccagcttaatcaggtgcgattcg
gggaagctt tcgatgatcaaggcatgctggcg
XC3020F
XC3020R
atctctcaggcgagcgactg
tgcagcgttgatgccgtcg
C3021F
C3021R
ggggaattc ccggaaatccgcacactgcat
gggggatcc ttcgcacatctgctgaacgat
XC3021F
XC3021R
cacactgccactcagacctcgg
cgcgttgtcgcctgccttgc
C3022F
C3022R
ggggaattc caggctgcgcgcaacgatttcat
gggggatcc tgtcctacagcacagcggaga
XC3022F
XC3022R
gctctgggtggaagggtttg
catcgttcaatccgagttgcg
C3023F
C3023R
gggggatcc tggaagcgaatttgtcggtg
gggaagctt gtcgtcgatcagggacacca
XC3023F
XC3023R
tggctcccagaacgaacacc
tcggcagcaccattgtcctg
216
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
1．3 hrp 基因突变体的构建
采用同框缺失突变(In frame deletion)策略，
为尽量避免突变上下游基因，引物设计原则确保仅
缺失目标 ORF内侧片段(图 1)。根据十字花科黑
腐病菌 Xcc 8004的 hrp 基因序列，设计 hrp 基因旁
侧片段引物(表 2)。PCR 分别扩增 hrp 基因 ORF
上游和下游大约 700 bp 左右长度片段，上下游片
段分别经双酶切后连接到相同酶切位点的
pK18mobsacB 载体上，三片段连接后转化 E． coli
DH5α感受态，得到的转化子经分子验证和测序无
误后，通过三亲本接合方法导入到野生型 Xcc 8004
菌株中，三亲接合子先接种于不含蔗糖的 NYG 液
体培养基中进行同源双交换，然后取少许梯度稀释
涂板于含有 10%蔗糖的 NYG 平板上，长出的单菌
落提取总 DNA 进行 PCR验证。
1．4 功能互补
分别根据 KEGG 上 Xcc 8004菌株的 hrp 基因
核苷酸序列设计引物(表 2) ，PCR扩增 hrp 基因开
放阅读框及其上游约 500 bp和下游约 100 bp左右
的 DNA 片段，经双酶切后连接至 pLAFRJ载体上，
获得重组载体。将重组子通过三亲本接合的方法
导入相应的突变体和野生型 Xcc 8004 菌株中，在
含有 Rif、Tc抗性的 NYG 平板上筛选，经 PCR 和
质粒酶切验证，分别得到各个 hrp 基因突变体的互
补菌株。
1．5 寄主植物满身红萝卜上的致病性
野生型 Xcc 8004、hrp 基因突变体菌株及互补
菌株在 NYG 液体培养基中培养至菌体浓度达到
OD600 = 1．0左右，将菌体浓度稀释到 OD600 = 0．001，
用灭菌剪刀蘸取菌液，在健康叶片距离叶尖 1 cm
处垂直于中轴叶脉剪断，在剪断过程中稍停留 5 s，
25℃ ～ 30℃保湿培养 24 h 后继续在温室 25℃ ～
30℃培养，接种后每天观察病症变化，第 10 d 用直
尺量取病斑长度。
1．6 非寄主植物辣椒 ECW-10R上的 HR定性、定
量测定
野生型 Xcc 8004、负对照菌株 ΔavrBs1、hrp 基
因突变体菌株及互补菌株在 NYG 液体培养基中
培养至菌体浓度达到 OD600 = 1．0左右，将菌体浓度
稀释到 OD600 = 0．01 后，用灭过菌的无针头注射器
将菌液注射到辣椒叶片背面的叶肉中，形成一个可
见的浸润斑，将经过接种的植株置于荧光灯下连续
照射 8 h以上，观察结果并照相;定量 HR 中则将
经过接种的植株置于荧光灯下连续照射 8 h 后分
别于 8 、12 和 24 h收集 1 cm2菌株压渗过的叶片，
每个随机取 12 张，每 4 张一组，分别置于装有 10
mL 去离子水的小白瓶中，抽真空，然后测定样品
的电导率。
1．7 hrp 基因转录和调控
野生型 Xcc 8004、hrpG 及 hrpX 的突变体
ΔhrpG、ΔhrpX 在 NYG 液体培养基中过夜培养后，
按 10%转接量转接到基本培养基 XCM1 中继续培
养 24 h，然后按照 RNAiso Plus 试剂盒(TaKaRa)
的方法提取总 RNA，再参照 Reverse Transcripase
试剂盒(TaKaRa)的方法合成 cDNA。以 cDNA 为
模版，hrp 基因 ORF 内部 150 ～ 700 bp 的片段为
PCR产物进行扩增，检测 hrpG、hrpX对其他 hrp 基
因的调控作用。
2 结果与分析
2．1 hrp 基因缺失突变体的分子构建和验证
十字花科黑腐病菌 hrp 基因簇由 25 个成簇的
基因和 2 个调控基因 hrpG、hrpX 组成。为研究
hrp 基因的功能，本研究采用同源双交换的方法获
得 hrp 基因的同框缺失突变体(图 1-A)。以
XC3007 (hrpB5)缺失突变体的构建为例，将
XC3007 基因上游 721 bp和下游 718 bp的 DNA 片
段，经 PCR扩增后融合到 pK18mobsacB 上并电转
化 至 DH5α 中， 获 得 的 重 组 质 粒
pK18mobsacB3007 三亲整合到野生型 Xcc 8004
上，在含 Rif、Kan的 NYG 平板上筛选获得单交换
子，随后在含 10%蔗糖的 Rif 平板上获得第 2 次同
源交换并缺失 ORF 的 XC3007 基因缺失突变体
DM3007。用引物对 XC3007L-F /XC3007R-R对野
生型和突变体总 DNA 进行 PCR扩增，野生型菌株
获得预期 2 141 bp 的 DNA 条带，突变体因缺失
ORF则为 1 439 bp，同时用内部引物 XC3007F /
XC3007R 进一步验证，野生型菌株获得预期 674
bp的 DNA 条带，而突变体未能扩增出条带(图 1-
B) ，表明 XC3007基因被成功敲除。
316
植物病理学报 45卷
Fig． 1 Schematic map of deletion mutants construction (A)and molecular verification
of XC3007 mutant of Xanthomonas campestris pv． campestris by PCR (B)
Lane M:100 bp DNA ladder;Lane 1，3:PCR confirmation of DM3007;Lane 2，4:PCR confirmation of Xcc 8004．
Lane 1，2:Using primer sets XC3007L-F /XC3007R-R;Lane 3，4:Using primer sets XC3007F /XC3007R．
2．2 hrp 基因决定十字花科黑腐病菌在感病植物
满身红萝卜上的致病性
以野生型 Xcc 8004 为正对照，各 hrp 基因突
变体致病性检测结果显示，XC3002 (hpa1)、
XC3014 (hpaP)和 XC3023 (hrpW)突变体丧失
40%左右的致病性，其余 hrp 基因突变体均完全丧
失致病性(图 2)。这证实 hrp 基因是 Xcc 8004 在
寄主植物上产生致病性所必需。功能互补菌株致
病力检测结果显示，XC3006 (hrcN)、XC3013
(hrcV)、XC3020 (hrpD6)和 XC3022 (hpaB)基因的
互补菌株基本能恢复野生型水平，在满身红萝卜上
形成“V”字型病斑，病斑长度与野生型基本一致。
XC3005 (hrpB7 )、 XC3009 (hrcJ )、 XC3010
(hrpB2)、XC3011 (hrpB1)、XC3012 (hrcU、XC3016
(hrcR)和 XC3023 (hrpW)的互补能部分恢复致病
性(t-检验差异显著，P = 0． 05)。而 XC3002
(hpa1)、XC3003 (hrcC)、XC3004 (hrcT)、XC3007
(hrpB5)、XC3008 (hrpB4)、XC3014 (hpaP)、
XC3015 (hrcQ)、XC3017 (hrcS)、XC3018 (hpaA)、
XC3019 (hrpD5)、XC3021 (hrpE)这 11个 hrp 基因
Fig． 2 Virulence assay on host plant Chinese radish of hrp mutants and complementation strains
Values are the mean ± standard deviation (SD)from three repeats，each with 60 leaves． The lesion lengths were measured
10 days post-inoculation． The asterisk denotes difference significantly at P= 0．05 by t-test． Data presented were from
a representative experiment and similar results were obtained in other two independent experiments．
416
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
的互补致病性几乎无任何恢复。通过细菌植株体
内生长检测，互补菌株在致病过程后期存在大量或
完全质粒丢失的现象(数据未显示)。
2．3 hrp 基因决定十字花科黑腐病菌在非寄主植
物上的 HR
以野生型 Xcc 8004 为正对照，各 hrp 基因突
变体 HR检测结果显示(图 3-A) ，XC3002 (hpa1)、
XC3014 (hpaP)和 XC3023 (hrpW)基因突变体在
非寄主辣椒 ECW-10R 上的过敏反应显著减弱，其
余 hrp 基因突变体均丧失产生 HR 的能力，表明
hrp 基因是 Xcc 8004 在非寄主植物辣椒 ECW-10R
上引起 HR所不能缺少的。功能互补试验可知(图
3-A) ，除 XC3004 (hrcT)、XC3007 (hrpB5)、XC3008
(hrpB4)、XC3015 (hrcQ)和 XC3017 (hrcS)基因的
互补菌株不能恢复在辣椒 ECW-10R上产生 HR的
能力外，其余突变体互补子均能恢复在非寄主植物
上激发 HR的能力。HR 定量测定试验表明(图 3-
B、图 3-C) ，hpa1、hpaP 和 hrpW 基因缺失后病菌
在非寄主植物辣椒 ECW-10R上出现 HR延迟的现
象，与野生型菌株相比，突变体产生 HR 的时间延
迟 3～4 h。
2．4 hrp 基因转录表达受 hrpG和 hrpX 调控
Xcc 8004的 hrp 基因簇至少由 10 个操纵子组
成:hpa2、hpa1、hrcC、hrpB族(hrpB1-hrpB8 8 个基
因)、hrpC 族(hrcU、hrcV、hpaP 3 个基因)、hrpD
族(hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6 6 个
基因)、hrpE 族(hrpE、hpaB 2 个基因)、hrpW、
XC3024和 hrpF。为了研究 hrpX 和 hrpG 对每个
hrp 基因的转录调控情况，通过 RT-PCR 检测了
Xcc 8004、ΔhrpX 及 ΔhrpG 在 XCM1 中诱导培养
后 hrp 基因的转录水平。RT-PCR 结果表明，所有
hrp 基因的转录水平都明显受到hrpG和 hrpX正
Fig． 3 The qualitative (A)and quantitative (B，C)assay of hypersensitive response induction
of hrp gene mutants and complementation strains in pepper ECW-10R
The photographs of the qualitative HR were taken 24 h post-inoculation． Data of conductivity for quantitative
HR assay were from a representative experiment and similar results were obtained in other two independent experiments．
516
植物病理学报 45卷
Fig． 4 Transcription profiles of hrp genes in Xcc 8004，ΔhrpX and ΔhrpG revealed by RT-PCR
调控，即在 hrpX、hrpG 突变体中所有 hrp 基因的转
录都显著降低(图 4)。但同一操纵元各 hrp 基因
受 hrpG 和 hrpX调控的程度仍有差异。比如 hrpB
族中的 hrcT、hrcN、hrpB4 和 hrpD 族中的 hrcQ、
hrcR、hrcS、hrpD5 在 hrpX 突变体中的表达比在
hrpG突变体中显著降低，即在 hrpX 突变后几乎检
测不到转录，但在 hrpG 突变体中仍有微量表达。
除此之外，hpa1、hpaB、hrpW、hrpF亦如此。值得一
提的是，hrcT、hrpB1、hrpE、hpaB 在 hrpX、hrpG 突
变体中仍有较高表达。hrpD6 在 hrpX 突变后表达
虽降低，但仍有较高表达，而在 hrpG 突变体中则
几乎检测不到转录，这与 q-RT 的结果一致(数据
未显示)。
3 讨论
植物病原细菌 T3SS 系统由 hrp 基因编码，hrp
基因决定革兰氏阴性植物病原细菌在抗性寄主或
非寄主植物上激发过敏反应的能力以及在寄主植
物上的基本寄生性或致病性［1～4］。在革兰氏阴性
病原菌中的众多蛋白分泌系统中，III 型分泌系统
在寄主和病原微生物的相互作用中起到非常关键
的作用，是病原菌的决定性致病因子［23］。由 hrp
基因簇编码的十字花科黑腐病菌 T3SS 同样高度
保守。据报道 Xcc 8004 hpa2和 hpa4与致病无关，
HrpG 和 HrpX 是 hrp 基因的关键调控蛋白，HpaB
和 HrpF控制着 T3SEs的转运［14～18］，而其他 hrp 基
因功能研究未见报道。
本研究系统检测了 Xcc 8004 中各 hrp 基因对
致病性和过敏反应的贡献。发现检测的所有基因
都与 Xcc 8004 致病性和过敏反应相关，说明除
hpa2和 hpa4外［17，18］，hrp 基因对 Xcc 在寄主植物
上引起病害和在非寄主上激发 HR 不能或缺(图
2)。对致病相关的 hrp 基因进行深入研究，尤其是
对那些在别的病原细菌中功能亦未知的 hrp 基因
(如 hrpB7、hrpB1、hrpD5 等)进一步分析，对揭示
十字花科黑腐病菌的致病机理具有重要意义。
Zhang 等［24］在水稻白叶枯病菌(Xanthomonas
oryzae pv． oryzae，Xoo)中反式互补非极性 hrcQ
Tn5突变体存在无法回复现象。本研究功能互补
结果显示，大多数 hrp 基因突变体的反式功能互补
较为困难，尤其是致病性更难回复(图 2、图 3-A)。
细菌植株体内生长检测显示，互补株普遍存在质粒
丢失现象，这可能是不能互补恢复的原因之一。其
次，由于许多 hrp 基因以操纵元形式存在，自身无
启动子，或启动子位于上游 ORF内，尽管采用同框
缺失突变策略，某 hrp 基因的缺失突变仍然可能会
造成同一操纵元下游基因启动子的缺失或残缺，从
而造成无法互补恢复。hrpB 操纵元由 8 个基因组
成(XC3004-XC3011，hrpB1-hrpB8) ，通过 q-RT 随
机检测了 hrpB1缺失突变体中 hrpB4的表达，发现
其表达确实显著降低(数据未显示)。另外，有些
hrp 基因可能还具有调控功能。Li 等［25］在水稻细
菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv． oryzicola，
Xoc)中发现 HrpD6 具有调控功能。Liu 等［26］发
现 Xoc HrcT 同样具有调控功能。本研究互补策略
采用的载体 pLAFRJ含组成型表达 Plac启动子，可
能会影响类似 hrcT 等调控基因的转录强度，这也
可能是不能互补恢复的原因之一。
转录分析显示 Xcc 8004 hrp 基因簇中所有 hrp
的转录都受到 hrpG 和 hrpX基因的正向调控，但在
hrpX、hrpG 突变体中不同 hrp 基因的表达降低程
616
6期 曾献莹，等:十字花科黑腐病菌 hrp 基因致病功能分析
度不尽相同(图 4)。令人感兴趣的是，hrpD 操纵
元由 hrcQ、hrcR、hrcS、hpaA、hrpD5、hrpD6 这 6 个
基因组成，却表现出 3 种转录表型，hrcQ、hrcR、
hrcS、hrpD5 在 hrpG 突变体中仍有较低表达，而
hpaA 则检测不到表达，同时，这 5 个基因在 hrpX
突变体中基本不表达，但 hrpD6 却有明显表达(图
4) ，说明 hrp 基因调控具有一定的复杂性。Weber
等认为辣椒斑点病菌(Xanthomonas campestris pv．
vesicatoria，Xcv)hrpD 操纵元由 hrcQ、hrcR、hrcS、
hpaA 组成，而 hrpD5、hrpD6 与 hrpE 组成 hrpE 操
纵元［27］。另外，hrpB 操纵元由 hrpB8 等 8 个基因
组成，也表现出不同的转录表型(图 4)。Xcc 8004
hrp 基因簇究竟有几个操纵元组成还需进一步研
究。另外，hrcT、hrpB1、hrpE、hrpD6 及 hpaB 在
hrpX、hrpG 突变体中仍有较高表达，推测这些基因
另有不受 hrpX、hrpG 调控的启动子存在。Liu 等
报道 Xoc hrcT具有 P1和 P3 2个启动子［26］，Xcv 的
hrpE尽管也受 hrpX、hrpG 调控，但仍能组成型表
达［10］。因此，Xcc 8004 hrp 基因簇中单个 hrp 基因
究竟有无独立启动子仍需进一步研究。
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责任编辑:于金枝
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