全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 46(2):258-264(2016)
收稿日期:2015-06-06;修回日期:2015-11-14
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31260443) ;广西创新研究团队资助项目(2014GXNSFFA118005) ;广西自然科学基金资助项目
(2013GXNSFAA019097;2013GXNSFBA019088)
通讯作者:姜伯乐，研究员，主要从事植物病原物分子相互作用研究;Tel:0771-3239255，E-mail:jbl1971@ gxu． edu． cn
第一作者:王 凛，男，河南南阳人，博士研究生，主要从事微生物学研究;E-mail:wl9700@ 163． com。
doi:10． 13926 / j． cnki． apps． 2016． 02． 014
十字花科黑腐病菌中一个假定
蛋白基因 XC_3605 与致病相关
王 凛1，2，徐 勇1，韦载娲1，阳丽艳1，杨丽超1，姜伯乐1，3*
(1广西大学生命科学与技术学院，南宁530004;2桂林医学院，桂林541004;3亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530004)
摘要:十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv． campestris，Xcc)是全球范围内能引起十字花科植物黑腐病的
重要植物病原细菌，也是研究植物病原细菌与植物互作机制的模式细菌。利用自杀质粒 pK18mobsacB 诱变十字花
科黑腐病菌 Xcc 8004 的 XC_3605 基因，获得缺失突变体 D3605。表型分析发现 D3605 胞外多糖合成能力、游动能力
及致病力显著降低，积聚形成生物被膜的能力增强。用带有全长 XC_3605 基因序列的 pLAFＲJ 对 D3605 进行功能
互补，其胞外多糖产量、游动性、致病力和生物被膜均得到恢复。研究结果表明，XC_3605 基因在十字花科黑腐病菌
致病过程中发挥作用。
关键词:十字花科黑腐病菌;胞外多糖;游动性;致病性;生物被膜
A hypothetical gene XC_3605 contributes to pathogenicity of Xanthomonas campes-
tris pv． campestris WANG Lin1，2，XU Yong1，WEI Zai-wa1，YANG Li-yan1，YANG Li-chao1，
JIANG Bo-le1，3 (1 College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China;2 College of Bio-
technology，Guilin Medical University，Guilin 541004，China;3 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Sub-
tropical Agro-bioresources，Nanning 530004，China)
Abstract:Xanthomonas campestris pv． campestris (Xcc)causes black rot on cruciferous plants and is one of
the model bacteria for studying the plant-microbial interaction． The XC_3605 gene of Xcc was deleted by using
a suicide plasmid pK18mobsacB to generate the mutant D3605． The exopolysaccharide production，mobility
and virulence on the host plant were decreased in mutant D3605，while biofilm formation was stimulated． The
altered phenotypes of the mutant could be restored by the intact XC_3605 gene carried in pLAFＲJ． These re-
sults indicated that XC_3605 gene plays an important role in the pathogenicity of Xcc ．
Key words:Xanthomonas campestris pv． campestris;exopolysaccharide;mobility;pathogenicity;biofilm
中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2016)02-0258-07
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris
pv． campestris，简称 Xcc)是一种革兰氏阴性植物
病原细菌，能在全球范围内引起十字花科植物黑腐
病［1］。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔或伤
口侵入植物体内，引起病害［2］。病原菌对寄主植
物的致病涉及接触、识别、侵染、繁殖、扩展、症状显
示等过程，需要病原菌多个致病因子如效应物、毒
素、胞外蛋白、胞外多糖、胞外酶等的协同作用。
Xcc 注释预测的与致病性相关的基因约 300 个，分
为 5 大类:过敏反应与致病性类、胞外水解酶类、多
2 期 王 凛，等:十字花科黑腐病菌中一个假定蛋白基因 XC_3605 与致病相关
糖类、解毒与逆境适应类、毒素类［3］。
很多植物病原细菌粘附聚集于寄主植物表面、
根部或维管束中，分泌大量多糖、蛋白等多聚物质，
将自身包裹其中而形成复杂的生物被膜结构。生
物被膜使这些细菌对抗生素、恶劣环境及宿主免疫
防御机制有很强的抗性，并能增强对不良环境的抵
抗能力［4］。胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是
许多植物病原菌重要的致病因子，也是生物被膜的
主要组成部分。
EPS 有利于病原菌吸附和吸收营养，抵御干燥
环境，也有助于菌体抵抗寄主细胞产生的抗菌物质
或氧化剂的攻击。研究发现黄单胞菌 Xcc 中 gum
基因簇的 16 个基因是 EPS 合成、组装、分泌的关
键基因［3］，多数 EPS 突变体致病力下降或丧失。
在 Xcc 中 EPS 合成相关基因受到群体感应系统 rpf
基因簇、全局调控蛋白 Clp的调控［5］。研究还发现
锌吸收调控蛋白 Zur 可能参与了 EPS 产生的调
控［6］。Dow 等［7］报道 Xcc 胞外酶能诱导聚集细菌
的分散。分散因子是一个内切-β-(1，4)-甘露聚糖
酶(ManA) ，与生物被膜的形成相关。
本研究利用自杀质粒 pK18mobsacB 对十字花
科黑腐病菌 Xcc 8004 中一个位于脂多糖(lipopo-
lysaccharide，LPS)合成基因簇内的假定蛋白基因
XC_3605 进行了缺失突变，并对突变体的致病性、
胞外多糖、生物被膜和游动性等生物学表型进行了
研究，以期为阐明十字花科黑腐病菌 Xcc 8004 菌
株的致病机理提供依据。
1 材料与方法
1． 1 菌株、质粒及培养条件
所用菌株、质粒见表 1。十字花科黑腐病菌在
NYG 培养基中 28℃培养。大肠杆菌(Escherichia
coli)在 LB 培养基中 37℃培养。添加的抗生素终
浓度参阅文献［8］。
1． 2 方法
1． 2． 1 遗传操作 细菌总 DNA 的提取、质粒
DNA 的碱裂解法提取、限制性内切酶的酶切以及
连接均按照 Sambrook 等［12］的方法和试剂盒提供
的方法操作，三亲本接合操作参考文献［13］。Taq
DNA 聚合酶购自 TaKaＲa 公司(中国大连) ，T4
DNA 连接酶、限制性内切酶购自 Promega公司(中
国上海) ，PCＲ 产物纯化、质粒纯化试剂盒和 DNA
片段凝胶回收试剂盒均购自博日公司(中国杭
州)。所用引物(表 2)利用软件 NTI Vector 10 设
计，由华大基因(中国北京)和英潍捷基(中国上
海)合成。DNA 测序由华大基因(中国深圳)和英
潍捷基(中国广州)完成。
Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this work
Strains and plasmids Ｒelevant characteristics Source or reference
Xcc strains
Xcc 8004 Wild type，Ｒif r ［9］
D3605 Deletion mutant of XC_3605，Ｒif r This work
C3605 D3605 harboring plasmid pLJ3605，Ｒif r，Tcr This work
Plasmids
pLAFＲJ Shuttle plasmid，Tcr ［10］
pK18mobsacB Suicide plasmid in Xcc，Tra-，Mob +，Kanr ［11］
pK3605 pK18mobsacB harboring 700 bp upstream and 700 bp downstream
fragments of XC_3605，Kanr
This work
pLJ3605 pLAFＲJ harboring entire XC_3605 gene，Tcr This work
Ｒif r，Tcr and Kanr indicate resistance to rifampicin，tetracycline and kanamycin，respectively．
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植物病理学报 46 卷
Table 2 Primers used in this work
Primer Sequence (5＇ to 3＇)
D3605LF AAAGGATCCCGGTGCATCTGCAGGTGCTT
D3605LＲ GGGTCTAGAGCATGACATCAGGAGTGCGA
D3605ＲF AAATCTAGAGCCTTGACGGCGCCCTGCGAA
D3605ＲＲ GGGAAGCTTCCGTGCGCCAGGGAGACAAG
C3605F AAAGAATTCATCATCACCTGGGTCACCCC
C3605Ｒ CCCAAGCTTGTTGCGTTCGTTGTACAAAC
1． 2． 2 缺失突变体和互补菌株的构建 根据 Xcc
8004 菌株 XC_3605 基因编码框序列，分别 PCＲ 扩
增其旁侧片段(约 700 bp) ，通过限制性酶切位点
BamH I /Xba I /Hind III连接到 pK18mobsacB 质粒
上，电转化至 E． coli DH5α 感受态细胞中，PCＲ 和
酶切初步筛选阳性克隆子。挑选的阳性克隆外源
DNA 经测序验证正确后，通过三亲本接合试验导
入 Xcc 8004 中，在含有 Ｒif + 10%蔗糖的 NYG 平
板上筛选阳性接合子，提取总 DNA 利用上下游引
物和互补引物进行交叉验证，筛选出 XC_3605 基
因的缺失突变菌株 D3605。
根据 XC _3605 上下游序列分别设计引物
C3605F和 C3605Ｒ，包含 XC_3605 上游启动子区
和完整 OＲF序列，以 Xcc 8004 总 DNA 为模板，扩
增片段连接到 pK18mobsacB 质粒上，经测序证明
构建正确后，酶切重组质粒并胶回收目的片段，然
后同框连接到质粒 pLAFＲJ 上。重组质粒经电脉
冲转化大肠杆菌感受态细胞，在含有 Tc 的 LB 平
板上筛选，酶切鉴定正确的重组质粒命名为
pLJ3605。通过三亲接合，将 pLJ3605 从大肠杆菌
导入 XC_3605 缺失突变体 D3605 中，构建互补菌
株 C3605。
1． 2． 3 致病性检测 按照文献［13］采用剪叶法鉴
定 Xcc 各菌株的致病性。供试植物材料为中国成
都满身红萝卜苗(Ｒaphanus sativus L． var． radicu-
lus Pers)。栽培于营养杯的四叶期萝卜苗，以第 3
张叶片试验。将过夜培养的 Xcc 菌液稀释到 106
CFU /mL，用灭菌的手术剪蘸取菌液，在垂直于中
脉、距叶尖约 1 cm 处剪叶接种，在 100%相对湿度
条件下保湿 24 h，然后在温度为 28℃、相对湿度为
80%、光照为 6 000 lx、12 h /12 h(昼 /夜)照射的环
境中继续培养，每天观察植株病症变化。接种 10 d
后量取叶片病斑长度，每菌株 3 个重复，每个重复
30 张叶片。
1． 2． 4 过敏反应检测 将辣椒(Capsicum annuum
cv． ECW-10Ｒ)［14］栽种于室外约 3 个月至成株期
后，选取 6 ～ 8 叶龄的全展叶片供试;接种供试的
Xcc 菌株至加有相应抗生素的 NYG 过夜培养至
OD600 = 1． 0 以上;收集 1 mL 的菌液，用 1 mL 无菌
水清洗并重悬;调菌液浓度至 107 CFU /mL，用无针
头的针筒吸取 10 μL 菌液压渗到辣椒叶片背面的
叶肉中，形成一个可见的浸润斑;接种后保持相对
湿度 80%并置荧光灯下按 16 h /8 h(昼 /夜)照射，
24 h后观察结果并照相。
1． 2． 5 生物被膜检测 将 Xcc 接种到 10 mL 的
NYG，28℃ 200 rpm 摇床培养过夜后，调节培养物
浓度至 109 CFU /mL，按 1%的接种量转接至 10 mL
LB 液体培养基的指形瓶中，28℃静置培养 4 d，直
接观察拍照;然后将瓶中培养基轻轻移除，用无菌
水轻轻洗涤 3 次;加入 10 mL 0． 1%的结晶紫染色
15 min，轻轻将结晶紫移除，用无菌水轻轻洗涤 3
次;加入 10 mL 无水乙醇脱色 30 min，然后吸取 2
mL 测 OD630，根据 OD630的值判断细菌细胞的生物
被膜形成情况。试验重复 3 次。
1． 2． 6 胞外多糖的检测
(1)EPS 产量定性分析［7］将 Xcc 接种到 10 mL
的 NYG，28℃摇床培养过夜后，调节培养物浓度至
108 CFU /mL，用移液器精确取 2 μL 培养物，分别
接种于含 2% 葡萄糖的 NYG 平板，将平板置于
28℃培养箱培养 3 d，通过比较菌落的形态大小，对
EPS 产量作定性比较。
(2)EPS 产量定量分析［7］将 Xcc 的过夜培养物
以 1%的接种量接种至含 2%葡萄糖的 100 mL NYG
培养基，28℃摇床培养 3 d，将全部培养物离心弃掉
菌体，将上清液缓慢注入到 3 倍体积的无水乙醇中，
边注入边搅拌，然后将絮状沉淀物取出后干燥，称
062
2 期 王 凛，等:十字花科黑腐病菌中一个假定蛋白基因 XC_3605 与致病相关
重，换算成单位体积 EPS 的产量进行菌株间比较。
1． 2． 7 游动性检测 接种 Xcc 8004、D3605、C3605
于 5 mL NYG 培养基，加适量抗生素，28℃ 200 rpm
培养 16 ～18 h，调节菌液浓度至 108 CFU /mL，用微
量移液器取 1 μL 点于含 0． 3%琼脂的 NYG 游动测
试平板上，正向放置培养 5 d后观测结果并拍照［15］。
1． 2． 8 生物信息学分析 运用 SMAＲT 软件(ht-
tp:/ / smart． embl-heidelberg． de /)在线预测 XC _
3605 编码蛋白的功能域。
2 结果与分析
2． 1 构建 XC_3605 缺失突变体和互补菌株
以 Xcc 8004 总 DNA 为模板，以 D3605LF /
D3605LＲ 和 D3605ＲF /D3605ＲＲ 为引物，PCＲ 反
应扩增 XC_3605 基因左右两侧 DNA 片段，PCＲ产
物长度分别为 722 bp 和 718 bp。将纯化后的 PCＲ
产物依次克隆到 BamH I /Xba I /Hind III 消化后的
自杀 质 粒 pK18mobsacB 上，获 得 重 组 质 粒
pK3605，PCＲ 及酶切验证正确后送公司测序。测
序结果显示，pK3605 克隆的 XC_3605 基因左右两
侧 DNA 片段完全正确(结果未显示)。通过三亲
接合将 pK3605 导入十字花科黑腐病菌 Xcc 8004
菌株，用含有 Ｒif + 10%蔗糖的 NYG 培养基筛选三
亲接合子，再通过 Ｒif /Ｒif + Kan平行点板排除发生
回复突变的接合子，对三亲接合子进行两侧引物和
互补引物的交叉 PCＲ 验证，均获得预期大小的
DNA 条带(结果未显示)。证明 XC_3605 基因已
缺失，任选其中一个突变体，命名为 D3605。
以 Xcc 8 0 0 4总DNA为模板，以 C 3 6 0 5 F /
C3605Ｒ为引物，PCＲ反应扩增 XC_3605 基因全长
DNA 片段，PCＲ 产物大小为 2 218 bp。将纯化后
的 PCＲ产物经 EcoＲ I /Hind III 双酶切后克隆到
pK18mobsacB 载体上，测序结果完全正确(结果未
显示)。酶切测序正确的目的片段连接到穿梭质粒
pLAFＲJ上，获得重组质粒 pLJ3605，酶切和 PCＲ验
证结果均正确。将重组质粒 pLJ3605 通过三亲接
合导入 XC_3605 基因缺失突变体 D3605，在丰富培
养基上以 Ｒif + Tc筛选三亲接合子。提取三亲接
合子质粒 DNA，用 EcoＲ I /Hind III双酶切验证，获
得 XC_3605 缺失突变体互补菌株 C3605。
2． 2 XC_3605 基因不影响细胞的生长
为了解 XC_3605 基因功能的缺失对细胞生长
繁殖的影响，以 Xcc 8004 作对照，对突变体 D3605
和互补菌株 C3605 在丰富培养基 NYG 和基本培
养基 MMX 的生长繁殖进行测定并绘制生长曲线。
突变体 D3605 和互补菌株 C3605 的生长曲线与野
生型菌株 Xcc 8004 基本相同(结果未显示)。这表
明 XC_3605 基因功能的丧失并没有影响细胞在丰
富培养基和基本培养基的正常生长繁殖。
2． 3 XC_3605 影响致病性但不影响过敏反应
以 Xcc 8004为正对照，对突变体 D3605 和互补
菌株 C3605进行致病性检测。对照菌株 Xcc 8004平
均病斑长度为 12． 41 mm，突变体 D3605的平均病斑
长度为 8． 01 mm，互补菌株 C3605 的平均病斑长度
为 12． 01 mm，统计分析表明，突变体和野生型菌株
具有极显著差异(t-test，P ＜ 0． 01) ，表明 XC_3605
突变对 Xcc 8004的致病力有明显影响(图 1)。
Fig． 1 The virulence of the XC_3605 mutant and its complemented strain on Chinese radish
A:Examination of virulence on Chinese radish;B:The lesion length assay．
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进行过敏反应检测，结果显示 Xcc 8004、突变
体 D3605 和互补菌株 C3605 同时出现枯斑，表明
XC_3605 突变不影响 Xcc 8004 在辣椒 ECW-10Ｒ
上的过敏反应(结果未显示)。
2． 4 XC_3605 基因缺失影响 EPS产量
将 Xcc 8004、突变体 D3605 和互补菌株 C3605
接种在含 2%葡萄糖的 NYG 培养基平板，定性比
较 EPS 产量。将平板在 28℃培养箱培养 3 d，观察
比较菌落大小形态(图 2-A)。D3605 形成的菌落
较小，而 Xcc 8004 和 C3605 形成的菌落大小形态
基本一样，均较大较粘稠，这表明 XC_3605 突变体
与野生型菌株相比，EPS 产量降低，并且 XC_3605
基因能反式互补该突变体，恢复 EPS 的产量。
平板检测表明 XC_3605 突变体 EPS 产量比野
生型菌株 Xcc 8004 降低，为了解 XC_3605 突变体
EPS 减少的程度，采用液体培养基培养菌体，用乙
醇沉淀法定量提取 EPS，检测突变体 EPS 的产量。
将 Xcc8004、D3605、C3605 菌株分别从 NYG 平板
接种到 10 mL 的 NYG 液体培养基过夜培养，再将
过夜培养物以 1%的接种量接种至含有 2%葡萄糖
的 NYG 培养基中，28℃摇床培养 4 d，分别测定这
3株菌株的胞外多糖(图2-B)。菌株在NYG培养
Fig． 2 XC_3605 is involved in EPS production
A:Examination of EPS production on plate;B:Assay on EPS yield．
基培养 4 d后，Xcc 8004培养液中 EPS 产量为 1 084
mg /100 mL，D3605 培养液中 EPS 产量约为 785
mg /100 mL，C3605则约达到 950 mg /100 mL，突变
体和野生型菌株 EPS 产量有显著差异(t-test，P ＜
0． 05)，表明XC_3605突变影响Xcc 8004的EPS 产量。
2． 5 XC_3605 基因影响生物被膜形成
Xcc 8004、突变体 D3605 和互补菌株 C3605 加
有适当浓度抗生素的 NYG 培养基培养 16 ～ 18 h，
将各菌株的浓度调节至 109 CFU /mL，按 1%的接
种量转接至含有 10 mL LB 培养基的指形瓶中，静
置培养 4 d，直接观察生物被膜形成情况，结果如图
3-A 所示。将瓶中培养基轻轻移除，用无菌水轻轻
洗涤 3 次;加入 10 mL，0． 1% 的结晶紫染色 15
min，轻轻将结晶紫移除，用无菌水轻轻洗涤 3 次;
加入 10 mL 无水乙醇脱色 30 min，吸取 2 mL 测
OD630。以 OD630的值为纵坐标作图，结果如图 3-B 所
示。统计学分析表明，XC_3605 基因缺失突变体的
OD630 值明显高于野生型菌株Xcc8004(t-test，
Fig． 3 XC_3605 represses biofilm formation
and cell adhesion in strain Xcc 8004
A:Examination of biofilm;B:Assay on cell adhesion．
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2 期 王 凛，等:十字花科黑腐病菌中一个假定蛋白基因 XC_3605 与致病相关
P ＜0． 01)，说明突变体 D3605生物被膜形成能力比野
生型菌株强，互补菌株基本可以恢复这一表型。结果
说明，XC_3605基因抑制了 Xcc 生物被膜的形成。
2． 6 XC_3605 基因缺失影响菌体游动性
接种 Xcc 8004、突变体 D3605 和互补菌株
C3605 到 5 mL NYG 培养基中，加适量抗生素，
28℃ 200 rpm 培养 16 ～ 18 h，调节菌体浓度至
108 CFU /mL，用微量移液器取 1 μL 点于含 0． 3%
琼脂的 NYG 游动测试平板上，正向放置培养 5 d
后观测结果并拍照(图 4)。Xcc 8004 和 C3605 菌
落大小基本一致，而 D3605 的菌落明显小于野生
型和互补菌株。由于 XC_3605 基因突变并不影响
菌体在培养基上的生长，这表明 XC_3605 显著影
响 Xcc 8004 的游动性。
Fig． 4 Motility examination of strain Xcc 8004
and its XC_3605 mutant
3 讨论
XC_3605 基因位于脂多糖(lipopolysaccharide，
LPS)合成基因簇内(XC_3605 至 XC_3634) ，注释
为假定蛋白基因［3，16］。生物信息学分析表明 XC_
3605 含有 Glyco _tran_WbsX 和 ＲgpF (rhamnose-
glucose polysaccharide assembly protein)功能域，
Glyco_tran_WbsX 功能与 LPS O-antigen 的组装相
关，ＲgpF可能编码鼠李糖-葡萄糖多糖组装蛋白，
与 LPS 合成相关［16，17］。本研究构建了 XC _3605
基因的缺失突变体，通过对比 Xcc 8004、D3605 和
C3605 菌株的 LPS 带型，未发现 XC_3605 基因与
LPS 的 O-抗原合成有关(数据未显示)。
EPS 是黄单胞菌产生的另一类细菌多糖。黄
单胞菌属 EPS 结构(由 D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡
萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸组成的“五糖重复单元”
结构聚合体)、生物合成的代谢途径及主要基因已
有报道［18 ～ 20］，但在黄单胞菌中鼠李糖是否参与
EPS 合成还未见报道，而 Kavita 等［21］报道弧菌
(Vibrio)EPS 结构组分含有鼠李糖。XC_3605 基
因突变导致 Xcc 产生 EPS 的能力下降，其机制有
待进一步研究。XC_3605 基因突变后形成生物被
膜的能力显著提高，而 EPS 是生物被膜的重要组
成部分，暗示 XC_3605 可能通过 EPS 影响生物被
膜形成。
XC_3605 基因突变体产生胞外水解酶类的能
力不变(数据未显示) ，表明 XC_3605 基因与 II 型
分泌途径以及胞外酶类等致病因子无关。XC _
3605 突变体仍能激发非寄主植物产生 HＲ，与野生
型菌株基本一致，提示 XC_3605 对病原菌的 III 型
分泌系统没有显著影响。与野生型菌株 Xcc 8004
相比，D3605 游动能力明显下降。细菌的鞭毛装
置、游动能量的供应、脂多糖等因素都会影响细菌
的游动能力。游动能力的下降可能也是导致 XC_
3605 突变体致病力下降的原因之一。本研究证明
Xcc LPS 基因簇中 XC_3605 基因参与胞外多糖的
合成、影响生物被膜和游动性，并在十字花科黑腐
病菌致病方面发挥作用。
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责任编辑:于金枝
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