全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 46(1):27-36(2016)
收稿日期:2014-12-06;修回日期:2015-11-14
基金项目:国家“973”计划项目(2011CB100701) ;公益性行业(农业)科研专项(201303015)
通讯作者:何勇强，教授，主要从事分子植物病理学研究;Tel:+86-0771-3237896，E-mail:yqhe@ gxu．edu．cn
第一作者:刘国芳，女，山西人，博士研究生，主要从事分子植物病理学研究;E-mail:lgf8411@ 126．com。
doi:10．13926 / j．cnki．apps．2016．01．004
十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 spoTXcc对
T3SS基因调控作用的分析
刘国芳1，苏辉昭2，刘 伟3，牛祥娜2，玉延华2，姜 伟2，何勇强1，2*
(1广西大学农学院，南宁 530004 ;2广西大学生命科学与技术学院，南宁 530004;
3通化师范学院生命科学学院，通化 134002)
摘要:通过反向遗传学方法和半定量 ＲT-PCＲ 方法，研究了十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因 spoTXcc与 III
型分泌系统(T3SS)基因的调控关系。基于自杀质粒 pK18mob 同源整合方法构建了十字花科黑腐病菌 spoTXcc基因
(XC_0956)的非极性整合突变体，检测了突变体的多种表型，发现 spoTXcc突变体延迟了在非寄主植物辣椒 ECW-10Ｒ 上引
发的过敏反应(HＲ)。利用 GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测、原位组织染色和半定量 ＲT-PCＲ 的方法，发现 T3SS 相关基因
在 spoTXcc基因的非极性整合突变体中表达量降低，表明十字花科黑腐病菌中被注释的应急反应相关基因 spoTXcc显著正调
控 T3SS 相关基因的表达。
关键词:十字花科黑腐病菌;spoTXcc基因;过敏反应(HＲ) ;T3SS;调控
Analysis of regulatory relationship between stringent response related gene spoTXcc
and T3SS genes in Xanthomonas campestris pv． campestris LIU Guo-fang1，SU
Hui-zhao2，LIU Wei3，NIU Xiang-na2，YU Yan-hua2，JIANG Wei2，HE Yong-qiang1，2 (1 College of
Agronomy，Guangxi University，Nanning 530004，China;2College of Life Science and Technology，Guangxi University，
Nanning 530004，China;3College of Life Science，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China)
Abstract:The regulatory relationship between the stringent response related gene spoTXcc and type III secretion
system (T3SS)related genes in the bacterial phytopathogen Xanthomonas campestris pv． campestris was investi-
gated by using reversed genetics method and semi-quantitative ＲT-PCＲ． A non-polar mutant of spoTXcc(XC_
0956)was generated by suicide plasmid pK18mob mediated homologous integration and various phenotypes of
the mutant were studied． It was found that the spoTXcc mutant delayed the induction of hypersensitive response on
the non-host plant pepper ECW-10Ｒ． The expression of T3SS genes were down-regulated in spoTXcc gene mutant
detected by GUS activity tests，semi-quantitative ＲT-PCＲ and staining of tissue methods，indicating that the
stringent response related gene spoTXcc positively regulated the T3SS related genes in X． campestris pv． campestris．
Key words:Xanthomonas campestris pv． campestris;spoTXcc gene;hypersensitive response (HＲ) ;T3SS;
regulation
中图分类号:S435． 111． 47 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2016)01-0027-10
细菌经常面临各种极端环境，营养物质对细菌
的生长和生存就是一个主要的环境因子，而为了适
应营养物质匮乏的环境，细菌在长期的进化过程中
形成了复杂的调控机制。在营养物质匮乏的环境
植物病理学报 46卷
中，细菌会快速调节细胞生理生化的改变，如激活
或者抑制基因的表达、蛋白的翻译和一些酶的酶活
力，这个调控过程被称为应急反应［1］。细菌的应
急反应是由胞内 2 个信号分子 ppGpp 和 pppGpp
引起的，通常统称为(p)ppGpp［2］。(p)ppGpp 在
应急反应中与细菌的多种生理变化相关，包括
DNA 的转录、复制、蛋白质的翻译、病原菌的致病
力、细菌的繁殖以及潜伏等［3］。革兰氏阴性细菌
中(p)ppGpp是由 ＲelA(relaxed)和 SpoT 2个酶合
成的，ＲelA 在氨基酸饥饿时合成(p)ppGpp，而
SpoT 是一个双功能酶，它具有较强的(p)ppGpp
水解酶活性和较弱的(p)ppGpp 合成酶活性，SpoT
在碳源、磷酸、铁离子［4～6］或者脂肪酸［7］缺乏的环
境中可以合成应急因子(p)ppGpp。
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris
pv ． campestris，Xcc)能够在世界范围内引起十字
花科植物的黑腐病［8］，是研究病原菌与植物互作
机理的模式微生物之一。目前已完成多个 Xcc 菌
株的全基因组序列测定，许多与致病相关的基因得
到鉴定［9～11］。T3SS 是 Xcc 的一个重要致病系统，
由 hrp /hrc 基因簇的基因编码［12～14］，能将效应物蛋
白转运至植物细胞内。效应物蛋白具有双重功能，
在没有相应的抗病基因的寄主植物上，效应物蛋白
是致病因子;在有相对应的 Ｒ 基因的寄主植物上，
效应物蛋白(如，Avr 蛋白)表现为无毒活性，其被
Ｒ基因识别后，引起寄主植物细胞的程序性死亡，
表现为寄主的 HＲ 反应，也是植物的一种“免疫反
应”［15～17］。
通过生物信息学分析及同源序列比对，发现十
字花科黑腐病菌 Xcc 8004 菌株全基因组中存在
spoT同源基因，本文称之为 spoTXcc，基因 ID 为 XC
_0956。试验发现 Xcc 8004 中的 spoTXcc基因突变
后，延迟了该菌在非寄主植物辣椒 ECW-10Ｒ 上引
发的 HＲ反应，推断 spoTXcc基因可能与 T3SS 相关
基因存在调控关系。经过 GUS 活性检测、原位组
织染色和半定量 ＲT-PCＲ的方法，发现在基本培养
基 MMX 和植物体内，T3SS 相关基因 hrp 基因在
spoTXcc基因非极性整合突变体中的表达量降低。
这是十字花科黑腐病菌中首次关于应急反应相关
基因 spoTXcc正调控 T3SS 相关基因 hrp 基因表达
的报道。
1 材料与方法
1．1 菌株、质粒和培养条件
所用的菌株、质粒见表 1。大肠杆菌在 LB 培
养基中培养［18］，培养温度是 37℃。十字花科黑腐
病菌在 NYGB 培养基［19］(5．0 g /L 多聚蛋白胨、
3．0 g /L 酵母提取物、20．0 g /L 甘油)和 MMX 培养
基［20］(2．0 g /L (NH4)2 SO4、4．0 g /L K2HPO4、6．0
g /L KH2PO4、0．2 g /L MgSO4·7H2O、1．0 g /L 柠
檬酸三钠、5． 0 g /L 葡萄糖)中培养，培养温度为
28℃。LA 培养基为 LB 培养基添加 1%(W /V)琼
脂的固体培养基，NYGA 为 NYGB 培养基添加 1%
(W /V)琼脂的固体培养基。抗生素的用量为:大
肠杆菌和十字花科黑腐病菌均为 50 μg /mL 利福
平(Ｒif)、25 μg /mL 卡那霉素(Km)、100 μg /mL
壮观霉素(Spc) ;四环素(Tc) ，大肠杆菌的用量为
15 μg /mL，十字花科黑腐病菌的用量为 5 μg /mL。
1．2 spoTXcc基因突变体、功能互补菌株的构建
1．2．1 spoTXcc基因突变体构建 按照 Windgassen
等［21］描述的方法构建 spoTXcc基因整合突变体，所
用引物见表 2。PCＲ 扩增目标基因 spoTXcc内部的
DNA 片段，经过预先在引物中设计的 BamH I 和
Hind III双酶切后，按照转录方向连接在自杀质粒
载体 pK18mob 相应的酶切位点之间，用引物
0956nkF /0956nkＲ进行 PCＲ 验证，并用酶切验证
的方法，挑取正确的重组质粒，送样测序，将测序正
确的重组质粒通过三亲本接合的方法导入野生型
菌株 Xcc 8004中，在含有相应抗生素 Ｒif 和 Km 的
NYGA 平板上筛选发生同源单交换的三亲本接合
子，即非极性整合突变体，挑取阳性克隆用引物
pK18con /0956conＲ进行 PCＲ验证，随机挑取一个
验证正确的阳性克隆进行下一步试验，并将验证正
确的突变体命名为 NK0956。
1．2． 2 功能互补菌株的构建 以 Xcc 8004 总
DNA 为模板，通过 PCＲ 方法分别扩增目的基因
spoTXcc全基因序列的 DNA 片段(包括 spoTXcc基因
上游 DNA 片段约 260 bp) ，测序正确后连接到
pLAFＲ3上，转化至大肠杆菌 JM109 中，在含有相
应浓度 Tc 的 LA 平板上，获得转化子，利用 PCＲ
验证和酶切验证的方法获得含有目的基因的重组
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1期 刘国芳，等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 spoTXcc对 T3SS 基因调控作用的分析
Table 1 The strains and plasmids used in this study
Strain and plasmid Characteristics Source
E． coli
JM109 ＲecA1，endA1，gyrA96，thi，supE44，relA1△
(lac-proAB)/F’［traD36，lacIq，lacZ△M15］
Laboratory collection
ED8767 ＲecA，met，containing plasmid pＲK2073，Spcr Laboratory collection
Xcc
8004 Wild type，Ｒif r Laboratory collection
NK0956 As 8004，but spoT ∶ ∶ pK18mob，Ｒif r，Kmr This study
CNK0956 NK0956 harboring pL3spoTXcc，Ｒif
r，Kmr，Tetr This study
8004 /pL6hrpAGUS 8004 harboring pL6hrpAGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpBGUS 8004 harboring pL6hrpBGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpCGUS 8004 harboring pL6hrpCGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpDGUS 8004 harboring pL6hrpDGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpEGUS 8004 harboring pL6hrpEGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpFGUS 8004 harboring pL6hrpFGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpGGUS 8004 harboring pL6hrpGGUS，Ｒif r，Tetr This study
8004 /pL6hrpXGUS 8004 harboring pL6hrpXGUS，Ｒif r，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpAGUS NK0956 harboring pL6hrpAGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpBGUS NK0956 harboring pL6hrpBGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpCGUS NK0956 harboring pL6hrpCGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpDGUS NK0956 harboring pL6hrpDGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpEGUS NK0956 harboring pL6hrpEGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpFGUS NK0956 harboring pL6hrpFGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpGGUS NK0956 harboring pL6hrpGGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
NK0956 /pL6hrpXGUS NK0956 harboring pL6hrpXGUS，Ｒif r，Kmr，Tetr This study
Plasmids
pLAFＲ3 PK2 replicon;Mob+，Tra－;containing plac，Tetr Laboratory collection
pＲK2073 Helper plasmid，Tra+，Mob+，ColE1，Spcr Laboratory collection
pK18mob Suicide plasmid in Xanthomonas，Kmr Laboratory collection
pNK0956 pK18mob containing a 597 bp DNA sequence of spoTXcc gene，Km
r This study
pL3spoTXcc pLAFＲ3 containing the spoT gene(2591 bp)of Xcc，Tetr This study
pL6hrpAGUS pLAFＲ6 containing an hrpA operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpBGUS pLAFＲ6 containing an hrpB operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpCGUS pLAFＲ6 containing an hrpC operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpDGUS pLAFＲ6 containing an hrpD operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpEGUS pLAFＲ6 containing an hrpE operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpFGUS pLAFＲ6 containing an hrpF operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpGGUS pLAFＲ6 containing an hrpG operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
pL6hrpXGUS pLAFＲ6 containing an hrpX operon promoter-gusA fusion fragment，Tetr Laboratory collection
Ｒif r，Kmr，Tetr，and Spcr = resistance to rifampicin，kanamycin，tetracycline and spectinomycin，respectively．
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植物病理学报 46卷
Table 2 Primers used in this study
Primer name Sequence (5’to 3’) Product length /bp
0956nkF /0956nkＲ GGATCCGCCCTGGAGCATCTATT /
AAGCTTGCACCAGCTTCTTGTCCACG
597
pK18con /0956conＲ GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCAC /
AAGCTTGGTGCTCGAATCGGCATGTA
1 748
C0956F /C0956Ｒ GGATCCGACAACGCACTGATCGATGAAGT /
AAGCTTGGTGCTCGAATCGGCATGTA
2 591
16S rＲNAF /16S rＲNAＲ CGTGCCTCAGTGTCAGTGTT /GTAAAGCGTGCGTAGGTGGT 195
hrpGＲTF /hrpGＲTＲ AAGAAACTGCGGCTGTGC /GGTGCGATTGACCGTATTG 144
hrpXＲTF /hrpXＲTＲ GAGACATCTTCGGCTTCGAC /GCCTGGCAATACTCGAACTC 204
hrpB6ＲTF /hrpB6ＲTＲ AAGCACAACGAGGTGGAGAC /AGCTGTTCCAGGATGGTGTC 159
hrpC1ＲTF /hrpC1ＲTＲ TCGACTTCACCACCAATACG /AAGGTGCCGATCAATCCTG 130
hrpFＲTF /hrpFＲTＲ TGCCCAAGGATCTAAACCAG /TGCTCATCGACTCTTTGTCG 156
质粒 pL3spoT Xcc。通过三亲本接合将 pL3spoT Xcc
导入突变体 NK0956 中，在含有相应抗生素 Ｒif、
Km 和 Tc的 NYGA 平板上筛选三亲本接合子，选
取 6 ～ 8 个接合子，提取质粒，用引物 C0956F /
C0956Ｒ进行 PCＲ验证以及酶切电泳验证，随机挑
取一个验证正确的阳性克隆进行下一步试验，并将
验证正确的互补菌株命名为 CNK0956。
1．3 过敏反应(HＲ)检测
过敏反应供试植物为近等基因系辣椒品种
ECW-10Ｒ(Capsicum annuum cv． ECW-10Ｒ) ，非寄
主辣椒 ECW-10常用作 Xcc 检测 HＲ反应的供试植
株［22］。辣椒种植约 2～3个月至成株期后，选取六至
八叶龄的叶片作为供试植株。取待测菌株过夜培养
物离心收集细菌，弃去上清，用移液器将残余的培养
基吸干净，用无菌水重悬菌体，将菌液稀释至 OD600
为 0．01;用针头轻轻使叶片背面破损，接着将手指垫
在叶片的另一面，用 1 mL 无针头注射器在破口处压
渗菌液，将菌液压渗到辣椒叶片背面的叶肉中，形成
一个肉眼可见的浸润斑，并且有效控制压渗面积。
接种后将辣椒苗置于室温并用荧光灯光照，8 h后每
隔 1～2 h观察并拍照记录过敏反应结果。
通过测电导率的方法量化过敏反应(HＲ)［22］。
将待测菌株的过夜培养菌液稀释至 OD600 = 0．01，
将菌液压渗至辣椒 ECW-10Ｒ 叶片背面的叶肉中，
接种后将辣椒苗放在室温并用荧光灯照耀，分别在
压渗后 8、16 和 24 h 取各菌株的压渗叶片放入超
纯水中，超声波除去气泡，测电导率。以压渗
ddH2O叶片测得的电导率为负对照，观察并记录野
生型菌株和突变体菌株的电导率。
1．4 半定量ＲT-PCＲ(Semi-quantitative ＲT-PCＲ)
采用 Promega 公司的 SV total ＲNA Isolation
System Kit提取 Xcc 菌株的总 ＲNA，经过消化去除
总 DNA 后，用 Invertron公司的 ＲevertAidTM第一链
合成试剂盒将 ＲNA 反转录成 cDNA，以 cDNA 为
模板，以 16S rＲNA 为内参基因校正待测样品模板
量一致，选择目的基因 OＲF 内部 200 bp 左右的片
段为 PCＲ产物，同样条件下对目的基因进行常规
PCＲ扩增反应。用琼脂糖凝胶电泳分析目的基因
表达量的差异。
1．5 GUS(β-葡糖苷酸酶)活性检测
1．5．1 标准曲线的绘制 配制不同浓度的对硝基
苯酚(p-Nitrophenol) ，于 415 nm 波长处检测吸光
值，以浓度(mg /mL)做横坐标，OD415做纵坐标，绘
制标准曲线，每个浓度做 3个重复。
将待测菌株接种至含有适当浓度抗生素的
NYGB 培养基中培养过夜，调节各待测菌株浓度
OD600一致，按 10%的接菌量将各待测菌株转接至
MMX 液体培养基中，28℃摇床培养 36 h 后，取 2
mL 待测菌液到比色杯中，相应的液体培养基作为
空白对照，测 OD600值;取 1 mL 测过 OD600值的菌
液至 1．5 mL 的 EP管，每管加入 40 μL 甲苯，振荡
7 min;取出 125 μL 振荡后的菌液至 1．5 mL 的 EP
管，加入 375 μL GUS 反应液，混匀，37℃水浴反应
10 min;反应结束后加入 200 μL GUS 反应终止液，
混匀，12 000 rpm，离心 5 min;取 500 μL 上清液测
OD415值，对照是培养基加相应体积的各溶液。
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1期 刘国芳，等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 spoTXcc对 T3SS 基因调控作用的分析
1．5．2 酶活性定义 在 OD600为 1 时，每毫升菌液
每分钟水解对硝基苯酚葡糖苷酸，产生 1 mg 对硝
基苯酚的量为一个酶活性单位。酶活性计算公式:
β-葡糖苷酸酶活性(mg /min × OD600) =
(OD415－a)×0．5 /(b×10×0．125×OD600)
其中，a、b 是标准曲线中的系数，反应时间为
10 min，酶反应体积为 0．5 mL，反应菌液量是 0．125
mL，OD600是所测菌株的菌液在波长 600 nm 处测
定的光吸收值。使用统计分析软件 SPSS 21．0(ht-
tp:/ / spss．en．softonic．com /)进行 student’s t test处
理，对比相应基因在 Xcc 8004 和 NK0956 之间的
表达差异。
1．6 原位组织染色
所用的试验植株是满身红萝卜(Ｒaphanus
sativus var． radiculus) ，萝卜苗温室生长约 25 d 左
右达到 4～5叶期，即可用于试验。
将 Xcc 待测菌株摇瓶过夜培养，调节菌液
OD600至 1．0;将调好浓度的菌液用剪叶法接种至寄
主植物满身红萝卜的叶片，接种后的寄主植物置温
度为 28℃，相对湿度为 70%，光照时间为 12 h /d的
温室中，分批诱导 5 d 和 7 d;诱导后，从植株上回
收接种的叶片，将叶片浸泡于 200 mL GUS 组织染
色缓冲液中，37℃培养箱放置 24 h;用 70%乙醇
(或异丙醇)漂洗浸泡叶片数天，期间更换新的
70%乙醇以除去叶绿素，观察结果并照相。GUS
组织染色缓冲液［Na3 PO4(pH 7．0)100 mmol /L、
Triton-X-100 0．1%、EDTA 10 mmol /L、X-gluc 0．5
mg /mL、二甲基亚砜 1%］。
2 结果与分析
2．1 spoTXcc基因的生物信息学分析
根据 Xcc 8004 基因组注释［9］，基因 XC_0956
编码一个 pentaphosphate guanosine-3-pyrophos-
phohydrolase(SpoT Xcc)。spoTXcc基因全长为 2 172
bp，位于基因组的 1 151 146 bp ～ 1 148 975 bp，转
录方向为反方向。其编码蛋白包含 4个结构域，从
N 端到 C 端分别是(p)ppGpp 水解酶结构域 HD，
其负责将胞内(p)ppGpp水解为 GTP或者 GDP和
焦磷酸;(p)ppGpp 合成酶结构域 ＲelA _SpoT，其
负责在应急环境中将胞内的 GTP 和 ATP 合成
(p)ppGpp;C 末端的 TGS 和 ACT 结构域主要是感
受外界信号的刺激，起调节酶活性的作用(图 1-A) ;
Fig． 1 The domain analysis and amino acid sequences comparison from Xanthomonas campestris
pv． campestris (SpoT-Xcc)，Vibrio cholerae (SpoT-V． cholerae)and Escherichia coli (SpoT-E． coli)
A:Domain analysis of SpoT-Xcc，SpoT-V． cholerae and SpoT-E． coli． HD: (p)ppGpp hydrolase;
ＲelA_SpoT: (p)ppGpp synthetase;TGS:Named after threoyl-tＲNA synthetase，GTPases and SpoT proteins;
ACT:Nnamed after acetolactate synthetase，chorismate mutase and TyrＲ proteins．
B:HD_4 domain amino acids sequence comparison from HD_4-E． coli，HD_4-V． cholerae and HD_4-Xcc．
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植物病理学报 46卷
氨基酸序列同源性分析发现，Xcc 8004 的 SpoT Xcc
酶和大肠杆菌、霍乱弧菌 SpoT 酶的氨基酸序列的
相似性分别是 45．9%和 45．5%，其中 HD_4(水解
酶)结构域的相似性分别达到 66． 0%和 68． 0%
(图 1-B)。
2．2 构建 spoTXcc基因突变体及功能互补菌株
采用整合突变和三亲本接合的方法，构建了
spoTXcc基因的非极性整合突变体 NK0956，还构建
了突变体 NK0956 的功能互补菌株 CNK0956，具
体操作步骤见 1．2。
2．3 spoTXcc基因与 Xcc 在非寄主植物上产生
HＲ反应相关
将 Xcc 8004、NK0956、CNK0956稀释至 OD600 =
0．01的菌液及无菌水压渗至辣椒 ECW-10Ｒ 叶片
上，8 h后，每隔 2 h记录一次观察结果，并进行电导
率测定。结果发现，接种 8 h 后，野生型菌株 Xcc
8004和互补菌株 CNK0956的辣椒叶片接种部位出
现较弱的组织坏死，而突变体菌株 NK0956 的辣椒
叶片接种部位没有出现组织坏死(图 2-A) ;10 h后，
野生型菌株 Xcc 8004和互补菌株 CNK0956的辣椒
叶片接种部位出现明显的组织坏死，而突变体
NK0956的辣椒叶片接种部位出现较弱的组织坏死;
12 h后，野生型菌株 Xcc 8004、突变体菌株 NK0956
和互补菌株 CNK0956 的接种部位出现明显的组织
坏死，而接种无菌水的部位则无明显的变化(图 2-
A)。这一结果与电导率测定的结果(图 2-B)一致。
对过敏反应(HＲ)的量化采用测电导率的方法［22］。
压渗有不同菌株的叶片、出现坏死斑较晚的叶片，其
电导率测出的值较低，相对应的菌株延迟或者减弱
了 HＲ反应的出现。这些结果说明，spoTXcc基因突
变后，延迟和减弱了 Xcc 在非寄主植物辣椒上 HＲ
反应的出现，互补菌株 CNK0956能恢复这一表型至
野生型菌株 Xcc 8004水平。此外，还发现将 spoTXcc
基因突变后，突变体菌株 NK0956 在寄主植物上的
致病力降低(数据未显示)。
Fig． 2 Hypersensitive response(HＲ)assay of strains Xcc 8004，NK0956 and CNK0956 on non-host plant
A:HＲ induced on non-host plant pepper leaves by X． campestris pv． campestris;
B:Electrolyte leakage from pepper leaves inoculated with X． campestris pv． campestris strains．
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1期 刘国芳，等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 spoTXcc对 T3SS 基因调控作用的分析
2．4 hrp 基因簇报告质粒在基本培养基中的
GUS活性及半定量 ＲT-PCＲ结果分析
Xcc 在非寄主植物上引起 HＲ反应受 hrp 基因
簇调控，并且 hrp 基因与 Xcc 在寄主植物上的致病
性相关，而 hrp 基因簇的表达又受到 2 个非常关键
的基因 hrpG 和 hrpX 调控。为了进一步研究
spoTXcc基因突变体 HＲ 反应延迟和致病力降低是
否是因为影响了 hrp 基因簇的表达，比较了 hrp 基
因在突变体和野生型菌株中的表达情况。将 hr-
pG、hrpX、hrpA、hrpB、hrpC、hrpD、hrpE 和 hrpF 的
GUS 报告质粒通过三亲本接合的方法分别导入到
野生型菌株 Xcc 8004 和 spoTXcc基因整合突变体
NK0956中，在 MMX 基本培养基中检测 GUS 活性
表达。统计学分析表明，报告质粒 pL6hrpGGUS
在野生型菌株 Xcc 8004 和突变体菌株 NK0956 中
的 GUS 活 性 没 有 明 显 差 异，而 报 告 质 粒
pL6hrpXGUS、 pL6hrpBGUS、 pL6hrpCGUS、
pL6hrpFGUS 在突变体菌株 NK0956 背景下的
GUS 活性极显著低于野生型菌株 Xcc 8004背景下
的 GUS 活性(P = 0． 01，t test) ;pL6hrpAGUS、
pL6hrpDGUS、pL6hrpEGUS 在突变体 NK0956 背
景下的 GUS 活性显著低于野生型菌株 Xcc 8004
背景下的 GUS 活性(P= 0．05，t test) (图 3-A)。半
定量 ＲT-PCＲ的结果(图 3-B)与 GUS 活性检测结
果基本一致。这一结果说明 spoTXcc基因与 hrp 基
因簇的基因 hrpX、hrpA、hrpB、hrpC、hrpD、hrpE 和
hrpF呈正调控关系，而与 hrpG 不存在明显的调控
关系。这也说明 spoTXcc基因在MMX 培养基中，可
能是通过调控 hrpX的表达来调控 hrp 基因簇其他
基因的表达。
2．5 spoTXcc基因在植物中正调控 hrp 基因簇基
因的表达
为研究 spoTXcc基因是否在细菌侵染植物过程
中正调控 hrp 基因簇基因的表达，以 hrpG、hrpX 和
hrpF作为 hrp 基因簇的代表，检测了报告质粒
pL6hrpGGUS、pL6hrpXGUS 和 pL6hrpFGUS 在植
物中 的 GUS 活 性 表 达。将 含 有 报 告 质 粒
pL6hrpGGUS、pL6hrpXGUS 和 pL6hrpFGUS 的野
生型菌株 Xcc 8004和 spoTXcc基因整合突变体菌株
NK0956，接种至含有相应抗生素的 10 mL NYGB
培养基中，28℃、200 rpm 摇床培养过夜，调节待测
菌株的过夜培养物浓度 OD600 = 1．0，用剪叶接种的
方法将待测菌株接种至寄主植物满身红萝卜叶片
上，分批诱导 5 d和 7 d，进行组织染色。结果表明，
Fig． 3 The expression status of hrp genes in Xcc 8004 and the spoTXcc mutant
A:GUS activity of each hrp gene’s promoter and gusA transcriptional fusion plasmid in Xcc 8004 and NK0956．
B:The transcriptional levels of hrp genes in Xcc 8004 and NK0956 by Semi-quantitative ＲT-PCＲ． A paired student’s t test
was carried out by using SPSS to determine the gene expression differences between Xcc 8004 and NK0956．
33
植物病理学报 46卷
Fig． 4 spoTXcc gene positively affects the expression of hrp genes on host plant
Xcc strains 8004 /pL6hrpGGUS，8004 /pL6hrpXGUS，8004 /pL6hrpFGUS，NK0956 /pL6hrpGGUS，NK0956 /pL6hrpXGUS
and NK0956 /pL6hrpFGUS were cultured in NYGB medium overnight and resuspended in water to an optical density
at OD600 = 1．0 and then inoculated into the Chineses radish leaves by leaf clipping． At 5 days and 7 days postinoculation，
the inoculated leaves were assayed． β-Glucuronidase (GUS)activity was measured using an in situ staining method．
A:The inoculated leaves of 5 days postinoculation． B:The inoculated leaves of 7 days postinoculation．
接种含有报告质粒 pL6hrpGGUS、pL6hrpXGUS 和
pL6hrpFGUS 的野生型菌株 Xcc 8004 的叶片显示
深蓝色，而接种含有报告质粒 pL6hrpGGUS、
pL6hrpXGUS 和 pL6hrpFGUS 的 突 变 体 菌 株
NK0956的叶片显示淡蓝色或无蓝色(图 4)。这
些结果说明，spoTXcc基因在植物体内正调控 hrp 基
因簇基因的表达，spoTXcc基因可能是通过正向调控
hrpG 的表达来调控 hrpX 的表达，进而调控 T3SS
其他 hrp 基因的表达。
3 讨论
十字花科黑腐病菌 Xcc 8004 全基因组中拥有
一个注释为与应急反应相关的基因 spoTXcc
［9］。本
研究通过构建 spoTXcc基因的非极性整合突变体对
该基因的功能进行了初步研究，试验结果表明
spoTXcc基因与 Xcc 在非寄主植物辣椒 ECW-10Ｒ上
HＲ反应的产生相关，而 T3SS 的组分绝大多数是
由 hrp 基因编码的［23，24］，受到 HrpG /HrpX 的调
控，hrp 基因与病原菌在易感染植物上的致病、抗
性寄主植物和非寄主植物上的 HＲ 反应相关［25］。
为此，通过 GUS 活性检测、原位组织染色和半定量
ＲT-PCＲ 的方法，研究了十字花科黑腐病菌 Xcc
8004中 spoTXcc基因与 hrp 基因(hrpG、hrpX、hrpA-
hrpF)的调控关系。本研究发现，在基本培养基
MMX 中的 GUS 活性检测和半定量 ＲT-PCＲ 的结
果显示，hrpG 基因在 spoTXcc 基因整合突变体
NK0956中的表达与野生型菌株 Xcc 8004 中的表
达没有明显的差异;而 hrpX、hrpA、hrpB、hrpC、
hrpD、hrpE和 hrpF基因在 spoTXcc基因整合突变体
NK0956 中的表达明显低于在野生型菌株 Xcc
43
1期 刘国芳，等:十字花科黑腐病菌应急反应相关基因 spoTXcc对 T3SS 基因调控作用的分析
8004背景中的表达。原位组织染色的结果显示:
在植物体内，hrpG、hrpX 和 hrpF 在 spoTXcc基因突
变体 NK0956背景中的表达明显低于野生型菌株
Xcc 8004背景中的表达。本研究结果显示在十字
花科黑腐病菌中，spoTXcc基因是在转录水平调控
T3SS 相关基因;在基本培养基 MMX 中，spoTXcc基
因是通过调控 hrpX的转录来调控其他 hrp 基因的
转录，而在植物体内，spoTXcc基因是通过调控 hrpG
基因的转录来调控 hrpX 基因的转录，进而来调控
其它 hrp 基因。我们还发现，spoTXcc基因在基本培
养基 MMX 和植物体内对 T3SS 的调控模式有差
异。虽然基本培养基 MMX 被用来模拟 Xcc 寄主
植物体内环境，但是植物体内的环境和细胞组成成
分比 MMX 培养基复杂的多，推测可能由于植物体
内环境的复杂性造成 spoTXcc基因在基本培养基
MMX 和植物体内对 T3SS 相关基因 hrp 的调控模
式不同，其机制值得进一步深入研究。
本研究对 Xcc 8004菌株的应急反应相关基因
spoTXcc做了功能分析，首次对黄单胞菌的 spoTXcc基
因与 T3SS 相关基因的调控关系进行了报道，为黄
单胞菌属应急反应系统与致病系统关系的研究奠
定了一定的基础。
致谢:本 研 究 由 国 家 “973 ”计 划 项 目
( 2011CB100701) 和公益性行业( 农业) 科
研专项( 201303015) 提供资助。
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责任编辑: 于金枝
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