全 文 ：应用与环境生物学报 2011，17 ( 2 ): 207~210
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2011-04-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00207
白菜、萝卜、甘蓝等十字 花 科 蔬 菜是我国重 要的蔬 菜
资源类 群，在 蔬 菜 育 种中占有重 要地位，对其 雄 性不 育相
关基因的研究一直是分子育种的热点. BcMF13基因是本课
题 组 从白菜中克隆到的花粉发育相关 基因（GenBank登陆
号：EF158459），抑制该基因的表达导致花粉败育严重、花粉
萌发受阻碍 [1~2]. 并且，与这个新基因相似性极高的EST序列
（96%~98%）都来源于十字花科植物的花器官. 为详细研究
该基因的家族成员，以十字花科多个不同属的植物为材料，
分别克隆其同源序列，并进行序列分析，将有助于进一步了
解BcMF13的功能.
近年来，分 子生物学的发展 使得人们可以从分 子水平
来研究不同类群、物种间的亲缘关系，深入探索物种的演化
规律和进化机制. RAPD和AFLP技术被广泛应用的同时，以
DNA序列为基础的系统发育研究也日益增多 [3~7]，如多聚半乳
糖醛酸酶、细胞色素P450基因家族成员CYP86MF、乙醇脱氢
酶、组蛋白H3内含子等在系统发育研究中的应用，为针对特
定的系统发育问题的研究提供了更多的可供选择的DNA序
列 [8~11]. 本实验利用克隆到的十字花科多个属蔬菜BcMF13同
源基因的核苷酸序列，分析其进化特征，将有助于从分子水
平上揭示十字花科蔬菜的系统发育规律.
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用材料均为浙江大学蔬菜研究所保存提供. 包括芸薹
属的8种植物（表1）. 将试验材料播于试验田，田间管理按常
规进行. 在苗龄d 50时，从群体中随机选取单株，每株取2~3
片鲜嫩叶片，所选材料用75%的酒精棉擦洗干净，做好记号，
用纱布包好，立即投入液氮中固定，-75 ℃保存备用.
1.2 DNA提取及同源基因克隆
DNA提取及检测参照本实验室的方法并略加改进 . 用
BcMF13全长引物P1（5′ GGG AAC CAT CAA ACT AGT A3′）
和P2（5′ TAA CCT ATT TCT CTC CTT TTG 3′），扩增十字花
科芸薹属植物BcMF13的同源基因. PCR反应总体积25 μL，包
括DNA模板（20 ng μL-1）1 μL，10× PCR反应缓冲液2.5 μL，
dNTP（10 μmol L-1）0.5 μL，上下游引物（10 μmol L-1）各0.5 μL，
Taq酶（5 U μL-1）0.5 μL，反应条件为94 ℃预变性2 min；94
℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃
延伸10 min.
扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度
及亮度. 对于扩增效果良好且足量的样品用VITAGENE公司
的DNA凝胶回收试剂盒回收，T4连接酶4 ℃连接过夜，转入
十字花科蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析*
李焰焰1, 2 聂传朋1** 曹家树2
（1阜阳师范学院生命科学学院 阜阳 236041）
（2浙江大学蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室 杭州 310029）
Cloning and Evolutionary Analysis of Homologous Sequences of
BcMF13 Gene in Cruciferous Vegetables*
LI Yanyan1, 2, NIE Chuanpeng1** & CAO Jiashu2
(1School of Life Sciences, Fuyang Teachers College, Fuyang 236041, Anhui, China)
(2Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Vegetable Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract 8 sequences homologous to BcMF13 (GenBank number: EF158459) were cloned from Brassica of Cruciferae. The
results showed that the 8 DNAs were 565 bp long and contained open reading frames (ORF) of 222 bp that encoded 73 amino
acids. They all contained an intron with 1 insertion/deletion site, fi ve transversion sites and four transition sites. The 8 deduced
amino acid sequences were very conservative in Cruciferous species. NJ tree of BcMF13 homologous genes was constructed
based on Kimura two-parameter distance. The results ref lected the different evolutionary processes of North and South
Chinese cabbage. Fig 3, Tab 1, Ref 20
Keywords Cruciferae; Brassica; homologous gene; evolutionary analysis; BcMF13
CLC Q349+.5 : S630.3
摘 要 在十字花科芸薹属的8个物种中扩增到与十字花科蔬菜花粉发育相关的一个重要基因BcMF13（GenBank登陆
号：EF158459）的同源序列，获得8个同源序列的DNA序列全长602~607 bp，均含有一个内含子区，编码73个氨基酸，在
内含子区内存在1个插入 /缺失、5处颠换、4处转换. 对8个同源基因的氨基酸比对发现该基因在十字花科物种内有很强
的保守性. 基于Kimura双参数距离，构建了BcMF13同源基因在十字花科中进化的NJ系统树，反映出南方大白菜与北方
大白菜存在不同的演化过程. 图3 表1 参20
关键词 十字花科；芸薹属；同源基因；进化分析；BcMF13
CLC Q349+.5 : S630.3
收稿日期：2010-07-19 接受日期：2010-09-02
*国家自然科学基金项目（No. 31000132）和 安 徽省高校 青 年 教 师 项
目（No. 2008jq1121）资助 Supported by the National Natural Science
Foundation of China (No. 31000132) and the University and College Young
Teachers’ Foundation of Anhui, China (No. 2008jq1121)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: niechp1974@126.com)
208 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
DH5α大 肠杆菌中. 挑取单个白色菌落，以碱裂解法抽提质
粒，用EcoRI进行单酶切鉴定和PCR鉴定后，送上海博亚生物
公司测序.
1.3 同源基因的序列特征分析
DNAStar软件分析不同物种中BcMF13同源基因的最大
开放阅读框，推导相应的氨基酸序列；并使用MegAlign程序
分析各同源基因在核苷酸水平和蛋白质水平上的相似程度.
ClustalX进行序列比对.
1.4 同源基因的进化分析
由ClustalX完成 序列对齐和同源性序列的多重排定，
设置参数gap-opening penalty = 15.0，gap-extension penalty =
15.0，通过将转换和颠换作图到Kimura 2 parameter 遗传距离
上以检验碱基是否突变饱和，碱基突变饱和通过颠换和转
换与遗传距离的线性关系来估计.
在MEGA 3.1软件中根据Kimura双参数 模型计算遗传
距离（D），相应的标准误差用Bootstrap方法（Replications =
1000），NJ、ME和MP系统树通过MEGA3.1软件得出，系统树
中节点的自举置信水平（Bootstrap confidence level，BCL）应
用自引导（Bootstrap）估计，共1 000次循环.
2 结果与分析
2.1 BcMF13同源序列的扩增和克隆
利用引物P1、P2对十字花科芸薹属以及近缘属的一些
蔬菜品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，目前只在芸薹属
的8个不同物种中得到了大小为600 bp左右的特异条带（图
1）. 回收扩增产物，与T-easy载体连接后转化大肠杆菌，经蓝
白斑筛选后，挑选阳性克隆，经单酶切鉴定后送去测序. 经
测定得到BcMF13同源基因的DNA序列全长在602~607 bp
之间.
2.2 BcMF13同源基因的序列特征分析
将所得的BcMF13同源基因DNA全长序列与cDNA序列
进行比较，发现与白菜 BcMF13一样，同源基因都含有1个内
含子，且都符合GT-AG规律. 起始密码子ATG，终止密码子为
TAA，均能正确地翻译成氨基酸序列.
以BcMF13及其同源序列为材料，由ClustalX完成DNA序
列、内含子序列、氨基酸序列的对齐和同源性序列的多重排
定（图2）. 结果表明，BcMF13同源基因的DNA序列在不同物
种中相当保守，分化后碱基的替代事件发生少. 对内含子区
的分析（图2-A）发现，8个物种内含子区存在1个插入 /缺失，
碱基的变化为转换和颠换，存在5处颠换，4处转换，其中C↔
T的转换和A↔G的转换各两次，G↔T的颠换数明显高于A↔
T和C↔A颠换.
氨基酸同源比对结果（图2-B）揭示，8个物种之间都没
发现氨基酸残基的插入 /缺失，氨基酸序列有7个变异位点，
其中有一个保守的氨基酸C在BcMF13cm中为Y所代替，总的
来看，氨基酸序列变化不大 . 一般认为，如果蛋白质序列间
在至少80个氨基酸左右的区域中具有25%或更高的相似性，
那么它们一般具有相类似的生物学性质，因而有可能在不同
物种中执行着相同功能. 因此，十字花科芸薹属中的BcMF13
同源基因在花粉发育中执行着相同或相似的功能.
2.3 芸薹属BcMF13同源基因的分子进化分析
根据BcMF13基因同源性的分析，基于Kimura双参数距
离，构建了十字花科芸薹属8个蔬菜品种的NJ、ME和MP系统
树，3种系统树的拓扑图总体趋势相似，在此只列出NJ树（图
3）. 从图中可以看到，在初级聚类中，来自‘矮脚黄’白菜的
BcMF13和‘马耳头’分蘖菜的BcMF13cm首先聚在一起，其
次是与‘雪里蕻’BjMF13m，三者聚为一类；南方大白菜‘黄
芽14’BcMF13ph与日本水菜‘千筋京水菜’BcMF13n聚为一
类；然后这两个分支再合并起 来聚为一类；‘温州盘 菜’芜
菁的BcMF13r、北方大白菜‘小青口’BcMF13px、‘鸡心’甘蓝
BoMF13分别作为独立的分支，依次与之前形成的分支聚合，
表1 实验所用芸薹属蔬菜材料
Table1 Materials of Brassica vegetables in the experiment
种类 Species 品种 Cultivar 基因名称 Gene name
普通白菜 B. campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. communis Tsen et Lee 矮脚黄 Aijiaohuang BcMF13
分蘖菜 B. campestris L. ssp. chinensis Makino var. multiceps Sh. Cao ex J. Cao 马耳头 Maertou BcMF13cm
日本水菜 B. campestris L. ssp. nipposinica (Bailey) Olsson 千筋京 Keisenkinkyou BcMF13n
大白菜 B. campestris L. ssp. pekinensis Olsson 小青口 Xiaoqingkou BcMF13px
大白菜 B. campestris L. ssp. pekinensis Olsson 黄芽14 Huangya 14 BcMF13ph
芜菁 B. campestris L. ssp. raifera Metzg. 温州盘菜 Wenzhou-pancai BcMF13r
分蘖芥 B. juncea Czern. et Coss var. multiceps Tsen et Lee 雪里蕻 Xuelihong BjMF13m
甘蓝 B. oleracea L. 鸡心 Jixin BoMF13
图1 BcMF13同源基因片段的扩增结果
Fig. 1 Amplifi cation of the homologous BcMF13 gene
1：3 kb ladder DNA标准分子量；2~9：分别为‘矮脚黄’、‘马耳头’分蘖
菜、‘千筋京’水菜、‘小青口’大白菜、‘黄芽14’大白菜、‘温州盘菜’
芜菁、‘雪里蕻’分蘖芥和‘鸡心’甘蓝
Lane 1: 3 kb DNA ladder; Lanes 2~9 represent B. campestr is cv.
Aijiaohuang, B. campestris chinensis cv. Ma’ertou, B. campestris L. ssp.
nipposinica (Bailey) Olsson cv. Keisenkinkyou, B. campestris pekinensis
cv. Xiaoqingkou, B. campestris pekinensis cv. Huangya 14, B. campestris
rapifera cv. Wenzhou-pancai, B. juncea cv. Xuelihong and B. oleracea cv.
Jixin, respectively
2092 期 李焰焰等：十字花科蔬菜BcMF13同源基因的克隆及进化分析
其中‘鸡心’甘蓝BoMF13与其它几种作物中同源基因的进化
关系较远.
3 讨 论
本实验通过同源序列克隆的方法，根据来自‘矮脚黄’
白菜的基因BcMF13全长序列设计引物，在十字花科植物的
8个物种中扩增到了基因的同源序列，分析发现BcMF13同源
基因具有很强的保守性，说明BcMF13是十字花科中广泛存
在的一类保守性基因. 这些同源基因的获得，是本实验室对
十字花科植物花粉发育相关基因研究的系列发现之一 [12~17].
根据我们对白菜BcMF13的转基因研究，推测BcMF13同源基
因极可能在十字花科植物的生殖发育中发挥重要作用.
在分析系统发育研究中，最 好同时使用多种方法构建
系统树，如果多种方法所获系统树一致，将大大提高结果的
可靠性 [18~19]. 我们分别用NJ、ME和MP法构建了BcMF13同源
基因的核苷酸分子变异基因树，研究BcMF13同源基因在十
字花科多个属植物中的进化 . 3种系统树的拓扑图总体趋势
相同，有 较高的一致性，说明得到的系统树 能客观 地反映
BcMF13类基因在这些物种中的演化关系. 其中，NJ法不以假
定存在分 子 钟为前 提，最 后形成 无根网状树，并给出分支
长度，因此在有关不同系谱进化速率不等的情况下，NJ法更
能反映客观的进化图景，在有较近亲缘关系的物种或群体
的分化研究上应用较广. 本研究所用的材料在十字花科范围
内，NJ法可能更符合建树要求 . 因此，我们对实验结果的分
析主要以NJ法构建的系统树为依据.
这8个材料中，‘雪里蕻’属于AABB染色体组，‘鸡心’
甘蓝属于CC染色体组，其余的都是AA染色体组. ‘鸡心’甘
蓝的BoMF13基因与其余7种同源基因的距离最远，也反映了
它们在染色体组上的差异. 有趣的是，‘黄芽14’南方大白菜
与‘小青口’北方大白菜处于不同的分支，而是与与日本水菜
‘千筋京’聚为一类，说明BcMF13同源基因的进化反映了南
方大白菜与北方大白菜有不同的演化过程，进一步证实了曹
家树提出的南方大白菜有其独立的起源系统 [20]，这个结果与
王玲平、张弢对CYP86MF和BcMF2为基础研究十字花科系统
关系的结果 [8~9]是一致的.
BcMF13同源基因在十字花科芸薹属植物中的进化分析
数据丰富了十字花科芸薹属植物的基因组信息，为以后的研
究提供了有价值的分子数据. 同时，对BcMF13系列同源基因
的克隆也有助于明晰十字花科植物花粉发育相关基因的作
用机制.
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BcMF13 in the antisense-silenced plants of Brassica campestris ssp.
图2 BcMF13同源基因的内含子区以及推测氨基酸序列的同源比对
Fig. 2 Alignment of the intron and predicted amino acid from BcMF13 homologous gene
A：内含子序列的同源比对；B：氨基酸序列的同源比对 A: Alignment of the intron; B: Alignment of the predicted amino acid
图3 根据Kimura双参数模型用NJ法构建的BcMF13
各同源基因间的相互关系树
Fig. 3 Molecular phylogenetic trees based on homologous BcMF13 sequences
using NJ method by Kimura’s two-parameter model
图中数字为自举检验置信值（1 000个复制序列） Numbers on the tree
represent confi dence values from bootstrap test (1 000 replicates)
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