全 文 ：Ｒesearch Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
55(10) :1264 － 1272;4 October 2015
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn /actamicrocn
doi:10. 13343 / j． cnki． wsxb． 20150012
基金项目:国家自然科学基金项目(31260443) ;广西自然科学基金项目(2014GXNSFFA118005，2013GXNSFAA019097)
* 通信作者。Tel:+ 86-771-3239255;E-mail:jbl1971@gxu．edu．cn
作者简介:杨丽超(1986 －) ，女，广西南宁人，博士研究生，主要从事微生物学及微生物与植物相互作用研究。E-mail:yang_lichao@qq．com
收稿日期:2015-01-11;修回日期:2015-03-20
十字花科黑腐病菌一个新的 III型效应物 XC3176 的鉴定
杨丽超1，苏华1，杨凤1，蹇华哗1，周敏1，姜伟1，2，姜伯乐1，2*
1广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004
2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004
摘要:【目的】在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv． campestris，Xcc)的致病因子中，III 型分泌系
统(Type III Secretion System，T3SS)是至关重要的致病系统，III 型效应物通过 III 型分泌系统直接转运到寄
主植物细胞内。本研究通过效应物水平转移的特征获得候选基因，旨在鉴定一个新的依赖于 III型分泌的效
应物。【方法】以缺失了 N-端 58 个氨基酸的 AvrBs1 作为报告系统构建效应物鉴定报告质粒 pLJB3176，导
入 ΔavrBs1 和 ΔhrcV，通过检测报告菌株在辣椒 ECW-10Ｒ 上的过敏反应来鉴定 XC3176 是否为 III 型效应
物。构建 XC3176 融合 GUS报告质粒 pLGUS3176，导入野生菌株 Xcc 8004、ΔhrpG 和 ΔhrpX，通过测定菌株
GUS活性检测 hrpG、hrpX对 XC3176 的调控作用。构建 XC3176 缺失突变体和互补菌株，通过剪叶法接种检
测 XC3176 对 Xcc 8004 致病性的影响。【结果】XC3176 融合 AvrBs1 报告菌株在非寄主辣椒 ECW-10Ｒ上能
引发过敏反应，GUS活性检测显示 ΔhrpG /pLGUS3176、ΔhrpX /pLGUS3176 比 8004 /pLGUS3176 的 GUS 酶活
显著降低，致病性检测显示突变体 Δ3176 与野生型 Xcc 8004 相比在寄主满身红萝卜上的病斑长度有显著减
少，互补菌株 C3176 的病斑长度能补回到野生型水平。【结论】XC3176 是依赖于 hrcV分泌的 III 型效应物，
hrpG、hrpX正调控 XC3176，XC3176 与 Xcc致病相关。
关键词:十字花科黑腐病菌，XC3176，III型效应物，hrpG，hrpX
中图分类号:Q933 文章编号:0001-6209(2015)10-1264-09
十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv．
campestris，Xcc)能引起十字花科植物产生黑腐病，
是研究植物与病原微生物互作的重要模式菌［1］。
植物病原细菌的 III 型分泌系统(type III secretion
system，T3SS)由 hrp (hypersensitive response and
pathogenicity)基因编码［2］。编码 T3SS 的基因最早
报道于丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas
syringae pv． phaseolicola)［3 － 4］，这些基因总是成簇存
在于 hrp致病岛上［5 － 7］。III 型分泌效应物(type III
secreted effectors，T3SEs)指通过 T3SS 转运至寄主
细胞内，起识别和致病作用的病原细菌分泌蛋白，包
括无毒蛋白和一些其他分泌蛋白。无毒蛋白是由无
毒基因编码的，无毒基因属于 T3SEs 基因。依赖于
T3SS分泌的蛋白并不都进入宿主细胞，不进入宿主
细胞的那部分蛋白主要的作用是辅助效应物的分泌
和转运［8］。有研究表明 hrp 致病岛和许多 III 型效
应物基因是水平转移获得的［5 － 7］。
十字花科黑腐病菌中，hrpG 和 hrpX 是 hrp 基因
杨丽超等:十字花科黑腐病菌一个新的 III型效应物 XC3176 的鉴定． /微生物学报(2015)55(10)
调控最关键的调控基因。HrpG 是一个隶属 OmpＲ
家族的双组分系统调控蛋白［9］，HrpX 是一个类
AraC家族的转录激活蛋白，调控下游 hrp 基因簇内
的 hrp基因以及效应物基因的表达［10］。
在黄单胞菌属的辣椒斑点黄单胞菌 (X．
campestris pv． vesicatoria，Xcv)中，效应物的研究进
展相对领先，建立了一些筛查效应物的方法。比较
有实用性和代表性的方法有植物诱导启动子盒
(PIP-box)搜寻［11］、HrpG 调控基因 cDNA-AFLP［12］、
无毒蛋白［13］和腺苷酸环化酶报告系统［14］等。在辣
椒斑点病菌的 hrp基因簇中，受 HrpX直接调控的基
因启动子区域一般都有一段保守的 DNA 序列
TTCGB-N15-TTCGB，被称为植物诱导启动子盒
(Plant-inducible promoter，PIP-box)［11］。虽然目前
已知部分 III 型效应物基因启动子区并没有 PIP-
box，但通过全基因组范围搜索 PIP-box 仍是一种鉴
定病原细菌效应物候选基因的重要方法。采用
cDNA-AFLP技术，目前在黄单胞菌属辣椒斑点病菌
致病变种中已鉴定了 30 个 hrpG 诱导的 cDNA 片段
和 5 个 hrpG 抑制的 cDNA 片段。序列分析显示这
些片段有的编码胞外蛋白酶，有的为转录调控蛋白，
还有的为效应物蛋白 XopJ和 XopB。通过以无毒蛋
白和腺苷酸环化酶作为报告蛋白鉴定 III 型效应物
的系统，鉴定了大量的效应物基因。已经成功利用
腺苷酸环化酶实现对黄单胞菌 III 型效应物的转运
的研究［14］。目前在水稻白叶枯病菌(X． oryzae pv．
oryzae)［15］、茄 科 罗 尔 斯 通 氏 菌 (Ｒalstonia
solanacearum GMI1000)［16］、丁香假单胞菌 (P．
syringae)［17］中利用这个报告系统已经鉴定了一批
效应物基因。
在 Xcc 8004 中，利用在抗性品种鉴定无毒基因
的方 法 鉴 定 了 AvrBs2［18］、AvrXccC、AvrXccE1、
AvrBs1 为 III型效应物［19］。通过缺失了 N端 1 － 58
个氨 基 酸 的 AvrBs1 作 为 报 告 系 统 鉴 定 了
AvrACXcc8004
［20］、XopXccN［21］为 III 型效应物，通过全
基因组搜寻启动子区含有 PIP-box以及受到 hrpX调
控的基因作为候选基因，并用 AvrBs1 报告系统鉴定
了 6 个 III 型 效 应 物:XopXccE1、XopXccP、
XopXccQ、XopXccＲ1、XopXccLＲ和 AvrXccB［22］。
通过对已鉴定的 III型效应物分析可知大部分
效应物基因具有水平转移特征，包括:在基因附近
有明显的基因缺失或重排、基因附近含有移动元
件 IS序列或 tＲNA、相比基因组其他部分的 DNA
的 G + C 含量有明显差异等等［23 － 24］。Xcc 8004 中
已鉴定的 III 型效应物 XopXccQ 由 XC3177 编码，
KEGG分析 XC3177 及其附近基因在黄单胞菌属
其他致病变种的同源基因发现，这些基因发生了
重排，暗示这部分基因可能是在进化过程中水平
转移而来。本研究以 XC3177 附近水平转移的基
因 XC3176 作为候选基因，鉴定其是否为依赖于
III型分泌的效应物。
1 材料和方法
1. 1 菌株、质粒和培养条件
本研究所用的菌株和质粒见表 1。大肠杆菌
(Escherichia coli)培养温度为 37 ℃，培养基为 LB
(Lysogeny Broth)［25］，十字花科黑腐病菌培养温度为
28 ℃，培养基为 NYG (Nutrient Yeast Glycerol)［26］或
MMX［27］。菌株培养使用的抗生素浓度如下:四环素
(Tetracycline，Tc)大肠杆菌用量为 15 μg /mL，Xcc用
量为 5 μg /mL，利福平(Ｒifampicin，Ｒif)50 μg /mL，
卡那霉素(Kanamycin，Kan)25 μg /mL。
1. 2 引物和试剂
主要试剂:Taq DNA 聚合酶购买于 TaKaＲa 公
司(中国大连) ，T4 DNA 连接酶和限制性内切酶购
买于 Promega公司(中国上海) ，PCＲ 产物纯化试剂
盒、DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购买
于博日公司(中国杭州) ，根据 Xcc 8004 菌株的核苷
酸序列［30］，按照试验需要设计引物见表 2。
1. 3 效应物转运报告系统的检测
1. 3. 1 效应物转运报告系统的构建:以 Xcc 8004
的 DNA 为模板，XC3176F、XC3176Ｒ 为引物，用 Ex
Taq酶扩增 XC3176 启动子及信号区 DNA 片段，将
扩增的 XC3176 启动子及信号区 DNA 片段和
pK18mob载体分别用 EcoＲ I /BamH I双酶切，然后连
接，转化。所得转化子提质粒进行 EcoＲ I /BamH I
双酶切鉴定，酶切正确的阳性克隆送至北京六合华
大基因股份有限公司测序，将测序正确的 pK3176
经 EcoＲ I /BamH I 双酶切，克隆至报告质粒 pLJB，
获得 重 组 报 告 质 粒 pLJB3176。将 重 组 质 粒
pLJB3176 通过三亲本接合，分别导入十字花科黑腐
病菌 ΔavrBs1 和 ΔhrcV菌株，在丰富培养基上以 Ｒif
+ Kan + Tc筛选获得三亲接合子。
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表 1．本研究所用的菌株和质粒
Table 1． Bacterial strains and plasmids used in the study
Strains and plasmids Ｒelevant characteristicsa Source reference
Xcc
Xcc 8004 Wild type strain，Ｒifr ［26］
ΔhrpG hrpG mutant of Xcc 8004，Ｒifr，Kanr ［21］
ΔhrpX hrpX mutant of Xcc 8004，Ｒifr，Kanr ［21］
ΔavrBs1 avrBs1 mutant of Xcc 8004，Ｒifr，Kanr ［21］
ΔhrcV hrcV pK18mob integration mutant of 8004，Ｒifr，Kanr ［28］
Δ3176 XC3176 deletion mutant of Xcc 8004，Ｒifr this work
C3176 Δ3176 harboring pJC3176，Ｒifr，Tcr this work
Plasmids
pK18mob Suicide plasmid in Xanthomonas campestris pv． campestris，Kanr ［29］
pK18mobsacB Sucrose-sensitive suicide plasmid，Kanr ［29］
pLAFＲJ Shuttle plasmid pLAFＲ3 derivate containing the multiple cloning sites of pUC19，Tcr ［22］
pLGUS pLAFＲ6 containing a promoterless gus gene，Tcr ［21］
pLJB pLAFＲ6 containing avrBs159 － 445，Tcr ［21］
pK3176 pK18mob containing the promoter and signal region of XC3176，Kanr this work
pKC3176 pK18mob containing the promoter and entire XC3176 gene，Kanr this work
pLGUS3176 pLGUS containing the promoter and signal region of XC3176，Tcr this work
pLJB3176 pLJB containing the promoter and signal region of XC3176，Tcr this work
pJC3176 pLAFＲJ containing the promoter and entire XC3176 gene;Tcr this work
pKD3176 A 1400-bp fusion of the flanking fragments of the XC3176 were ligated into pK18mobsacB，Kanr this work
a Ｒif = Ｒifampicin，Kan = Kanamycin，and Tc = Tetracycline．
表 2．本研究所用的引物
Table 2． Primers used in the study
Primers Primers sequence (5→3)a Purpose
XC3176F(EcoＲ I) GGGAATTC CAGGTGTTGATCTGCCGACAC
XC3176Ｒ(BamH I) GGGGATCC ATTCTTTTTCCAGGACACCTCCC
PCＲ amplification of the promoter and signal region of
XC3176
3176LF(EcoＲ I) GGGGAATTC TTCGGCAAGCATTCGGCGCTGTGTTG
3176LＲ(BamH I) GGGGGATCC CCACAGAAGTCACTGGGAAGGAACC
3176ＲF(BamH I) GGGGGATCC ATGGTTGAAAGGTGGTTTCATGCGTG
3176ＲＲ(Xba I) GGGTCTAGA TCCAACGTCCTTCTGCTGCGTACCG
deletion mutant construction of XC3176
C3176F(EcoＲ I) GGGGAATTC ATTTTTTCGGTCTTGCGCCAAGC
C3176Ｒ(BamH I) GGGGGATCC AAACCACCTTTCAACCATCG
complementation
aAdded restriction sites are underlined．
1. 3. 2 效应物转运报告系统的过敏反应检测:将待
测 Xcc 菌株培养过夜，以空白 NYG 为对照，测定
600 nm的吸收值。将菌株的 OD600调整一致后离心
收集菌体，用无菌水稀释至 OD600 = 0. 5。用经过灭
菌的微量注射器，采用压渗法将用水稀释过的菌液
从非寄主辣椒 ECW-10Ｒ 的叶背压入细胞间隙，置
于28 ℃持续光照培养。在辣椒叶压渗处，约 8 h 后
出现枯斑，即为过敏性反应，持续观察结果并照相。
1. 4 β-葡萄糖苷酸酶(GUS)的活性的检测
1. 4. 1 GUS 融合构建:用 EcoＲ I 和 BamH I 双酶
切 pK3176，获得 XC3176 启动子信号区片段，胶回
收后克隆至 pLGUS的 EcoＲ I和 BamH I位点上，获
得重组质粒 pLGUS3176。将重组质粒 pLGUS3176
通过三亲接合，分别导入十字花科黑腐病菌
Xcc 8004、ΔhrpG和 ΔhrpX菌株，在丰富培养基上分别
以 Ｒif + Tc和 Ｒif + Kan + Tc筛选获得三亲接合子。
1. 4. 2 GUS 活性定量检测:将待测 Xcc 菌株在
28 ℃过夜培养，以空白 NYG 为对照，测定 600 nm
的吸收值。将菌株的 OD600调整一致后按照 10%接
种量转接至 MMX 培养基培养 24 h 后测定 GUS 活
性。酶活定义为:1 mL 菌液在 OD600值为 1 的条件
下，每分钟水解对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷(p-
Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG)产生 1 mg
对硝基苯酚的量为一个酶活单位 1 U［31］。
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杨丽超等:十字花科黑腐病菌一个新的 III型效应物 XC3176 的鉴定． /微生物学报(2015)55(10)
1. 5 缺失突变体和互补菌株的构建
PCＲ分别扩增 XC3176 基因 OＲF 上游和下游
大约 700 bp 左右长度片段，上下游片段分别经双酶
切后连接到相同酶切位点的 pK18mobsacB 载体上，
三片段连接后转化到 E． coli DH5α 感受态细胞中，
得到的转化子经 PCＲ 验证、酶切验证和测序正确
后，通过三亲本接合方法导入到野生型 Xcc 8004 菌
株中，获得三亲接合子。三亲接合子先接种于含
Ｒif、不含蔗糖的 NYG 液体培养基中进行同源双交
换，然后梯度稀释涂板于含有 10% 蔗糖和 Ｒif 的
NYG平板上，长出的单菌落分别平行转点加 Ｒif 和
Ｒif + Kan 的 NYG 平板上，挑取在 Ｒif 生长但是在
Kan平板上不能生长的单菌落提取总 DNA 进行
PCＲ验证，验证正确的为突变体 Δ3176。
PCＲ 扩增 XC3176 基因包含启动子以及完整
OＲF的 XC3176 互补 DNA 片段，双酶切后连接至
pK18mob克隆载体上得到重组质粒 pKC3176，经测
序正确的互补片段酶切胶回收连接至 pLAFＲJ 载
体，得到重组质粒 pJC3176，三亲本接合导入突变体
Δ3176，用含有 Ｒif + Tc的 NYG平板筛选，得到互补
菌株 C3176。
1. 6 寄主植物满身红萝卜上的致病性检测以及菌
株在寄主内生长情况的测定
选取苗龄一致、大小相近的 5 叶期的满身红萝
卜苗作为供试寄主植物。所用的接种方法是剪叶
法，每盆苗剪 2 片叶，为距心叶最近的全展叶及其内
侧相邻的一片叶(3、4 位叶) ，每一处理重复 3 盆或
以上。将过夜培养的 Xcc菌株，用 NYG稀释到一致
浓度(OD600为 0. 001) ，用经过灭菌的剪刀蘸取菌
液，在叶片距叶尖 1 cm 处垂直于中轴叶脉剪断，在
剪断过程中停留 5 s，25 － 30 ℃保湿培养 24 h 后继
续在温室 25 － 30 ℃培养。接种后按天观察记录，观
察病症变化，第 10 d用直尺量取病斑长度。
为了检测菌株在寄主满身红上的生长情况，从
接种后的当天开始，每隔一天每个菌株取 3 片叶子，
用 75%酒精进行表面消毒后，在超净工作台中用灭
菌后的研钵研磨，并按一定梯度稀释，涂布于含有相
应抗生素的平板上，放置于 28 ℃培养 3 d 后计算每
片叶片上的细菌数，并取对数绘制叶内生长曲线，每
个样本进行 3 个生物学重复。
1. 7 生物信息学分析
通过 KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes网站(网址:http:/ /www． kegg． jp /kegg /)获
取基因序列。通过 NCBI 网站的 protein blast 功能
(网址:http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi)分
析基因同源性和一致性。通过 SMAＲT 软件(网址:
http:/ / smart． embl-heidelberg． de /)分析预测蛋白结
构域。
2 结果和分析
2. 1 XC3176 具有水平转移特征
通过 NCBI网站的 blastp功能分析已鉴定的 III
型效应物 XC3177 的同源性可知，XC3177 在黄单胞
菌属中相对比较保守，但是 X． campestris pv．
raphani 756C (简称 Xcp)［32］菌株中没有 XC3177 的
同源基因，在多个黄单胞菌菌株中并不与旁侧的基
因位于相同的基因簇，具有水平转移特征。分析
XC3177 旁侧基因的保守性可知，XC3175 几乎存在
于所有黄单胞菌菌株中，且氨基酸一致性大于
90%。XC3176 在 Xcp中没有同源基因，而在黄单胞
菌属的其他菌株中较保守，但是在一些菌株中不与
Xcc 8004 中的旁侧基因相邻，如 X． axonopodis Xac
29 － 1，在其它属的病原细菌中没有同源基因，与
XC3177 一样具有水平转移特征。XC3178 在黄单胞
菌属的菌株中只在 Xcc 8004、X． campestris pv．
campestris ATCC 33913［33］ 和 X． campestris pv．
campestris B100［34］三个菌株中存在同源基因，具有
典型的水平转移特征。XC3177 和旁侧基因保守性
分析结果显示 XC3175 水平转移特征弱，XC3176、
XC3177 和 XC3178 具有典型水平转移特征。一般
III型效应物具有 N端分泌和转运信号区，50 到 100
个氨基酸残基［35］，XC3178 只有 89 个氨基酸残基，
虽然具备水平转移特征但不具备 III 型效应物的特
征，XC3177 已被鉴定为 Xcc 8004 的 III型效应物，因
此 XC3176 被作为候选基因进行 III 型效应物的鉴
定。
2. 2 XC3176 为依赖 hrcV 分泌的新的 III 型效应
物
以 Xcc 8004 的 DNA 为 模 板，XC3176F、
XC3176Ｒ为引物，用 Ex Taq 酶扩增 XC3176 启动子
及信号区 DNA片段，产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳
证实，符合设计要求，得到长度为 904 bp 的 DNA 片
段。将扩增的 XC3176 启动子及信号区 DNA 片段
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和 pK18mob载体分别用 EcoＲ I /BamH I 双酶切，然
后连接，转化。所得转化子提质粒进行 EcoＲ I /
BamH I双酶切鉴定，证实 XC3176 启动子及信号区
DNA片段已成功地克隆到 pK18mob上，酶切正确的
阳性克隆送至北京六合华大基因股份有限公司测
序，测序正确的重组质粒命名为 pK3176。将测序正
确的 pK3176 经 EcoＲ I /BamH I 双酶切，克隆至报告
质粒 pLJB，获得重组报告质粒 pLJB3176。
将 Xcc 8004、ΔavrBs1 /pLJB3176 和 ΔhrcV /
pLJB3176 在非寄主辣椒 ECW-10Ｒ 上检测过敏反
应，结果显示 Xcc 8004 和 ΔavrBs1 /pLJB3176 能在
ECW-10Ｒ 上引发典型的过敏反应，而 ΔhrcV /
pLJB3176 和 H2O不能引发过敏反应，如图 1。结果
表明 XC3176 是依赖于 hrcV分泌的 III型效应物。
图 1． 报告菌株在辣椒 ECW-10Ｒ植株上过敏反应的检测
Figure 1． HＲ test on pepper ECW-10Ｒ． 1. the wild-type strain 8004;
2. ΔavrBs1 /pLJB3176;3. H2O;4. ΔhrcV /pLJB3176．
2. 3 hrpG 和 hrpX 正向调控 III 型效应物基因
XC3176
hrpG和 hrpX是 III型分泌系统关键的两个调控
基因，正向调控大多数 III型效应物的表达。为了检
测新鉴定的 III 型效应物 XC3176 是否受到 hrpG 和
hrpX的调控，构建了 XC3176 启动子与信号区融合
GUS报告质粒 pLGUS3176，并分别导入到野生型菌
株 Xcc 8004、突变体 ΔhrpG和 ΔhrpX。在 III 型分泌
系统受到诱导表达的 MMX 培养基中检测报告菌株
的 GUS 活性，结果显示如图 2，ΔhrpG /pLGUS3176、
ΔhrpX /LGUS3176 与 8004 /pLGUS3176 的 GUS 酶活
相比显著降低(t-test，P＜0. 01) ，表明 XC3176 基因
的表达受 hrpG、hrpX基因调控。
2. 4 XC3176 基因影响 Xcc 8004 在寄主满身红萝
卜上的致病性
为了检测新的 III 型效应物基因 XC3176 是否
与 Xcc 8004 致病相关，本研究构建了 XC3176 的缺
图 2． GUS报告菌株在 MMX 培养基中的 GUS 酶
活检测
Figure 2． Quantification assay for GUS activities of reporter
strains in MMX medium．
失突变体 Δ3176 以及互补菌株 C3176 用以检测致
病性。以野生型 Xcc 8004 为正对照，ΔhrpG 为负对
照，将 XC3176 缺失突变体剪叶接种到寄主满身红
萝卜上检测菌株致病性。致病性试验结果如图 3-A
所示，结果显示 XC3176 突变后，致病力与野生型菌
株 Xcc 8004 相比显著降低(t-test，P＜0. 01) ，互补菌
株能补回至野生型菌株的致病力水平。效应物基因
XC3176 是十字花科黑腐病菌的一个致病相关基因。
通过叶回收实验检测菌株在寄主满身红萝卜上的生
长情况如图 3-B，结果显示突变体 Δ3176 以及互补
菌株 C3176 与野生型 Xcc 8004 相比生长没有差异，
而负对照 ΔhrpG 与野生型相比在寄主内的生长水
平显著降低。
3 结论和讨论
通过 AvrBs1 报告系统的过敏反应检测证实
XC3176 是一个依赖于 hrcV 分泌的 III 型效应物。
ΔavrBs1 /pLJB3176 能产生过敏反应说明 XC3176 的
启动子区与信号区能够使鉴定系统中的 AvrBs1 通
过 T3SS分泌出去，在具有 Bs1 抗性的辣椒苗 ECW-
10Ｒ上引发过敏反应。而 HrcV是 III型分泌系统的
装置蛋白，ΔhrcV /pLJB3176 不能产生过敏反应揭示
了 hrcV的缺失导致 III型分泌系统无法正常组装使
得 XC3176 启动子区与信号区和 avrBs1 所形成的嵌
合蛋白无法分泌出去，这也说明了 XC3176 的分泌
依赖于 hrcV。
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杨丽超等:十字花科黑腐病菌一个新的 III型效应物 XC3176 的鉴定． /微生物学报(2015)55(10)
图 3． 野生型和突变体菌株在寄主满身红萝卜上的致病性
检测
Figure 3． Virulence assay on host plant Chinese radish of the mutant
and wild type strain．
XC3176 受到 hrpG、hrpX 正向调控，表现为
ΔhrpG /pLGUS3176、 ΔhrpX /LGUS3176 与 8004 /
pLGUS3176 的 GUS 酶活相比显著降低。目前已有
的研究发现 III型效应物一般都受到 HrpX 的调控，
在 HrpX直接调控的基因的启动子区域一般都有一
段保守的 DNA 序列 TTCGB-N15-TTCGB，在 XC3176
的启动子区既没有严谨的 PIP-box，也没有不严谨的
PIP-box，因此 HrpX对 XC3176 的调控是否为直接调
控还需要进一步实验证实。也存在一种可能是
HrpX直接调控另一个含有 PIP-box 的调控基因，再
由这个含有 PIP-box的基因调控 XC3176 的表达。
许多 T3SEs存在功能上的冗余且一般与已知功
能的蛋白没有同源性，因此单个 T3SE 的致病性可
能很难被检测到［36］。XC3176 突变后致病性与野生
型菌株相比明显降低。在 Xcc 8004 菌株中已经鉴
定的 III型效应物中，单个 T3SE 突变后影响致病性
的还有 XopXccN［21］、XopXccE1、XopXccP、XopXccQ、
XopXccＲ1 和 XopXccLＲ［22］，说明 Xcc T3SEs 对该植
物病原细菌的致病性是极其重要的，这可能与 Xcc
缺乏 TAL效应物有关。
XC3176 基因注释为保守假定蛋白，生物信息学
分析未能发现典型结构域。XC3176 作为 III型分泌
效应物进入植物将行使什么功能、在植物中的靶标
是什么以及它被转运至植物细胞后是如何参与病原
微生物与植物互作的，都值得进一步研究。
生物信息学分析 XC3178 在大多数黄单胞菌的
菌株中均不存在同源基因，具备典型的水平转移特
征。III型效应物通常在 N 端有 50 － 100 个氨基酸
残基的序列是分泌和转运信号区［35］，XC3178 只有
89 个氨基酸残基，不具有 III 型效应物的分子特征，
因此本研究并没有把 XC3178 作为 III 型效应物的
候选基因，但 XC3178 是否与 XC3177、XC3176 分泌
转运有关值得进一步研究。
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Identification of a new type III effector XC3176 in
Xanthomonas campestris pv． campestris
Lichao Yang1，Hua Su1，Feng Yang1，Huahua Jian1，Min Zhou1，Wei Jiang1，2，
Bole Jiang1，2*
1 College of Life Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，Guangxi Zhuang Autonomous Ｒegion，
China
2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources，Nanning 530004，Guangxi
Zhuang Autonomous Ｒegion，China
Abstract:［Objective］Type III secretion system (T3SS)is essential for many phytopathogenic bacteria to cause disease
in susceptible host plants and to elicit a hypersensitive response in resistant host and non-host plants． Xanthomonas
campestris pv． campestris (Xcc)uses T3SS to deliver T3SS effectors (T3SEs)directly into host cells，where they play
important roles in pathogenesis． The aim of this study was to identify a new T3SE in Xcc．［Methods］ To validate if
XC3176 is a T3S effector translocated into plant cells，the promoter and signal region of XC3176 were fused to the plasmid
pLJB of harboring HＲ-inducing AvrBs1 C-terminal domain lack of 58 N-terminal amino acid residues． The recombinant
plasmid pLJB3176 was introduced by triparental conjugation into ΔavrBs1 and ΔhrcV． Hypersensitive response induced by
the obtained strains ΔavrBs1 /pLJB3176 and ΔhrcV /pLJB3176 were examined on the pepper ECW-10Ｒ． To determine
transcription of XC3176，GUS fusion report strains were constructed． The virulence of Xcc strains was investigated on the
Chinese radish by the leaf-clipping method． ［Ｒesults］Hypersensitive response was elicited on the pepper ECW-10Ｒ by
the strain ΔavrBs1 /pLJB3176，but not ΔhrcV /pLJB3176． The GUS activities in the mutant strains ΔhrpX and ΔhrpG
were significantly lower than that in the wild type Xcc strain． The mutant of XC3176 reduced virulence significantly and
the complementary strain C3176 could restore the virulence as the wild-type strain． ［Conclusion］XC3176 is a T3SS-
dependent effector of Xanthomonas campestris pv． campestris． The expression of XC3176 is regulated by hrpG and hrpX．
XC3176 is required for the full virulence of Xcc 8004．
Keywords:Xanthomonas campestris pv． campestris，XC3176，T3SEs，hrpG，hrpX
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