全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):８４２－８４７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０１００９
秦新民,万珊,李惠敏,等．沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析[J]．广西植物,２０１５,３５(６):８４２－８４７
QinXM,WanS,LiHM,etal．CloningandsequenceanalysisofinorganicpyrophosphatasegenefromCitrusgrandisvar．shatianyu[J]．Guihaia,２０１５,３５
(６):８４２－８４７
沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析
秦新民１,万　珊２,李惠敏１,覃屏生１,张　渝１
(１．广西师范大学 生命科学学院 珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室,
广西 桂林５４１００４;２．洛阳理工学院 环境工程与化学系,河南 洛阳４７１０２３)
摘　要:植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲
缘关系很相近的花粉的一种遗传机制.无机焦磷酸酶(inorganicpyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方
面起重要作用.该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了２对特
异引物５′ＧGSP１,５′ＧnGSP１,３′ＧGSP２and３′ＧnGSP２,通过SMARTＧRACEPCR技术从所构建的沙田柚花柱抑
制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件
对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析.结果表
明:IPPase基因cDNA全长为１１３６bp(GenBank登录号为KF９９０４７４),开放阅读框(ORF)全长为６５４bp,共
编码２１７个氨基酸,包括１７０bp５′UTR和３１２bp的３′UTR;编码的蛋白质的分子量为２４．４kDa,等电点为
５．９６;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进
行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为３．２１,最小值约为Ｇ２．９８,属于亲
水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP 基因高度同源;
序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populustrichocarpa)和橡胶树(HeveabraＧ
siliensis)IPPase基因均为８７％;氨基酸序列与克莱门柚(Citrusclementina)无机焦磷酸酶完全一致.该研究
结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础.
关键词:沙田柚;无机焦磷酸酶;全长cDNA;基因克隆;序列分析
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０８４２Ｇ０６
Cloningandsequenceanalysisofinorganicpyrophosphatase
genefromCitrusgrandisvar．shatianyu
QINXinＧMin１,WANShan２,LIHuiＧMin１,QINPingＧSheng１,ZHANGYu１
(１．CollegeofLifeSciences,KeyLaboratoryofEcologyofRareandEndangeredSpeciesandEnvironmentalProtection,
GuangxiNormalUniversity,Guilin５４１００４,China;２．DepartmentofEnvironmentalEngineeringand
Chemistry,LuoyangInstituteofScienceandTechnology,Luoyang４７１０２３,China)
Abstract:SelfＧincompatibility(SI)istheprevalenceofphenomenonintheprocessofplantreproduction,itisaninＧ
traspecificreproductivebarrieradoptedbyangiospermsthatalowsthepistiltodistinguishbetweenself(geneticaly
related)andnonＧself(geneticalyunrelated)polen．Inorganicpyrophosphatase(IPPase)playimportantrolesinreguＧ
latingthegrowthanddevelopmentinplants．InordertobetterunderstandthemechanismofIPPgeneintheselfＧinＧ
compatibilityofCitrusgrandisvar．shatianyu,theinorganicpyrophosphatasegeneofC．grandisvar．shatianyuwas
clonedandphysicochemicalpropertiesofpyrophosphatasewereanalyzed．ThetotalRNAwasisolatedfromstyleof
收稿日期:２０１４Ｇ０８Ｇ０７　　修回日期:２０１４Ｇ１０Ｇ２７
基金项目:国家自然科学基金(３１３６０４７７);广西教育厅基金项目(２０１３YB０３６).
作者简介:秦新民(１９５６Ｇ),男,广西灵川人,教授,主要从事植物分子生物学等教学与研究,(EＧmail)xmqin＠mailbox．gxnu．edu．cn.
C．grandisvar．shatianyuusedthetotalRNAPurificationSystem(Invitrogen)andfolowingthemanufacture′sproＧ
tocols．AccordingtotheESTsequence(internalfragmentofinorganicpyrophosphatasegene)insuppressionsubtracＧ
tivehybridizationlibrariesofC．grandisvar．shatianyustyle,４specificprimers５′ＧGSP１,５′ＧnGSP１,３′ＧGSP２and３′Ｇ
nGSP２weredesignedforamplifying３ＧRACEand５ＧRACEofthegene．ThefulＧlengthsequencesofcDNAofinorＧ
ganicpyrophosphatasegenewereobtainedfromsuppressionsubtractivehybridizationlibrariesofC．grandis
var．shatianyustylebytheSMARTＧRACEPCRmethod．AcomparisonofthesimilarityofthefulＧlengthcDNAseＧ
quenceoftheinorganicpyrophosphatasegene wasperformedinthe GenBankdatabaseusedtheBLAST
program．DNAmansoftwarewasusedforminoacidsequenceandhomologyanalysis．Predictionofmolecularweight,
isoeletricpoint(pI)andhydrophobicitywereperformedbyusingonlinesoftwareExpASyandDNAman．A１５０bp
bandin３ＧRACE,anda９００bpbandin５ＧRACEwereclonedbynestedandnonnestedPCRmethod．ForthefulＧ
lengthcDNAsequences,themiddlesequence,３ＧRACEand５ＧRACEsequenceoftheinorganicpyrophosphatasegene
weresplicedandformedthefulＧlengthcDNAsequences．Asaresult,thecDNAofinorganicpyrophosphatasewas
１１３６bpinlengthcontainingan６５４bpopenreadingframe(ORF),whichencodedaproteinof２１７aminoacidswitha
１７０bp５untranslatedregion(５UTR)anda３２１bp３UTR．ThesequenceoftheclonedcDNAoftheinorganicpyroＧ
phosphatasefromC．grandisvar．shatianyuwasregisteredinGenBankundertheaccessionNo．KF９９０４７４．InaddiＧ
tion,throughtheDNAmansoftwareanalysis,thededucedmolecularweightofencodedproteinofthefulＧlengthcDＧ
NAsequencewas２４．４kDaandtheoreticalpIvalueof５．９６．ProteindomainanalysisshowedthatIPPaseofC．granＧ
disvar．shatianyuandpyrophosphatasehavethesameconserveddomain．BioinformaticsanalysisshowedthattheIPＧ
Pasegenewasahydrophilicproteinwithoutanysignalpeptide,hasnowindedhelixstructureandtransmembranedoＧ
main．Theful lengthinorganicpyrophosphatasecDNAfrom C．grandis var．shatianyu wasclonedand
characterized．BlastnsearchresultsshowedthatthesequenceofIPPgeneofC．grandisvar．shatianyuwashighly
homologouswithIPPgeneofvarietyplants．ThehomologyanalysisindicatedthatC．grandisvar．ShatianyuIPPase
geneshared８７％nucleotidesequencehomologywithPopulustrichocarpaandHeveabrasiliensisIPPase,and１００％
aminoacidsequencehomologywithCitrusclementinaIPPase．TheresearchresultswouldprovidethebasisforfurＧ
therexplorationofthefunctionofinorganicpyrophosphataseinselfＧincompatibilityofC．grandisvar．shatianyu．
Keywords:Citrusgrandisvar．shatianyu;inorganicpyrophosphatase;fulＧlengthcDNA;genecloning;seＧ
quenceanalysis
　　自交不亲和性(selfＧincompatibility,SI)广泛存
在于被子植物中.所谓自交不亲和性是植物雌蕊的
柱头或花柱可以识别自体或异体花粉,并抑制自体
花粉萌发或生长的一种特性,在被子植物的有性生
殖过程中自交不亲和性对于避免近亲繁殖有很重要
的作用(Takayamaetal．,２００５).因此,对自交不亲
和性的研究在植物生殖学和杂交优势利用等方面具
有重要的理论和应用价值.
沙田柚为广西特产水果之一,属配子体高度自
交不亲和果树.目前,关于沙田柚自交不亲和的形
态学、细胞学、蛋白质化学等方面的研究取得一定进
展,确定了沙田柚自交不亲和性类型、花粉管在花柱
中生长的受阻部位为花柱的１/２部位(薛妙男等,
１９９５),用IEF/SDSＧPAGE双向电泳鉴定出沙田柚
花柱特异蛋白,并测定该蛋白的分子量、等电点和
NＧ末端氨基酸序列(杨继华等,２００１).秦新民等
(２００４)对沙田柚花粉管特异蛋白进行了分离和鉴
定.花柱通道细胞中特异蛋白(薛妙男等,２００１)和
花粉管中特异蛋白产生的部位及分布(秦新民等,
２００９)得到确定.但有关沙田柚配子体自交不亲和
的相关基因克隆的研究尚未见报道.为获取沙田柚
配子体自交不亲和相关基因,本文在构建沙田柚自
交和异交花柱消减文库并获得大量EST序列的基
础上(秦新民等,２００８),采用SMARTＧRACE技术
克隆沙田柚花柱无机焦磷酸酶基因全长cDNA,并
进行生物信息学分析,旨在为深入研究沙田柚自交
不亲和分子机理提供理论基础.
１　材料与方法
１．１材料
沙田柚采自桂林市雁山文家村果园１０年生结
果树.在盛花期对其样树进行人工自交授粉,３d
后收集自交授粉花柱,截取花柱１/２部位上下３
３４８６期　　　　　　　　秦新民等:沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析
mm部分立即放入液氮中,Ｇ７０℃保存备用.
１．２引物设计
依据本实验室所构建的沙田柚自交不亲和花柱
抑制性消减文库的一条EST序列(３１７bp),设计下
列引物:５′ＧGSP１:５′ＧATACCATCATCCAGTTTC
ACGGGCＧ３′;５′ＧnGSP１:５′ＧGATCAAACGACTAC
CGCCTCAAGCＧ３′;３′ＧGSP２:５′ＧACCTGAGTGAT
AGATTCGGTCGTGTGＧ３′;３′ＧnGSP２:５′ＧACGCＧ
CCGTGAAACTGGATGATGGTＧ３′.
１．３方法
１．３．１总RNA的提取和cDNA第一链的合成　总
RNA的提取采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)
并参照其操作手册进行.
１．３．２ 无机焦磷酸酶基因的 PCR 扩增 　 按照
SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit说明书
中的操作步骤先分别合成３′和５′端的第一链
cDNA,作为后续反应的模板;再分别进行３′和５′端
非嵌套PCR和嵌套PCR,PCR反应体系及反应程
序如下:非嵌套PCR(２５μL体系):１０× Bufer５
μL,３′或５′端的第一链cDNA１μL,３′或５′端引物１
μL,UPM 引物２．５μL,dNTPMix(１０mmol􀅰LＧ１)
０．５μL,ExTaq酶(５U􀅰μLＧ１)０．２μL,ddH２O１５．３
μL,共计２５μL.反应程序为９４℃,３０s;７２℃,３
min,５个循环;９４ ℃,３０s;７０ ℃,３０s;７２ ℃,３
min,５个循环;９４ ℃,３０s;６８ ℃,３０s;７２ ℃,３
min,２７个循环.
将非嵌套 PCR 产物稀释５０倍后作为嵌套
PCR反应的模板.反应体系及程序如下:嵌套PCR
(２５μL体系)为１０×Bufer２．５μL,５０倍稀释后的
非嵌套PCR产物１μL,３′或５′端巢式引物０．５μL,
NUP引物０．５μL,dNTPmix(１０mmol􀅰LＧ１each)
０．５μL,ExTaq酶(５U/μL)０．２μL,ddH２O１９．８
μL,共计２５μL.反应程序为９４℃,４min;(９４℃,
３０s;６５℃,３０s;７２℃,１min),２５个循环;７２℃,１０
min.取３μL嵌套PCR产物１．２％琼脂糖凝胶电泳
检测,其余PCR产物按QIAquickPCRPurification
Kit凝胶回收试剂盒说明书进行.DNA回收纯化
将ADC的３′、５′端PCR产物回收纯化后连接到
pMD１９ＧTVector中,涂板(LB＋Amp)过夜培养后
进行菌落PCR,挑选阳性克隆送上海生工测序.
１．３．３拼接cDNA序列的全长序列的生物信息学分
析　根据得到的５′和３′片段以及已知的EST序列,
拼接出无机焦磷酸酶基因全长cDNA 序列,登陆
NCBI网站(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)将得
到的全长序列用BLAST软件搜索,进行同源性分
析.运用 NCBIORFFinder来查找序列的开放性
阅读框(ORF).运用软件DNAman和Expasy对
序列分析并对氨基酸序列进行结构的预测.
２　结果与分析
２．１总RNA的提取
紫外分光光度计检测总RNA在波长２６０nm、
２８０nm处的吸光值,得出A２６０/A２８０的比值在１．９~
２．０之间,说明所提取的总RNA纯度较高.１．２％
琼脂糖凝胶电泳检测,总 RNA的２８SrRNA、１８S
rRNA两条带清晰锐利,前者较后者的亮度比为
２∶１(图１),表明总RNA未出现降解,完整性较好.
图１　沙田柚自交花柱总RNA电泳图
Fig．１　ElectrophoretogramoftotalRNAofselfＧpolinated
styleinCitrusgrandisvar．shatianyu
图２　IPP 基因３′RACE扩增结果
M．DNA分子量标记 (DLＧ２０００),下同.
Fig．２　ResultofIPP３′RACEamplification
M．DNAMarkerDLＧ２０００,thesamebelow．
２．２无机焦磷酸酶基因的３′RACE和５′RACE结果
按照１．３．２所述的非嵌套和嵌套PCR方法,获
得了酶３′和５′的RACE嵌套产物,并用１．２％琼脂
糖凝胶电泳检测(图２,图３).从图２和图３可以看
４４８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
出,无机焦磷酸酶基因的３′和５′RACE嵌套产物的
序列长度约１５０bp和９００bp.
２．３拼接和全长基因的生物信息学分析
２．３．１全长cDNA分析　将测序得到的５′RACE和
３′RACE的片段与已知EST序列拼接到了无机焦
磷酸酶基因全长cDNA序列,使用NCBI网站上的
NCBIORFFinder和生物信息学软件DNAman进
行分析,该序列全长１１３６bp(GenBank登录号为
KF９９０４７４),包 含 １ 个 ６５４bp 的 开 放 阅 读 框
(ORF),编码２１７个氨基酸,同时包括１７０bp５′UTR
图３　IPP 基因５′RACE扩增结果
Fig．３　ResultofIPP５′RACEamplification
图４　IPP 基因cDNA序列和推测的氨基酸序列　起始密码(ATG)和终止密码(TAG)用下划线表示.
Fig．４　NucleotidesequenceofIPPcDNAandthededucedaminoacidsequence
Thestartcodon(ATG)andthestopcodon(TAG)weresingleＧunderlined．
和３１２bp的３′UTR(图４).
２．３．２ 同源性分析　Blastn的结果显示,沙田柚
IPP 基 因 与 多 种 植 物 的 无 机 焦 磷 酸 酶 基 因
(inorganicpyrophosphatase)的核苷酸序列高度同
源,包括毛果杨(Populustrichocarpa)８７％,橡胶树
(Heveabrasiliensis)８７％,葡萄 (Vitisvinifera)
８６％.Blastx 结 果 显 示,与 克 莱 门 柚 (Citrus
clementina)推测为无机焦磷酸酶的氨基酸序列完
全一致,与橡胶树预测是无机焦磷酸酶的氨基酸序
列同源性为９３％、与毛果杨９１％、蓖麻(Ricinus
communis)９１％、葡萄８８％.由此推测该基因为沙
田柚无机焦磷酸酶(图５).将编码的氨基酸序列在
５４８６期　　　　　　　　秦新民等:沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析
图５　６种植物无机焦磷酸酶氨基酸序列比对　１．沙田柚;２．克莱门柚;３．橡胶树;４．蓖麻;５．毛果杨;６．葡萄.
Fig．５　AlignmentofaminoacidsequencesofIPPasefromsixspeciesofplants　１．Citrusgrandisvar．shatianyu;
２．C．Clementina;３．Heveabrasiliensis;４．Ricinuscommunis;５．Populustrichocarpa;６．Vitisvinifera．
图６　IPP 基因的保守结构域示意图
Fig．６　ConserveddomainsofIPPgene
Blastp里搜索,发现与焦磷酸酶(Pyrophosphatase,
PPase)具有相同保守序列(图６).
２．３．３编码蛋白质的分析和预测　运用DNAman可
得出,该基因编码的蛋白质分子量(MW)为２４．４kD,
等电点pI为５．９６.通过DNAman对蛋白质序列进行
疏水性分析(图７).从图７可以看出,所编码的肽链
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图７　沙田柚PPase蛋白质疏水性分析　横坐标为编码
的氨基酸顺序;纵坐标为亲/疏水值;“－”表示亲水性;“＋”表
示疏水性.
Fig．７　HydrophobicityanalysingofPPaseinCitrus
grandisvar．shatianyu　Abscissaistheaminoacidsequenceof
theencodedprotein;ordinateistheproＧhydrophobicvalue;“－”
representshydrophilic;“＋”referstohydrophobic．
中疏水性最大值约为３．２１,最小值约为Ｇ２．９８.用
Expasy在线分析软件,预测该蛋白是亲水性蛋白,没
有跨膜区域.
３　讨论与结论
无 机 焦 磷 酸 酶 (inorganicpyrophosphatase,
PPase,EC３．６．１．１)是以焦磷酸(PPi)为底物的水解酶,
该酶广泛分布于自然界,参与多种代谢途径中所形成
的PPi的水解,释放能量,为各种生理机制提供能源,
调节生物的生长和发育(Paceetal．,２０１１;Mayetal．,
２０１１;GomezＧGarctaetal．,２００７).无机焦磷酸酶参与
了植物自交不亲和的作用,Cabrilacetal．(２００１)在罂
粟属中发现蛋白质磷酸化参与了自交不亲和性反应.
在Ca２＋调解的细胞内信号途径中,有两个花粉蛋白
的磷酸化水平增加,一个是２６kD,一个是６８kD,命
名为p２６、p６８.这种磷酸化是SI特异性发生,因为它
不受亲和SＧ蛋白和热变性SＧ蛋白的刺激(Ruddet
al．,２００３;Ohietal．,２００３).Ruddetal．(１９９６)发现自
交不亲和反应中,p２６的磷酸化迅速发生,最初在９０s
内就可观察到,且会伴随自交不亲和作用持续４００s,
导致花粉管尖端生长受到抑制.通过对p２６磷酸化
蛋白基因的克隆和产物特性鉴定显示,它是一个可溶
性的无机焦磷酸酶,p２６蛋白与可溶性的无机焦磷酸
具有高达８０％的序列同一性,而无机焦磷酸是细胞
膜和细胞壁合成所需的一个重要的酶,也就是说在自
交不亲和反应中p２６的磷酸化可能使其焦磷酸酶活
性降低或钝化,导致花粉管不能合成生长过程中细胞
膜和细胞壁所需要的成分,因此花粉管停止生长
(Sassaetal．,１９９７).与p２６相比,p６８在自交不亲和
反应中的磷酸化比较晚,而且不依靠Ca２＋.但目前
对其研究还不是很清楚,p６８的磷酸化可能参与了SI
信号途径的后期阶段(Ruddetal．,２００３).Barendet
al．(２００６)研究结果也证明,抑制罂粟花粉中sPPase
活性后,花粉管生长也受到严重抑制.
目前,茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、罂粟
科(Papaveraceae)植物的配子体自交不亲和研究取得
了较大进展,提出了与SＧ核酸酶(SＧRNase)相关的
GSI信号转导和与花粉管胞质自由钙离子相关的GSI
信号转导２种假说(胡彬等,２０１２).沙田柚属芸香科
植物,其配子体自交不亲和的分子机制尚未见报道.
无机焦磷酸酶分为两类:一类是存在于细胞浆和
细胞器基质中的可溶性酶类,另一类是与膜结合的不
可溶性酶类,即膜结合焦磷酸酶.通过对所克隆的沙
田柚无机焦磷酸酶蛋白质分析,该蛋白属于亲水性蛋
白,没有跨膜区域,与Cabrilacetal．(２００１)在罂粟属
植物中发现的p２６蛋白一样为可溶性无机焦磷酸酶,
参与细胞膜和细胞壁合成.推测在沙田柚自交不亲
和反应中无机焦磷酸酶磷酸化可能使其焦磷酸酶活
性降低或钝化,导致细胞生长过程中细胞膜和细胞壁
所需要成分的合成受到影响,从而参与沙田柚自交不
亲和性反应.其机理有待今后深入研究.
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phosphatestarvationresponsivegeneAtPPsPaseIencedesa
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