全 文 ：　1997-07-21收稿
　第一作者简介:陈腾土 , 男 , 1947年出生 , 副研究员, 长期从事沙田柚、 柑桔的试验研究工作。
＊国家自然科学基金、 广西自然科学基金资助项目
沙田柚花柱蛋白对花粉管生长的影响＊
　陈腾土　　　　　　　杨小华　薛妙男
(广西柑桔研究所 , 桂林 541004)　　(广西师范大学生物系 , 桂林 541004)
摘　要　本文以沙田柚及其授粉树种酸柚为材料 , 对其花粉在不同培养介质中的萌发率进行
测定 , 筛选了 0.2 ～ 0.4 mol/L聚乙二醇-400 (PEG -400)+0.01%硼酸作为花粉萌发介
质 。用授粉后 3 d的花柱提取液进行沙田柚 、酸柚花粉萌发抑制实验 , 花柱提取液对自交花
粉萌发无抑制作用 , 明显地抑制花粉管的生长 。其中以花柱提取液的 35%饱和度硫酸铵级
分对花粉管伸长的抑制最明显 。模拟了花粉在雌蕊中的生长方式 , 进行花粉萌发生长 , 能收
集到较多的花粉管 , 为研究花粉管的 S-糖蛋白提供了材料 。
关键词　沙田柚;花柱蛋白质;花粉管生长抑制　
Effects of the stylar proteins on the pollen
tube growth of shatinyu
Chen Tengtu
(Guangxi Citrus Research Institute , Guilin 541004)
Yang Xiaohua　Xue Miaonan
(Biological Department , Guangx i Normal University , Guilin 541004)
Abstract　The pollen germination rates of shatinyu (Citrus grandis var.shatinyu Hort.)and its
pollinating plant common pomelo , in the various culture medium were measured.0.2 ～ 0.4 mol/L
PEG-400 and 0.01% H3BO3 w as the culture medium for the pollen germination.The inhibitive
experiments of the pollen germination of the two materials were carried on within the sty lar extracting
solutions in the third day after pollination.The solution didn′t inhibite the germination of the self-
pollinated pollen , but it obviously inhibited the growth of the pollen tube.The solution(at 35%am-
monium bisulphate staging)very obviously inhibited the extension of the pollen tube.The grow th
ways of the pollen in the pistil were initated , and the pollen germinated and grew.The pollen tubes
were collected for the researches about S-glycopro teins in there.
Key words　Shatinyu(Citrus grandis var.shatinyu Hort.);sty lar proteins;inhibition of the pollen
tube
广 西植 物 Guihaia　18 (2):160—164 1998年 5月　
　　配子体型自交不亲和性在雌蕊一方已经对 10多种不亲和基因相关蛋白进行了分离鉴定〔1 , 5〕。
但是 , 要对自交不亲和分子机理的全面了解 , 还取决于对花粉 S 基因编码产物的认识 , 因此克隆
分离花粉 S 基因编码产物 , 是当前国内外研究自交不亲和分子生物学的重要内容〔7 , 8 , 9 , 3〕。究其
原因 , 要从花柱中收集一定数量的花粉管的方法不多。本文以沙田柚 〔Citrus grandis
var.shatinyu Hort.〕 为材料 , 授粉树种酸柚作对照 , 采用不同的授粉方式和花粉离体萌发 , 进行
花粉萌发及其抑制试验 , 以期为研究花粉管 S基因蛋白提供材料 , 探讨沙田柚自交不亲和分子机
理 , 为克服沙田柚自交不亲和性 , 提高座果率 , 提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
沙田柚和酸柚花粉和花柱均采自桂林广西柑桔研究所实验地 , 为 10 ～ 15 a生结果树。
1.2　方法
1.2.1　沙田柚花粉离体萌发培养基的筛选　采用 4种萌发介质:①15%蔗糖 +0.01%硼酸;
②15%蔗糖 +0.01%硝酸钾 +0.02%硫酸镁 + 0.03%硝酸钙 (即 BKS -15)+ 0.01%硼酸;
③0.2 mol/L聚乙二醇-400 (PEG -400)+0.01%硼酸;④0.4 mol/L PEG -400 + 0.01%硼
酸。以酸柚花粉作对照 , 取盛花期新鲜花粉于 30 ℃下薄层振荡培养 16 h , 收集 、 镜检。
1.2.2　花柱提取液制备及其对花粉离体培养的影响　①人工自交授粉:沙田柚 ×沙田柚 , 酸
柚 ×酸柚 , 授粉后 3 d , 分别取花柱作材料;②花柱蛋白质的提取 , 提取液为 0.1 mol T ris-HCl
缓冲液 (内含 0.5 mol蔗糖 , 0.006 mol抗坏血酸 , 0.006 mol半胱氨酸)pH 8.0 , 1 g 花柱加 2
ml提取液 , 冰浴中在研钵内研磨匀浆 , 匀浆液经 12 000 r/min 冰冻离心 15 min , 取上清液 , 加
入分析纯硫酸铵至 35%饱和度进行盐析 , 离心取沉淀部分 , 上清液继续加硫酸铵至 60%饱和度
再盐析 , 离心取沉淀部分。将上述两沉淀部分分别用双蒸水透析 24 h , 再离心分别收集沉淀部分
备用;③花柱蛋白提取对花粉的离体培养 , 用 “沙 ×沙” 、 “酸 ×酸” 二种花柱的两个级分蛋白
提取液分别对沙田柚和酸柚花粉进行培养 (30 ℃)〔2 ml 0.4 mol/L PEG -400 + 2 ml蛋白提取
液 (蛋白质沉淀 0.1 g加 10 ml PBS溶解)〕, 16 h 后 , 收集 , 镜检。
1.2.3　采用不同的授粉方式进行花粉萌发和花粉管收集　①切断柱头进行截面授粉。切除柱
头后 , 将花柱切成三等分 , 分别在截面授粉后将切段插入灭菌的琼脂培养基培养 , 12 h 后 , 用毛
笔或刀片将花粉刷下或刮下 , 收集到 T riton-100 中 , 将不同段截面收集到的花粉管进行镜检 ,
并将各花柱段进行冰冻切片 , 切片厚 50 ～ 60 μm , 苯胺蓝染色 , 荧光显微镜观察;②在整个雌蕊
的 1/2处用刀切开成两段 , 将带柱头端和子房端插入消毒琼脂培养基中 , 进行断面授粉 , 按①法
进行镜检;③柱头授粉后 , 按照花粉管在花柱中通过的速度 , 在花粉管达到花柱 1/4 、 2/4 和 3/
4前 , 切断靠子房端的花柱 , 将带柱头的花柱分别插入固体培养基中 , 采用氯霉素进行外植体消
毒 , 在无菌条件下进行 , 培养 2 d 后取花柱进行镜检。或将花柱插入封口膜固定于小培养皿口
上 , 皿中放入培养液 , 进行诱导培养 , 24 h 后 , 收集花柱 , 进行镜检。
2　结　果
2.1　花粉离体培养介质的筛选 。
从花粉离体培养介质的筛选结果 (表 1)可看出在 4 种萌发介质中 , 花粉的萌发率相当 , 都
在 50%左右 , 对照酸柚比沙田柚高 8%左右 , 萌发较整齐。
161　　2期 陈腾土等:　沙田柚花柱蛋白对花粉管生长的影响
2.2　花柱蛋白提取液对花粉萌发及花粉管生长的影响 。
从试验的结果 (表 2)可看出授粉后 3 d的花柱蛋白提取液的两个硫酸铵级分中沙田柚和酸
柚花粉均能萌发 ,萌发在35 %硫酸铵级分中抑制更为明显 ,花粉管长度在10 ～ 20μm范围内
表 1　不同花粉培养基的花粉萌发率
Table 1　The germination rates of the pollens in the various pollen culture medium
培养基
Culture medium
种类
Type
花粉总数
Total of pollens
萌发个数
Number of
germinat ion
萌发率
Germinative
rate(%)
15%蔗糖 + 0.01%硼酸 沙田柚酸　柚
47
49
26
31
55.3
63.3
BKS 15
沙田柚
酸　柚
74
77
37
45
50.0
58.4
0.2 mol/ L
PEG-400 + 0.01%硼酸
沙田柚
酸　柚
78
59
38
33
48.0
55.9
0.4 mol/ L
PEG-400 + 0.01%硼酸
沙田柚
酸　柚
109
117
58
65
53.1
55.3
表 2　沙田柚和酸柚花柱蛋白提取液中花粉萌发率和花粉管长度
Table 2　The germination rates of the pollens and the leng ths of the pollen tubes in the
protein extracting solutions from the sty les of shatinyu and acid pomelo
花粉类型
Type of pollen
花柱蛋白提取液
Protein extracting
solutions of the styles
(NH4)2 SO4级 分
(NH4)2 SO4
staging(%)
第一次萌发率
the fi rst
Germinat ion rate
(%)
第二次萌发率
The second
germinat ion
rate(%)
花粉管长度
Length of
pollen tube
(μm)
沙田柚 沙 ×沙 35
60
32.3
35.3
27.3
30.3
10～ 20
15～ 25
酸　柚 沙 ×沙 35
60
37
36
38.1
36.4
20～ 40
20～ 45
沙田柚 酸 ×酸 35
60
34.2
33.5
35.5
34.3
20～ 40
20～ 45
酸　柚 酸 ×酸 35
60
40.0
41.2
41.0
39.0
20～ 45
20～ 48
(图 1), 对照酸柚花粉管长度在 20 ～ 45 μm范围内 (图 2)。由此表明 , 沙田柚花柱蛋白提取液中
存在抑制自花花粉管生长的物质 , 此物质并不抑制异源花粉管的生长。
2.3　切断柱头进行花柱切面授粉
从 1/4切段面上收集到提取液中的花粉管量很少 , 花粉管已伸入花柱 , 较难括下来 (图 3)。
2/4 、 3/4 切段面上收集到的提取液中花粉管数量较多 , 荧光显微镜观察发现花粉管短粗 , 停在
切面上较多 , 稍将切面处压破 , 每一切面可收到近 100 条花粉管 (图 4)。从花柱 1/2处将花柱掰
断后的子房端切面上花粉管的生长状态和图 4相似 , 靠柱头端的花柱切面上由于有大量分泌液 ,
花粉充分吸水 , 花粉管都分布于表面 , 是获取花粉管量最多的场所。
柱头授粉后 , 在其相对一端的 1/4切口上 , 偶而发现有花粉管伸出 (图 5), 在 2/4和 3/4断
162 广　西　植　物 18卷　　
面上见不到花粉管。
图 1　沙田柚花粉在 “沙 ×沙” 花柱蛋白提取液
35%硫酸铵级分中的萌发长度(10～ 20 μm)
Fig.1　The germination lengths of the pollens of
Shatinyu in the stylar p rotein extracting solutions
(at 35%ammonium bisulphate staging)
of shatinyu.(10～ 20 μm)
图 2　酸柚花粉在 “沙 ×沙” 花柱蛋白提取液 35%
硫酸铵级分中的萌发长度(20～ 40 μm)
Fig.2　The germination lengths of the pollens of
acid pomelo in the stylar protein ex tract ing
solutions(at 35%ammonium bisulphate
staging)of shat inyu.(20～ 40 μm)
图 3　沙田柚花柱 1/ 4切段切面上花粉管
已伸入到花柱道
Fig.3　The pollen tubes were into the
stylar canal on the 1/ 4 stylar
sect ion of shatinyu
图 4　沙田柚花柱 2/ 4和 3/ 4切段切面上花粉
管多停留在表面 , 伸入很浅
Fig.4　The pollen tubes stayed on the section and
were not long of st retching on the 2/ 4 and 3/ 4
stylar sections of shatinyu
3　讨　论
(1)花粉离体萌发培养介质一般都用蔗糖 , 我们在对花粉管壁蛋白提取纯化中 , 发现以蔗糖
为介质时 , 收集到的萌发液难以浓缩抽干。采用 0.2～ 0.4 mol聚乙二醇-400 作萌发介质 , 萌发
率和蔗糖相当 , PEG-400对细胞无毒害 , 也不为细胞所代谢 , 能提供的水势范围宽 , 而且可以
克服蔗糖介质难以浓缩抽干的缺陷 , 是一种较为理想的萌发介质。与杨中汉等〔4〕百合花粉萌发结
果是一致的。
163　　2期 陈腾土等:　沙田柚花柱蛋白对花粉管生长的影响
图 5　沙田柚花粉管从柱头相对
一端花柱的 1/ 4切口处伸出
Fig.5　The pollen tubes of shatinyu were
out of the 1/ 4 stylar section of
opposing to the stigma
　　 (2)授粉后 3d的沙田柚花柱蛋白提取液 , 不抑制
自交花粉萌发 , 但明显抑制自交花粉管生长 , 其中以
35%硫酸铵级分抑制最明显 , 说明沙田柚花柱蛋白提取
物中存在一种抑制自交花粉管生长的物质 , 此物质并不
抑制异源花粉管生长。其结果与薛妙男等〔2〕沙田柚截面
授粉及 Dickison 等〔6〕和 Jahmen 等〔10〕花烟草分离 S 糖蛋
白对花粉管生长抑制影响相一致。
(3)从表 1和表 2中看出 , 表 2 中花粉在花柱蛋白
提取液中的萌发率比表 1 萌发介质低 , 主要原因是表 1
中所用花粉采自盛花期 , 而表 2 所用花粉采自开花后期。
再者在花柱蛋白提取液中可能杂有不利于花粉萌发的物
质。
(4)我们试图从花柱中分离花粉管 , 由于沙田柚花
柱的花柱道为实心 , 数量为 12 ～ 16条 , 花粉管是在通道
细胞纤维果胶壁中通过 , 很难从中分离出来。所以采用
离体培养和花柱切面授粉的方式 , 可以收集到一定数量的花粉管 , 供研究花粉 S基因蛋白之用。
参 考 文 献
1　陈劲春.植物生殖生物学研究的一些进展.植物生理学通讯 , 1996 , 32(1):
2　薛妙男 , 陈腾土 , 杨继华.沙田柚自交和异交亲和性观察.园艺学报 , 1995 , 22(2):127～ 132
3　李　楠 , 张杏辉 , 薛妙男.沙田柚柱头表面结构及花粉管进入柱头细胞的研究.广西师范大学学报(理科版), 1995 , 13
(4):76～ 82
4　杨中汉 , 陈良甫 , 曹宗巽.用免疫亲和层析和 ELISA 测定百合花粉萌发过程中细胞分裂含量的变化.植物学报 , 1994,
36(6):430～ 436
5　Broothaerts W , et al.Petunia hybrida S-proteins ribonuclease act ivity and the role of their glycan side chains in self-incompati-
bility.Sex plan t Reprod , 1991, 4:258～ 266
6　Dickinson H G , et al.Pollen-pist il interact ion in Lilium longiflorum:the role of the pist il in controlling pollen tube growth fol-
lowing cross-and self-pollinat ions.Proc.R.Soc.London Ser-B , 1982 , 215:45～ 62
7　Doughty J , et al.interact ion betw een a coatingborne peptide the Brassica pollen grain and st igmatics(self-incompatibility)-
locus-speci fic glycoproteins.Proc Acad.Sci , 1993 , 90:467～ 471
8　Gauda T , Dumas C.Pollen-stigma in teractions and S-produts in Brassica , In “Biotechnology and ecology of pollen” .
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9　Heslop-Hauisor J.Pollen-stigma interact ion and cross-incompat ibili ty in the grasses.Science , 1982 , 215:1358～ 1364
10　Jahene W , Batterham MP , Clarke AE , et al.Inhibi tion of pollen tube grow th by isolated S-glycoproteins of Nicotiana ala-
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164 广　西　植　物 18卷