全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(1)：83— 86 2OO9年 1月
蔓花生组织培养和植株再生的条件优化
张振霞，郑玉忠
(韩山师范学院 生物系，广东 潮州 521O41)
摘 要：应用 MS为基本培养基 ，通过各种培养条件和不同激素配比，探讨蔓花生组织培养及其植株再生条
件的优化。结果显示 ：幼叶为最佳的外植体 ，在幼叶愈伤诱导过程中，不超过 12 h光照，光照强度在 21．6
moI．m ·s 均可；诱导愈伤组织的适宜培养基为 MS+O．5 mg／L6一BA+O．2 mg／L2，4一D或 MS+O．5 mg
L6一BA+2 mg／LNAA；最适的分化培养基为 MS+1 mg LTDZ+2 mg／L6一BA+O．5 mg／LNAA；最适的生根
培养基 1 2MS+1 mg／LNAA+1 mg／LPP 。
关键词 ：蔓花生 ；组织培养；愈伤组织
中图分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：1OOO一3142(2()(]9)O1一O()83一O4
C()nditi0n 0pti zati0n f0r tissue culture
0f AJP． c JP．
ZHANG Zhen-Xia，ZHENG Y Zh0ng
(D 声nr 7 删￡。厂B 0Z0g ，Hnn an五nc^e C0 ZPge，Cha0zhou 521O41，China)
Abstract：C。nditiOn optimization f0r tissue culture and regeneration of Am 5 m e，z s was stu died． The resu1ts
showed that the leaf1et was the best experimental explant；the optimized medium for cal1us was MS+O．5 H ／L6一BA
+O．2 mg／L2，4一D or MS+O．5 mg／L6一BA+O．2 mg／LNAA with．1luminati。n of 12h／d；the 0ptimized me dium for
d．ferentiati。n was MS+ 1 mg／LTDZ+2 mg／L6一BA+O．5 mg／LNAA；the op LiInized medium f。r r。Ot induction was
1 2MS+1 mg LNAA+1 mg／LP 33．
Key words：Am s “m行 s；tissue culture；calus
随着时代的发展及人们生活品位的日益提高，
会开花的草坪受到人们的青睐，已成为当前草坪植
物开发研究的一个重要领域。蔓花生(Ar“c s “一
r“” )是一种豆科蔓花生属的多年生宿根草本植
物，茎蔓生，匍匐生长，绿色期长，花蔓多且花期长，
是一种观赏性极佳的开花草坪植物。其成坪快且平
整，适用于园林绿地和公路的隔离带。但蔓花生种
子产量低，不易收种，依靠种子繁殖会限制其大面积
推广应用(郭维贤等，2。O2)。因此，需对蔓花生进行
组培快繁研究，为其快繁和工厂化育苗提供技术和
方法。
1 材料与方法
1．1材 料
蔓花生采 自于广东省潮州市韩 山师范学院校园
内。选取生长良好、无病虫害的带幼叶的枝条作为
实验材料。基本培养基：Ms(Murashige& Sk0。g，
1962)和B5(丁力，1998)；愈伤诱导培养基：基本培养
基+2，4一D+6一BA；分化培养基：基本培养基+NAA
+KT+6一BA；生根 培养基 ：l／2MS基本 培养基 +
NAA+P 3 。以上所 用植物激素 2，4一D、6一BA、
收稿 日期 ：2。o7一O8—27 修回日期 ：2。O8—06—25
基金项目：国家星火计划项目(2。O5EA780C80)；韩山师范学院青年基金[supported by the N8ti0nal spark Plan Program 0f China(2nC5EA780C8O)
Foundati0n for Young Teachers 0f Hanshan 1 achers co1ege]
作者简介：张振霞(1975一)，女，甘肃兰州市人，博士后，剐教授，主要从事生物技术及草业科学研究，(E—mail)zhangzhenxia@yah00．com．cn，
84 广 西 植 物 29卷
NAA、KT、IBA、IAA、TDZ等购 自Sigma公司。
1．2方法
(1)不同基本培养基对蔓花生愈伤组织诱导频
率的影响：分别使用 MS、l／2MS、B5基本培养基，
对蔓花生幼叶进行愈伤组织诱导。(2)不同外植体
对蔓花生愈伤组织诱导频率的影响：在 MS基本培
养基上 ，以蔓花生幼叶、成熟 叶、叶柄和茎段为外植
体进行愈伤组织诱导 。(3)2，4一D浓度对蔓花生愈
伤组织诱导率的影响：设定 O、O．1、O．2、O．5、1、2、4、
8、12 mg／L九个水平 的 2，4一D浓度 ，在 MS培养基
上对蔓花生幼叶进行愈伤组织诱导。(4)6一BA浓度
对蔓花生愈伤组织诱导率的影响：在 O．2 mg／L2，4一
D的 MS基本培养基基础上 ，设定 O、O．2、O．5、1、2、
5、1O mg／L七个不 同 6一BA浓度作为试验处理，研
究蔓花生幼叶愈伤组织诱导率。(5)不同生长素对
蔓花生愈伤组织诱导率的影响：比较 2，4一D、NAA、
IBA、IAA 四种不 同生长素对蔓花生幼叶愈伤组织
诱导的影响。(6)不同光照时间对蔓花生愈伤组织
诱导率的影响：分别以24、12、O h和自然光照条件
下培养，比较蔓花生幼叶的愈伤诱导。(7)不同细胞
分裂素对蔓花生愈伤分化的影响：在添加 2 mg／L6一
BA和 O．5 mg／I NAA的培养基上比较 1 mg／LT—
Dz和 1 mg／LKT对蔓花生愈伤的分化率的影响。
1．3培养条件
每月继代一次。培养条件为 26±2℃，每日光
照 12 h，光强 36 mo1．rr ·s～。
1．4评价指标
诱导率( )一出愈外植体数／接种外植体数×
lOO；分化率( )一出芽愈伤数／接种愈伤数×1。O。
2 结果与分析
2．1不同培养基对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
选用MS、l／2MS和B5三种培养基比较了蔓花
生幼叶愈伤组织的诱导，研究结果如表 1所示 ：MS
和B5基本培养基对蔓花生幼叶愈伤诱导率高，均
在 93 以上，1／2MS基本培养基较低。
2．2不同外植体对蔓花生愈伤组织诱导频率的影响
从表 2可见，幼叶愈 伤诱 导率最 高，达 到
1O0％，且出愈快，在接种 6 d后就出现初始愈伤化 ，
l5 d左右完全愈伤化 ，而成熟叶出愈率为 85．7l ，
且出愈时间较幼叶的慢，接种 1O d后初始愈伤化，
22 d左右完全愈伤化 ，叶柄和茎段 的出愈率和出愈
时间则更低和更迟。
表 1 不同培养基对蔓花生愈伤组织诱导频率的影响
Table 1 Influence of different media on ca1lus
initiation rate of Arn ^ s rn 已 sis
表 2 不同外植体对蔓花生愈伤组织诱导频率的影响
Tab1e 2 Influence of different explant on callus
initiation rate 0f Ar以f^ s rn e竹s
幼叶 I，eaflet 45
成熟叶 Mature leaf 28
叶柄 Peti01e 57
茎段 Stem 28
15 10O．OO
22 85．71
26 78．95
3O 53．57
2．3不同2，4一D浓度对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
如表 3所示，于 MS十6一BA的培养基中，在没
有添加2，4一D时，未能诱导出愈伤；随着2，4一D浓度
的升高，蔓花生愈伤组织的诱导率增加，在 0．2、
1．O、2．O、4．O mg／L时出愈率均达到 9O 以上，然
后随着 2，4一D浓度的增加而下降。
表 3 培养基中不同2，4一D浓度对蔓花生
愈伤组织诱导率的影响
Table 3 Influence 0f different 2，4一D concentrations
nn Pal1I】s jnitjati0n rate 0f A，诅c s d rn，2已，2s s
不同含量(mg) 接种数 出愈数 出愈率( )
Concentration No．of explants Initiated calus hitiation rate
2．4一D O
2．4一D O．1
2．4一D O．2
2．4一D O．5
2．4一D 1．O
2．4一D 2．O
2．4一D 4．O
2，4一D 8．O
2．4一D 12
O．OO
61．11
93．65
8O．OO
92．31
92．19
91．94
6O．53
27．27
2．4不同6一BA浓度对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
从表4可见，在 MS+O．2 mg／L2，4一D的情况
下，6一BA的存在对蔓花生的愈伤诱导的作用很重
要，不添加 6一BA时的愈伤诱导率是 O，而 O．5 mg／L
的6一BA对愈伤诱导有明显的促进作用，此时的诱
导率为93．65 。随6一BA浓度继续增加时，蔓花生
的愈伤诱导率反而降低，特别是 6一BA浓度大于 5
0 毖 的 诣 的 即 船
1期 张振霞等 ：蔓花生组织培养和植株再生的条件优化 85
mg／L时愈伤组织出现褐化现象。在诱导愈伤过程
中 6一BA 的促进作用在于提高叶组织 的细胞分裂能
力，使得愈伤生长加快 ，高浓度时导致愈伤的褐化严
重。低浓度的 6一BA对蔓花生愈伤诱导有促进作
用，而高浓度则容易影响愈伤组织的质量。因此采
用了 O．5 mg／L6一BA作为 蔓花生幼 叶的愈伤诱导
剂。结合表 3、4，可以看出，O．2 mg／L2，4 D+0．5
mg／L6一BA为诱导蔓花生愈伤组织的适宜浓度，此
条件下的出愈率可以达到 93．65 。
表 4 培养基中不同 6一BA浓度对蔓花生
愈伤组织诱导率的影响
Table 4 Inf1uence of different 6一BA concenLrations on
cal1l】s initiatif】n rate 0f Arnc s ra s s
不同含量(mg) 接种数 出愈数 出愈率( )
Concentrations No．of explants Initiated callus Initiation rate
6一BA O
6一BA O．2
6一BA O．5
6一BA 1．O
6一BA 2．O
6一BA 5．O
6一BA 1O．O
2．5不同生长素对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
在蔓 花 生 愈 伤 诱 导 过 程 中，比较 了 2，4一D、
NAA、IBA、IAA这 四种不同生长素的作用。从表 5
可以看出：2，4一D和 NAA对蔓花生愈伤诱导的促
进作用更明显 ，均在 9O 以上 ，只是 由 2，4 D诱导
的愈伤组织淡绿色 ，而 NAA 诱导 的则为 黄绿色；
IAA 2mg／L时也有较高的出愈率 76．47 ，IBA的
作用最不明显，在 4 mg／L时愈伤诱 导率仅为
3．17
表 5 不同生长素对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
Table 5 Influence of different auxin concentratiOns
on calus initiation rate of A f 以 刀
果。从表 6看 出：愈伤 的出愈率在 12 h和 自然光
(约 13 h)光照条件下最高 ，达到 1O0 。黑暗条件
下，蔓花生的愈伤诱导率也较高 93．75 ，只是愈伤
色泽淡黄，前两种条件下愈伤为绿色；而 24 h持续
光照条件会 降低 出愈率 ，只有 45．45 ，且愈伤较
小，色泽暗淡。
表 6 不同光照条件对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
Table 6 lnfluence of lighting time on callus
initiation rate of Ar口f矗 “r0 已 s
2．7蔓花生愈伤组织的分化
从表 7看出：蔓花生愈伤组织在含有 1 mg／L
TDZ的培养基上 ，生长 1～2周后就开始分化出小
芽，分化率为 61．11 ；而含有 1 mg／L KT的培养
基上的分化率仅为 46．27 。可见 ，1 mg／L TDZ对
蔓花生愈伤的分化效果好于 l mg／L KT。
表 7 不同细胞分裂素对蔓花生愈伤组织分化率的影响
Tah1 7 Tnfl1】ence of djfferent hormone cf)ncentration
on caIlus differentiation rate of Ar＆f，L s “rn s s
2．8再生植株的生根培养
胚状体发育成小植株最初是从胚芽出现开始 ，
紧接着叶和根发育，形成完整的再生植株。在植物
离体培养中，促根生长的基本培养基大多数使用低
浓度 的 MS培养基 ，因此 ，本试验采用了 l／2MS基
本培养基以降低元机盐浓度 ，促进生根。将诱导分
化的丛生不定芽切割成具有 2～3个不定芽的小块，
分别接入 附加 了 l mg／L NAA 和 l mg／LPP 的
1／2MS培养基，不定芽 9 d开始生根，3O d生根率
达到 95 ，幼苗株高达 1～3 cm。
3 结论
2．6不同光照条件对蔓花生愈伤组织诱导率的影响
比较了 4种光照条件对蔓花生愈伤诱导的效 蔓花生的愈伤组织诱导、分化和植株再生受多
86 广 西 植 物 29卷
种因素制约，这些因素包括不同基本培养基、培养基
中各种激素种类和浓度 、不同外植体、不同培养条件
等等 。本研究结果显示 ：蔓花生幼叶是最佳的外植
体，在幼叶愈伤诱导过程中，对光照条件的要求不
高，不超过 12 h光照 ，光照强度在 21．6 mo1·m
·s 均可；适宜诱导 蔓花生愈伤 组织 的培养基为
MS+O．5 mg／L6一BA+0．2 mg／L2，4一D或 MS+
O．5 mg／L6一BA十2 mg／LNAA；最适 的分化培养基
为 MS+ 1 mg／LTDZ+ 2 mg／I 6一BA+O．5 mg／
LNAA；最适 的生根 培养基 1／2MS+1 mg／LNAA
+l mg／LPP333。
4 讨论
不同培养基有着不同的营养成分、植物激素、添
加物 ，其不同组合及含量直接影 响到供试材料的培
养。本实验比较了 MS、1／2MS、B5培养基对蔓花
生幼叶的愈伤诱导率，发现 MS培养基对蔓花生愈
伤诱导的促进作用最为明显。
外植体对植物愈伤组织的诱导率也有明显的影
响(郑 向丽等，2。O4)。幼叶、成熟叶、叶柄和茎段四
种外植体的比较中，幼叶较好，在接种 6 d后就出现
初始愈伤化，l5 d左右完全愈伤化，而成熟叶 1O d
左右出现初始愈伤化，22 d左右完全愈伤化，叶柄
和茎段的出愈率和出愈时间则更低和更久。其原因
可能与植物激素的类 型和浓度有关 ，陈发棣等研究
发现 ，2，4一D的变化对小菊(DP r ^”7“ 0 rz 一
z “ )叶片的愈伤组织诱导率影响不大，稳定在
93 以上；但当2，4一D浓度超过 2．5 mg·L ，小菊
叶柄和茎段愈伤组织诱导率均有较明显的下降。本
实验的培养基中添加了 2，4一D，外植体愈伤组织诱
导率与陈发棣等(2。03)观察到的现象相似。
在蔓花生诱导愈伤组织过程中，当2，4一D浓度
过低时，愈伤组织诱导率也较低；O．1、O．2、O．5、l、2、
4、8、12 mg／I 八个水平的 2，4一D浓度处理中，蔓花
生幼叶出愈率从 27．27 ～93．65 变化。而 6一BA
不同浓度对愈伤组织诱导率影响相对不大，O．2、
O．5、1、2、5、lO mg／L六个浓度条件中，蔓花生的出
愈率从 67．19 ～ 93．65 变化。Bhaskaren&
Smith(199O)也指出在植物的愈伤组织诱导中，2，4一
D是通常起着决定作用的植物生长调节剂。Bai和
Tore1lo等均指出了 2，4一D对愈伤组织诱导的重要
性。Linacero＆Vazquez(199O)也证明了过高或过
低的 2，4 D浓度都不利于胚性愈伤组织的形成和分
化作用。本研究在证明了 2，4一D对蔓花生愈伤组织
诱导的重要作用的同时，也发现 了过高浓度的 2，4一
D对愈伤组织诱导的抑制作用，特别会影响愈伤组
织的质量 以及后 期 愈伤 组织 的分化 和发育。
Yamamoto等(1998)认为 2，4一D进出质膜的方式是
导致高浓度 2，4一D扰乱组织发育的原因，2，4一D进
入质膜需要 由AUX1编码的输入载体 ，但是 2，4一D
流出质膜是完全倚赖 自由扩散，外部高浓度抑制了
2，4一D的排放，导致 2，4一D在细胞 内积累。通过实
验，本研究的结论认为，诱导蔓花生幼叶愈伤组织的
适宜激素浓度为 2，4一DO．2 mg／L+6一BA0．5 mg／L，
可以获得 93．65 的出愈率。此外，比较 2，4一D、
NAA、IBA、IAA四种生长素对愈伤的作用中，2，4一
D和 NAA对蔓花生愈伤诱导的诱导率均在 90 以
上 ，IBA、IAA的诱导作用较差，考虑 2，4一D诱导的
愈伤组织淡绿色，相 比NAA诱导的黄绿色，愈伤质
量好 (吴爱忠等，1994)。
在组织培养中，用较高浓度的生长素(2，4一D)诱
导形成愈伤组织，除去生长素，或用适当浓度的活性
较低的生长素，同时添加细胞分裂素，就可以诱导芽
的形成。Cape1e等(1983)、Ozias—Akins(1989)和
Faso1o等(1989)指出，在分化培养基中添加 KT，能
促进芽的分化。本试验在添加 2 mg／L6一BA和 O．5
mg／LNAA的基础上，比较 TDZ和 KT两种细胞分
裂素的分化效果 。蔓花生 愈伤组织在含有 1 mg／
LTDz的培养基上，生长 1～2周后就开始分化出小
芽，分化率为61．11 。而含有 l mg／LKT+2 mg／
L6一BA+O．5 mg／LNAA的培养基上的分化率为
46．27
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plantand cal1us induction media(小菊悬浮细胞辐射育种初步研
(下转第 95页 Continue on page 95)
赵健等：不同激素对锦绣杜鹃的催花作用 95
(陈炳忠，2O0O)报道 NAA、IAA能促进西鹃开花的
结果不一致，也证明了植物激素因植物种类的不同
而表现出不同效果。
(2)由锦绣杜鹃花蕾长度等 5个测定指标间的
相关性分析知，花蕾大小(包括长度和宽度)与开花
期提前时间之间呈极显著正相关 ，且相关性较强(相
关系数在 0．8以上)，而花蕾大小(包括长度和宽度)
与花蕾期之间呈极显著负相关，同时花蕾大小(包括
长度和宽度)与花径之间也呈极显著正相关性(P<
O．O1)，因此，促进花蕾的发育可能是提前开花期和
提高开花质量的关键因素之一。锦绣杜鹃花芽的分
化需要一定的低温量及短 日照，然而南方冬季低温
期迟而短 ，导致花芽分化完成 的时间较 晚。可以考
虑应用 GA 等植物激素代替低温，或遮光及低温处
理使其花芽提前完成分化，在元旦或春节前一段时
间运用 GA 结合加温和补光等措施 而达到南方冬
季锦绣杜鹃催花的目的。
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