全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：181— 184 2010年 3月
松茸组织分离物的 rDNA—ITS序列鉴定
张 灵 ～，赵 琪 ，陈严平 ，孟珍贵1，李荣春1*
(1．云南农业人学 食用菌研究所 ，昆明 650201；2．云南农业大学 基础 与信息工程学院 ，昆明 650201)
摘 要：以采 自云南丽江的松茸子实体为材料 ，进行组织分离后，利用一对 ITS引物 (ITS1一ITS4)对子实体
(SR1 76B，SR172B)和分离物(SR176H，SR172H)进行了 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析 ，得到了 700 bp左右
的扩增条带 ，进一步对 ITS序列进行同源性检索 比对，结果表明 SR176H与 SR176B，SR172H与 SR172B序
列同源性均为 100 ，鉴定出该分离物就是松茸的纯培养物。
关键词 ：松茸；子实体 ；分离物；ITS序列
中图分类号 ：Q949．32 文献标识码：A 文章编号 ：1000 3142(2010)02 0181-04
Identification of cultures isolated from fruit body of
Tricholoma matsutake by rDNA-ITS sequence analysis
ZHANG I ing1一，ZHA()Qi1，CHEN Yan-PingI。
MENG Zhen-GuP．LI Rong-ChunI*
(1．1nsititution o／Edible Fungi，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2．Col ge
0，Science and Information Engineering，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China)
Abstract：A pair of general primer(ITS1 ITS4)was used to test in the amplification of the internal transcribed
spacer(ITS)region of the chromosomal DNA of fruit body of Tricholoma matsutake of I ijiang and its isolates．
The results analyzed by Agarose gel electrophoresis showed that the primers of ITS1 and ITS4 amp“fied about
700bp fragments for all samples．The ITS fragments of T．matsutalee fruit body and its corresponding isolates
were sequenced and aligned．Their sequences of SR176H and SR176B showed a 100 homogeneitv，the same
result also appeared between SR172H and SR172B．Based on these facts，SR176H and SR172H were confirmed
to be pure cultures of T．matsutahe．
Key words：Tricholoma matsutake；fruit body；mycelia；rDNA ITS
松茸(Tricholoma matsutake)是一种珍稀 的外
生菌根美味食用菌 ，其营养价值 和药用价值都很 高
(吴映明等 ，2003)，深受 日本人喜爱 ，被誉为“食用菌
之王”。人类对松茸的研究已有几百年历史 ，特别是
近几十年来 ，许多 国家在 松茸 的分类 (弓明钦 等 ，
1999)、生 物资 源 (Mankel等 ，l999)、生 态 (袁 天凤
等，2006)、半人工栽培(弓明钦等，2007)等方面都有
广泛的研究。由于松茸是菌根 菌，而菌根真菌在人
工培养基上生长 比较困难 ，同时还 由于到 目前为止 ，
仍无法应用松茸的纯培养物在人工培养条件下获得
松茸子实体 ，以证明该纯培养物就是松茸菌种 ，所以
对松茸组织分离物的鉴定成为对松茸进行各种研究
的基础和前提。为此 ，我们在进行云南松茸 自然扩
繁机理研究时通过组织分离获得分离物，并将分离
物的 ITS序列和该分离物的母本子实体标本 的 ITS
序列，以及 GenBank中的松茸 ITS序列进行了比
收稿 日期：2009 02 04 修回日期 ：2009—08一l8
基金项 目：云南省科技计划国际科技合作专项 (2006GH06)[Supported by International Cooperation Project of Yunnan Science＆ Technonolgy
Plans(2006GH06)]
作者简介：张灵(1975一)，女 ，云南保山人，讲师 ，食用菌的研究与利用专业 ，(E—mail)yyr
— km@163．COIll。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E mail：rongchunli@126．corn)
l82 广 西 植 物 3O卷
较 ，以便为更准确和便捷地对松茸种类进行鉴定和
培植研究提供技术手段和理论基础。
1 材料与方法
1．1材料来源
松茸子实体采 自云南 省丽江市拉市 乡“云南松
茸 自然扩繁机理研究”项 目实验 区。获得子实体后
进行组织分离，在预先筛选 出的专用培养基上培养
获得松茸分离物(编号 SR176H，SR172H)。对于组
织分离剩余的子实体，取其菌柄中央完好部分，用硅
胶干燥保存 (编号 SR176B，SR172B)。
1．2方法
1．2．1总 DNA 的提取 将 编号 SR176H，SR172H
的松茸分离物转培养到专用松茸培养基上，23℃下
恒温培养 47 d，刮取 白色短绒毛状的菌丝用于提取
分离 物 的 总 DNA，取 硅 胶 干 燥 的 子 实体 (编 号
SR1 76B，SR1 72B)的标本的一部分用于提取子实体
图 1 松茸子实体及分离物
Fig．1 Fruit body and mycelia isolated from Tricholoma matsutake
的总 DNA。两种材料按改进的 CTAB法提取 DNA。
提取的 DNA用 1 凝胶 电泳检测后置于一20。C冰箱
中保存备用。
1．2．2 PCR扩增 PCR仪为美 国 MJ公 司生产的
PTC一200型。引物序列 ：用于 rDNA—ITS序列 PCR
扩增反应的引物 ITS1和 ITS4由上海生工 公司合
成。序列 如 下 ：ITS1 5．_TCCGTAGGTGAACCT—
GCGG一3 。ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATAT—
GC一3 (White等 ，1990)。PCR扩增反应体系：PCR
扩增反应体系选用 25 L反应体系 ，其中包括 10×
扩增缓冲液(含 MgCI )2．5 I ，2．5 mmol／I dNTP
2 L，5／~mol／L的引物各 0．5 L，TaqDNA聚合 酶
0．25 L，DNA模板 0．4～2 L(根据所提 DNA浓
度不同而异)，用 ddH。O定容至 25 L。PCR扩增
反应程序 的热循环参数 ：PCR扩增反应程序的热循
环参数 ：94℃变性 5 min，然后进入连续 35个循环 ：
94℃变性 30 S，55℃退火 30 S，72℃延伸 2 rain，循
环结束后 72℃再延伸 10 min，最后 4℃保存。
1．2．3 PCR扩增反应结果检测 扩增反应产物取
2．0 L 点 于 塑 料 薄 膜 上 和 溴 酚 蓝 (40 蔗 糖 ，
0．25 溴酚蓝)混匀 ，点样于 l 的琼脂糖凝胶上 ，
于 1．0×TAE缓冲液 (电压为 5 V／cm)中电泳。当
溴酚蓝远离点样孑L到一定距离时(30~50 rain)，停止
电泳，将凝胶取 出，放人 EB溶液 中染色 20 min，再在
紫外凝胶成像仪(蓝盾 621)上观察并记录结果。
i．2．4 PCR扩增反应产物纯化及 测序 (1)纯化 ：
PCR扩增反应产物使用上海生工生物工程技术服
务有限公司生产的 UNIQ lO柱式 PCR产物纯化试
剂盒进行纯化 。(2)测序：PCR扩增 反应产物 的测
序工作由上海 生工生 物工程技术 服务有 限公 司进
行 。选用 ABI 3730 DNA测序仪 ，测序引物与 PCR
扩增引物相 同。
2 结果与分瓶
2．1 ITS的 PCR扩增
四 个 样 品 (SR176H，SR172H，SR176B，
SR172B)都有扩增条带，大小在 700 bp左右 。
2．2 ITS序列比较
(1)将 SR176H与 SR172H，SR176B与 SR172B
的 ITS序列分别用 ClustalX软件进行序列比对 ，一致
性均为 100 。(2)将 SR176B，SR176H的 ITS序列
2期 张灵等 ：松茸组织分离物的 rDNA—ITS序列鉴定 183
在 GenBank核酸序列数据库中进行序列相似性检索
(BLAST)，二 者 的 同 源 性 为 99％。结 果 表 明：
SR176H为 SR176B的纯培养物。(3)将 SR176B，
SR176H的 ITS序列分别与 GenBank核酸序列数据
库进 行 序列 相 似 性检 索 (BLAST)，结 果 表 明：
SR176B，SR176H与多个松茸子实体及分离物的 ITS
序 列 相 似 程 度 都 很 高，多 为 99 。从 中 选 取
AB188557号序列与本研究 中所测的序列进行 比对。
可以看 到 SR176H 与 AB188557的 同源 性为 100
(图 3)，SR176B与 AB188557的同源性为 99 。结果
表 明 ：SR176B，SR172B是 松 茸 子 实 体 ，SR176H，
SR172H就是松茸的菌丝体 ，由此证 明我们通过组织
分离方法获得了松茸的纯培养物(菌丝体 、菌种)。
SR176[{ 1
AB188557 5l
SRl761{ 6l
AB188557 ¨ l
“7611 】2i
A【{j88557 1 7l
SR】76[{ 1 8】
AB188557 23】
SR1761l 2州
AB 188557 29l
SR17611 30l
A【{J88557 35l
AB188557 411
SR1 761t 42】
AR188557 1 7l
SR i751- d8l
AB 188557 531
图 2 松茸子实体及分离物的 ITS引物
(ITS1 and ITS4)PCR电泳
Fig．2 E1ectrophoresis of amplification products
with a pair of primers(ITS1 and ITS4)
【；G( A rG 】 CA(二G(： 【 A( C f ’r( 】’¨ (：A( ( ’】 lG( ACA‘丌TIGTA(iGCI I；(|A 6O
； ㈠ ㈠ { ㈠ i i i i： ㈠ l㈠ i i；
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1：： ㈡ ll j ㈠ ll ㈡ ll ㈠ j，i ll
T P(；TA1 n’TT(=：(_=A( CCI’ATGCAI FTI’ATTATACAcTCG( 1’ArE； r《：A FGGAATGT PAYFTG 230
( 丌G( C1、丁AA 兀 CcAGTAM CCTTATACAACTTICAACAA c( ATcTCTTGGcT口’CGC 240
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( rGG( 1AATTGC( GTAAA c(：TTAI AA f FTCAAC～＼ ；GATC PCl r( CTCTC 29()
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T。GAATC1”r’fGAACGCACCfI’( ( C1℃cTTGGTAI1’CCGAG( ；CA_rGCCTG1”r I GTG 360
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TCATGAAA1‘TCI’CAACCI TTCAGC。fT n’TGT rGAATAGGC．rTGGArr]’TGGGA(；T 门’ ．t70
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( (^ c1GCl’CAGAAGI’c]1；CTC1’CCI、TAAA1_GTA11’AG( G(；GCCCTTGITG IPC．fAGCA 530
” 485
T ’( 535
图 3 SR176H与 AB188557在 GenBank中进行 BLAST的序列分析结果
Fig．3 Result of the sequence analysis between SR176 H and AB188557 in GenBank
184 广 西 植 物 3O卷
3 讨论
对于腐生真菌，从子实体的组织分离获得分离
物，其分离物可靠性的验证最直接的方法是用该分
离物进行栽培出菇验证。但是对多数菌根真菌由于
其营养生理的特殊性，在纯人工条件下还无法进行
出菇验证，而形态学和细胞学鉴定结果可靠性较差，
因此用传统方法对菌根真菌分离物的鉴定就比较困
难。现代分子生物学的发展，特别是基因碱基序列
分析技术的应用，为菌根性真菌菌种的鉴定提供了
可靠、方便的技术手段(张志华等，2006)。而 ITS
序列分析因其保守性强，受环境因素影响较小(廖德
聪等，2005)更成为其 中的常用方法。刘春卉等
(2007)对金耳及其近似种的鉴定，熊涛等(2006)对
松乳菇的鉴定，王桂文等(2004)对红菇的鉴定，李海
波等(2007)对鹅膏菌的鉴定，所有这些都证明 ITS
序列已成为大型真菌菌种鉴定的重要工具。
我们通过 ITS序列 比较研究 证明获得 了真正
的松茸菌种，为后续的松茸菌丝体的营养生理特性，
松茸人工和半人工栽培试验，松茸菌丝体液体发酵
及代谢，原生质体单核化研究及交配型等遗传研究
提供了可靠的材料。
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