全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(1)：78— 82 2oO9年 1月
湖北双蝴蝶的组织培养研究
龙 华，黄衡宇
(湖南吉首大学 生态研究所，湖南 吉首 416∞0)
摘 要：以湖北双蝴蝶带芽茎段、不带芽茎段及叶片为外植体，以Ms为基本培养基，通过添加不同的植物生
长物质种类和浓度配比，建立湖北双蝴蝶组培快繁体系。结果如下：在所有实验方案中，带芽茎段的出愈率最
高，是理想的离体快繁材料。较适宜的初代培养基为 MS+BA2．O mg／L+蔗糖 3．O ，增殖培养基为 Ms+
BA2．O mg／L+NAAO．1 mg／L+蔗糖 3．O ，而根的诱导则在 1／2MS+NAAO．5 mg／L+蔗糖 1．5 的培养基
上进行较为适宜。同时对组织培养过程中湖北双蝴蝶植株再生的方式进行了讨论。
关键词 ：湖北双蝴蝶；组织培养；快速繁殖
中图分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：1()(]0—3142(2()()9)O1一。()78一O5
Tissue culture 0f Zp JP．I口I p cD
LONG Hua，HUANG Hen Yu
(j起s￡矗“￡P 0_厂Ef。 0g ，．“ ， o“U；z r ￡ ，Jishou 416OOO，China)
Abstract：The tissue culture and rapid pro1iferatiOn Lechniques of T r0 pe d s∞ were studied by using
stems with buds，stems with0ut buds and leaves as exp1ants． The explants were cu1tivated in different MS media
with different types and c。ncentrations 0f plant growth regulators． The main results can be concluded as folows：the
stems with buds were the best material in speeding pr0pagation amOng the three explants． The shoot diferentiation
was MS+BA2．O mg L+ saccharose3．O ，the optimum medium for proliferation was MS+ BA2．O mg／L+
NAAO．1 mg I +saccharose3．O ，and best medium for ro0ting was 1 2MS+NAAO．5 mg L+sacchar0se1．5 ．
At the same time，the mode of plant regeneration of丁． s∞ d in tissue culture has been discussed．
1 w0rds：1 ￡erosp8，1M7n d sco d￡ n；tissue culture；rapid propagation
湖北双蝴蝶( p￡ s Pm2“ sc0 M )为龙
胆科(Gentianaceae)双蝴蝶属 ( erfJ “优)多年
生缠绕草本，主产湖北、陕西及湖南等省份，其中湖南
西部是主要产地之一(何廷农等，1988)。在我 国湖
南、湖北、陕西及贵州等中、西部省份湖北双蝴蝶在民
间被广泛用来治疗疔疮疖肿、乳腺炎、外伤出血及刀
伤、骨折等(中国科学院植物研究所，l994；杨维霞等，
2OO3)。近年来，由于湖北双蝴蝶的药用价值不断被
发现，东部地区的一些药厂在其产地大量收购，导致
采挖过度，加之其生境已受破坏，现野生居群已不多
见。湖南省湘西地区不少单位(怀化师范学院及湘西
保靖农科所等)曾尝试对湖北双蝴蝶进行人工引种
栽培，但由于其种子自然萌发率低，同时缺乏有关该
种生活史、有性生殖及无性繁殖等方面的资料，往往
以失败而告终。本试验 旨在研究湖北双蝴蝶的组培
快繁技术，以期利用组织培养方法在较短时间内获
得大量的优质苗，满足工业化生产的需要。
1 材料和方法
1．1试验材料
供试材料采自湖南湘西土家族苗族自治州古丈
县高望界林场(1l0。O4．4O2 E，28。38．695 N，Alt：
792 m)，采集的野生植株(凭证标本：龙华 l89，存于
吉首大学生物资源与环境科学学院标本室；标本鉴
定人：云南大学生命科学学院马绍宾教授)，带土移
收稿日期：2D07一O8—2O 修回日期：2。o8一O8—29
基金项目：国家自然科学基金(30160。73)[Supp0rted by the National Natural Science F0undat1on of china(3O16。o73)]
作者简介：龙华(1972一)，男，湖南凤凰人 ，硕士研究生 ，研究方向为植物生态学，(E-mail)jsul0ngh@l63．c0m。
通讯作者(Author for c。rresp0ndence，E_mai1：hhyhhy96@163．c0m)
l期 龙华等 ：湖北双蝴蝶的组织培养研究 79
栽于吉首大学生态研究所试验地，在其生长期内
(2O05年 9月)选取生长健壮、无病虫害个体，剪取
带芽茎段、不带芽茎段及叶片作为外植体。
1．2试验方法
晴天取 3种不同的外植体 ，按下列程序进行 消
毒 ：取材一自来水粗洗一5 洗衣粉水溶液漂洗 5 min
一 自来水冲洗 3O min一7O 乙醇擦洗表面一O．1 升
汞溶液中消毒 6 min一无菌水冲洗 8～1O次，在无菌
工作台中将茎段切成 o．5～1．O cm长的小段，叶片切
成大小 O．5×O．5 cm2的小片，然后接种于初代培养
基上，将培养出的侧芽及愈伤组织切成小段和小块 ，
接种于增殖培养基上；最后将形成的不定芽转移至
生根培养基上，培养 出完整的小植株 。
1．3培养基
基本培养基为 MS，附加不同浓度的 2，4一D(2，
4一二氯苯氧乙酸)、BA(6一苄基腺嘌呤)、和 NAA(萘
乙酸)，其浓度组合见下文。蔗糖 3 (生根培养基
1．5 )，卡拉胶 0．7 ，用 O．1 mol／L NaOH和 O．1
mol／L HCl调节pH值为 5．8～6．O，高压灭菌锅中
121℃灭菌 20 min。
1．4培养条件及统计方法
培养室温度控制在(22±1)℃，光照度 27～36
m0l·n『 ·s～，光照时间 l2 h／d。每隔 lO d记录不
同处理的生长状况。出愈率 一产生增殖芽的外植体
数／外植体总数x 100 ；不定芽的分化率一分化不定
芽的外植体数／接种外植体总数×1。O 9／6；根的分化率
一 分化不定根的材料数／接种材料总数×100 。
2 结果与分析
2．1外植体及诱导培养基选择
将湖北双蝴蝶不同的外植体接种到附加不同浓
度BA、NAA及 2，4一D的诱导培养基上，培养结果
有较大差异 。不带芽茎段基本不产生增殖效应 ，但
在其基部有少量的愈伤组织产生；而带芽茎段则基
本不产生愈伤组织 ，但 由于侧芽 的生长而有较高的
增殖系数；叶片培养的出愈率最低，虽经改变多种植
物生长物质组合来调节叶片愈伤组织的出愈率，仍
只有少数植物生长物质组合诱导出愈伤组织。不带
芽茎段或叶片诱导出的愈伤组织量少质差，基本不
能分化出不定芽。而带芽茎段由于侧芽的生长而有
较高的增殖系数，这样看来，在湖北双蝴蝶的离体快
繁中，带芽茎段是较适合的外植体材料。将湖北双
蝴蝶带芽茎段接种在含有不同植物生长物质及浓度
的培养基上，45d后均能诱导增殖芽，但增殖芽的诱
导率和生长量却有较大差异(表 1)。
表 1 不同植物生长物质及浓度对带芽茎段培养的影响
rable l Efect of different plant growth regu1ators and
their concentrations on the culture 0f stems with buds
注； 污染数除外； )一 无；+ 生长量小，生长势不明显；++ 生
长量较大，生长势明显。下同。
N。te： ’Excepting the numbers。f 1)ol1ution； ’一 None)(istence；+ A
few and gro州 h potentiaHs not ob ous；++ Many and grawth potentiai
is 0bvious． The same below．
从表 l可看出，在不添加任何植物生长物质的
MS基本培养基上(空白对照)，外植体(带芽茎段)
培养 45 d后基本没有变化 ，培养时间延长至 6O d仍
无生长迹象 ，以后逐渐死亡；在 MS培养基中添加不
同浓度 NAA、2，4一D及 BA培养后发现，附加 NAA
或 2，4一D对诱 导增殖 芽 的效 果均不理 想；而 附加
BA的培养效果则十分理想，其中浓度为 2．O mg／L
效果最好，在此培养基上培养 2O d后茎节部位即有
大量芽点萌发(图版 I：1)，30 d后诱导出的不定芽
(或称为增殖芽)生长量和生长势均较好(图版 I：
2)，45 d后不定芽继续生长 ，叶片展开，显示出良好
的生长势(图版T．3)。此外 ，在对湖北双蝴蝶带芽茎
段诱导培养前期，发现有少量茎段逐渐变黄死亡，但
不同培养基上的死亡数相差不大，说明培养基中植物
生长物质浓度的差异对外植体死亡率的影响不大。
2．2不定芽的增殖
待诱导培养基中的不定芽长至 2～3 cm时，将
其切下接种于不同植物生长物质配比的MS培养基
上，置于(22±1)℃散射光下培养，30 d后统计不定
8O 广 西 植 物 29卷
图版 I 1．带芽茎段培养2o d后的情况；2．带芽茎段培养3o d后诱导 的增殖芽：3培养Il5 d后，增殖芽的生长情况：4．增殖培养中由单芽
形成的多芽体；5．增殖培养 30 d后的生长情况；6．生根苗的生长情 ；7．过渡苗；8．由愈伤组织分化出的不定芽。
Plate I 1．The gr。wth of stem with buds after 2o d；2．The proliferous buds deriving from sten1 with buds after 3O d；3．The growth of proliferous
buds after 45 d；4．The mult|bud de riv ng fron1 sInglc_bud i“pro1iferative culture；5．The growLh。f pr。liferative cuIture after 3O d；6．The growth of
r0oting shoots；7．The tran siti0n sho。t；8．The adventiti。us buds djfferentiate(1 from cam．
芽及不定根的诱导率。
从表 2可看出，不同植物生长物质浓度配比对不
定芽增殖的影响较大。在仅附加 BA的增殖培养上，
不定芽的增殖系数低，表明仅有BA对湖北双蝴蝶不
定芽的增殖培养是不利的；在 BA和 AA各种浓度
组合中，当 BA浓度一定时，不定芽的分化率随着
AA浓度的升高而降低，当NAA浓度超过O．5 mg／
L时，不定根的分化就比较明显；当NAA浓度较低时
(O．1 mg／L)，在一定范围内，不定芽的分化率随着BA
浓度的升高而升高，但其浓度超过 2．O mg／L时，反而
l期 龙华等：湖北双蝴蝶的组织培养研究 81
抑制了不定芽的分化与生长。对湖北双蝴蝶不定芽
的增殖来说，较适宜的植物生长物质组合为 BA2．O
mg／L+NAAO．1 mg／L。将诱导培养基中诱导出的
不定芽接种在此组合的培养基上培养，15 d后即可形
成多芽体(图版T：4)，3O d后可以看出多芽体生长量
和增殖率均较大，而几乎不产生不定根(图版I：5)，这
时将多芽体切分成单芽后继续培养，可使试管苗在短
期内快速增殖，从而获得大量的湖北双蝴蝶组培苗。
表 2 不同植物生长物质浓度对不定芽增殖的影响
rab1e 2 Effect of diferent concentrations of plant gr0wth
regulators 0n the adventitious bud p 0liferation
植物生长物质组合 (m L) 不定芽的分化率 不定根的
Comp0siti0n 0f plant
gr0wth regulat0rs
NAA
分化率
Differentiation
rate Oi
rooting ( )
2．O
O．5
1．O
2．O
3．O
O．0
O．1
O．5
1．0
2．O
O．1
O．O
O．O
5．4
2O．8
2O 6
1O．5
4．7
O．O
O．O
2．3生根培养和移栽
从表 3看出，湖北双蝴蝶的生根培养较为容易，
在不添加植物生长物质的MS或 1／2MS培养基均可
较好地诱导生根。通过本实验得出较适宜的生根培
养基配方为 l／2MS+NAAO．5 mg／L+蔗糖 1．5 ，生
根率可达 95 9／6以上，且生长量最大(图版 I：6)。
表 3 不同 N从 浓度对根系分化的影响
1’able 3 Effect of different NAA comp。sitions
on the diferentiation of r。oting
注；+少量，生长缓慢；++较多，生长迅速；+++大量，生长旺盛。
Note：+ a few，slow growing；++ many，rapid gr0wing；++ +
most，vig0rous growing．
当多芽体培养数量足够时，将长到 2～4 cm的
单芽从多芽体中切下转入生根培养基中。25～3O d
后，待苗壮根粗时，将瓶盖打开加入一定量的蒸馏
水 ，置于 自然光下 ，5 d后取出生根苗，小心洗尽残
余培养基后移栽到经 0．1 甲醛消毒的粗河沙中，
保温保湿培养 25 d(温度 2o～25℃，湿度 7o 左
右)，再移人沙土中培养 ，待小苗长出 6～7片新 叶
(图版 I：7)便可移栽至大 田。
3 讨论
对于任何植物的组培快繁来说，增殖率是一个
主要的实验指标 。一般说来 ，通过组织培养达到外
植体增殖有 3种方式，即通过愈伤组织形成不定芽、
产生胚状体和促进腋芽萌发(谭文澄等，2O01)。湖
北双蝴蝶组培快繁中植株再生方式属第三种，在附
加 BA2．O mg／L的 MS培养基中，可使其带芽茎段
休眠的侧芽生长，形成一微型的多枝多芽的小灌木
丛状结构(多芽体)，将单芽切割，可在短期内重复这
一 过程，这样可以不断产生出大量的小植株，这与桤
叶唐棣(杜保国等，2O05)等一些木本植物的组培快
繁方式相同，而与白花假龙胆、川东獐牙菜及青叶胆
(霍丽云等，2O02；黄衡宇等，2OO2；黄衡宇，2OO5)等
同科其他草本植物组培快繁方式有较大差异。
在不带芽茎段、带芽茎段及叶片 3种供试外植
体中，叶片的诱导能力最差。少数不带芽茎段外植
体在诱导培养中能够产生少量质地紧密的愈伤组
织，而无侧芽的萌发，这样的愈伤组织在进一步的增
殖培养中能够产生不定芽(图版 I：8)，但其发生频
率较低且产生的不定芽数量较少 ，因此也不是理想
的外植体材料。而带芽茎段外植体在大多数附加植
物生长物质的培养基 中均有侧芽萌发 ，是最适宜的
外植体材料。根据植物细胞全能性，来自不同部位
的外植体都应该具有植株再生能力，在本试验中，3
种供试外植体在附加外源植物生长物质为NAA、2，
4一D及 BA的培养基中，启动侧芽萌发、诱导愈伤组
织的难易程度却不同，生长势也有明显差异，这与怀
地黄、地黄等植物类似(吴美芬等，1986；李明军等，
1996；王小菁等，2O02；陈敏艳等，2O04)。在对带芽
茎段的启动培养中，单独使用生长素类物质诱导启
动效果不明显，其中单独使用 NAA或 2，4一D的最
佳诱导率仅有 23．53 9／6或 3O．78 9／6，但较低浓度的
2，4一D能诱导部分外植体基部产生一定量的愈伤组
织。单独使用细胞分裂素的效果最好，在一定范围
．
m
嘶 ％一6 5 6 93 6 8 6 3 ∞％昭加的加％∞
82 广 西 植 物 29卷
内(O．O～2．0 mg／L)外植体出愈率随着 BA浓度的
升高而升高，2．0 mg／L时的出愈率达 l()() 。这表
明在湖北双蝴蝶带芽茎段 的启动培养 中，细胞分裂
素是不可缺少的。本试验也采用了同时附加不同浓
度细胞分裂素和细胞生长素的培养基，但效果均不
如单独使用细胞分裂素，推测与所采用的外植体材
料含有较多的内源生长素而对外源生长素不敏感。
在增殖培养过程 中，材料 的内源生长素由于在
启动培养时受到一定量的消耗，因而在增殖培养中
需要补充一定量的外源生长素，故单独使用 BA不
如与 NAA配合使用的效果好。通过试验得到较适
合的 植 物 生 长 物 质 浓 度 配 比：BA2．0 mg／L+
NAAO．1 mg／L，在此 组合 中，生 长量和增殖量 均
大，而几乎不产生不定根 ，这 十分有利于增殖培养，
这与丹参及活血丹快速繁殖中丛生芽的诱导十分相
似(冯玲玲等，2O04；陈光登等 ，2()O7)。
湖北双蝴蝶的生根培养较为容易，推测与其所
含内源植物生长物质的种类与浓度有关。通过实验
得出较适宜的生根培养基配方为 1／2MS+NAAO．5
mg／L十蔗糖 1．5 。
由于培养时瓶苗 长期处于高营养、高湿度等条
件下，移栽后不能立即适应瓶外自然环境，因此成活
率很低。在实验中发现，如果在炼苗前打开瓶盖并
加入一薄层蒸馏水 ，1 d后 再移栽 ，成活率 明显提
高，放置5 d后，成活率能达 95 以上。
本研究中，由于其他 因素的影响，导致培养基出
现部分不凝现象 。综合诸多因素 ，可能是凝固剂(卡
拉胶)的质量问题 ，因此笔者在配制培养基时，适 当
加入少量的 KCl，以起到助凝作用。通过观察 ，并未
发现添加KCl会对培养物的培养产生不良影响。
本研究为湖北双蝴蝶的无性繁殖提供了一种方
法，可在短期内提供大量的试管苗，通过人工栽培扩
大资源，确保湖北双蝴蝶资源的保持和可持续利用。
参考文献 ：
何廷农，刘尚武，吴庆如．1988．中国植物志(62卷)[M]．北京
科学出版社，261—262
谭文澄，戴策刚．20O1．观赏植物组织培养技术[M]．北京：中
国林业出版社，88—99
王小菁，李玲．2o02．植物生长调节剂在植物组织培养中的应用
[M]．北京：化学工业出版社，47
中国科学院植物研究所．1994．中国高等植物 图鉴 (第 3册)
[M]．北京：科学 出版社，384
Chen MY(陈敏艳)，I iang ZS(梁宗锁)，Wang ZZ(王拮之)， ￡“￡．
2OO4． TissL1e culture and plantlet regeneration of R ^ mn “
g￡“￡ n(地黄组 织培养及植株 再生的研究)[J]．Ac B0￡
B0 “￡一 m S (西北植物学报)，24(6)：1 O83—1 O87
chen GD(陈光登)，1』i Yx(黎 云祥)，Han sJ(韩素菊)， ￡Ⅱ￡．
2007． Studies on tissue culture and rapid propagati0n tech ques
of 。 “ —g如“ (活血丹组织培养与快速繁殖技术研究)
[J]．G“拍“ (广西植物)，27(2)：265—271
Du BG(杜保 国)，Yang Tx(杨 途熙)，wei Az(魏安智)， Ⅱ ．
2[)(]5．Tissue Culture of AⅢe (‘^妇r“ 如 (桤叶唐棣组织
培养研究)[J]．Af B Bo Ⅱ￡一 f ”￡S (西北植物学报)，
25(2)：4OO一4O4
Feng LL(冯玲 玲)，Gu0 sJ(郭胜娟)，zhou SY(周诗毅)， n￡．
20O4． Research 0n propagative technique of SnZ “ “f or，‘ ：以
”u frf，(丹参离体微繁技术研究)lJ]．J w“厅“”B R (武汉
植物学研究)，22(5)：463 468
Huo I Y(霍丽 云)，Zheng xl(郑 晓建)．20O2．Stu dies on tissue
cL1ture of “” “ 6 _，p (高寒藏药白花假龙胆的组织培
养研究)[J]．C P『1“rm J(中国药学杂志)，37(6)：415—418
Huang HY(黄衡字)，Chen YG(陈义光)．2oo2．Tissue culture of
medical plant s 山u (药用植物川东獐芽菜的组织培
养)．[J]．G“z “(广西植物)，22(5)：433—436
Huang HY(黄 衡 宇 )． 20O5． Tissue culture of medical plant
s z 一“ (药用植物青叶胆的组织培养)[J]．ch
l “c，H Dr“ (中草药)，36(2)：261—265
l』i MJ(李明军)，zhr【ng JB(张嘉宝)，L』u P(刘萍)．1996．J u r。
culture 0r R ^ ”1Ⅱ，z， n Z“￡ 行0 Ⅱ and fom ation and growth regu—
lation of regenerated p1antlet(怀地黄离体培养再生植株及其生
长调控)[J]．J H N。， nz【 (河南师范大学学报)，24
(4)：6O一63
wu MF(吴美芬)，Chen wD(陈伟东)．1986．nssue culture of tu—
bers，lnd steTns of尺 ^7儿“ ” “譬如￡ 7 n(怀地黄块根、茎的组织
培养 及植株再生)[J]． “ ￡P^ GJm n“”(植物生理学
讯 )，(2)：41
Yang wX(杨维霞)，Zhou L(周乐)，Gc1g HL(耿会玲)，以nz．
2OO3． A survey 0f studv of cl1emical comp0nents 0f me djci—
na1 plants。f Gentianaceae(龙胆科药用植物化学成分的研究
现状 )[J]．A ￡“B0￡Bur “z一0f S n(西北植物学报)，
23(12)：2 23 5— 2 24O