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木薯的组织培养和基因转化



全 文 :@;卵一
广 西 植 物 Guihaia 19(4):359-366 999年 】]月
木薯的组织培养和基因转化 55~3

奎差蕉 承邺,黄毓文
(巾国科学院华南植犄研究所.广东广州510650)
摘 要:木薯是重要的 带作物之一,其块根富含淀粉,是热带、亚热带地区近5亿人粮食的主要
来源.简单介绍近年来运用生物技术改 良木薯的研究进展。
美巷母楚 墼塑堕 鼍里 .敞 . 粳徘 绚
中圉讣类号:Q943.】 文献标识码:A
Tissue culture and Agrobacterium——mediated
transformation of cassava
LI Hong-qing, LI M ei—ru., LIANG Cheng—ye, HUANG Yu—wen
(SouthChinaInstitute ofBotany.c^ f肿 AcademyofScier~es.Gu ngd的u 510650.China)
Abstract: Cassava is one of the most important tropica[crops,its starehy tuberous roots are the
main ca lorie SOUrC~of nearty 500 milion people living in the tropics and subtropics、In this paper

we simplygive anoverview ofmolecular approachesthathave beentakentoimprove cassava breed—
ing.
KeyWOr~S:Casava(ManihatesculeclttCrantz)~issue cultur~;genetransformation
木薯 (Manihot escutentaCrantz)是仅次于水稻、玉米、高梁的第四大热带作物,其块根含有丰
富的淀粉,是热带、亚热带地区近 5亿人粮食的主要来源 ¨。尽管传统的育种方法在木薯研究上取
得了一定的进展,但 由于木薯 自身的特性 (如植株的高度杂合、花粉育性低、有·陛子代严重分离等)
及种质资源的局限性 (如抗性基因资源贫乏、已知的品种均含有氰化物等)使传统育种方法的进一步
应用受到限制。生物技术能将一些具有重要农艺性状的基因 (如抗病、抗虫基因,与产量、品质有关
的基因等)导人作物。而不改变转基因植物的原有特性。在木薯的改良上显示 了很大的应用潜力。近
年来,运用生物技术改良术薯的研究已取得了很大的进展。本文将结合我们最新的研究结果介绍术薯
组织培养和转化的研究进展及今后的研究方向。
1 木薯的经济价值及其特性
术薯是大戟科 (Euphorbiaceae)植物.染色体数为 2n=36嚏,多年生灌木,高 1~5 m,其
4t稿日期:1999-91-25
怍者f畸卉:李洪清(1966-),男,博士 助理研究员,从事植物遗传转化研究.
基童项目:中国科学睨留学基盘、中国科学院‘九五 育种安助项目.
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360 广 西 植 物 19卷
块根含有丰富淀粉,既可作粮食,也可作为工业原料或饲料.术薯起源于南美,于 16-18世纪传人
非洲、亚洲及大洋洲.现在木薯已广泛地分布于全球的热带及部分亚热带地区 ¨.1996年,世界木
薯产量为 1.64亿 t.其中非洲占0.85亿 t 亚洲 占0.47亿 t、拉美占0.32亿 t. 35%干物质计,木
薯的年产量相 当于 0.6亿 t谷物 (以能量换算). 占世界根茎作物产量的 1/3, 占块根作物产量的
70% 0 .木薯于 1820年前由东南亚华侨引人我国,至今已有 180多年的栽培历史. 目前木薯产区
包括海南、广东、广西 福建、云南等省区,四川、贵州、湖南、江西、浙江等地也有种植。
术薯主要的优点是具有很高的产量潜力。它是一种 C —c 中间型作物,在适宜的条件下具有很
高的光合作用效率,而在干旱和高温的胁迫下.也能保持较高的光合效率。木薯的最高产量可达80
t/hm (生长期为一年)C6) 其次.木薯能耐贫瘠的土壤及干旱的气候,它能生长在酸度很高的贫
瘠土壤.这一点没有其它作物能与之相比.此外,木薯的种植和收获的时阃灵活。术薯能在一年中的
任何时间种植,便于与其它的作物间种。木薯的块根可在种植 8个月后收获 但块根也可保存在地下
直到需要时取用.因此它有饥荒 储粮库 的美称。
2 限制木薯生产的因素
尽管在环境条件适宜的试验田中,木薯生长一年的产量可达 80 t/hm2,在大田生产条件下巴巴
多斯和印度的某些地区木薯产量也分别达到 27.3 t/hm 和 23.5 t/hm ,然而,在世界其它地区木薯
产 量明显偏低 世界木薯的主要产地非洲,平均产 量从尼 日利亚 的 9 t/hm 至坦桑尼亚的 5
t/hm ,而在苏丹最低产量只有 1.8 t/hm2¨ .其中的原目除了田问管理、土壤条件之外.主要是
由病害和虫害导致的减产 在世界范围内由病害 虫害导致的碱产高达 20%-50% .局部地区甚至
导致绝收.木薯重要的病虫害有以下几种: (1)病毒病 非’洲木薯花叶病毒(African c.8.$sava/lOSa.
ic virus,ACMV】和 木薯花 叶病 (Cassava c0mI帅n m0saIc virus,CCMV) (2)虫 害 木薯 粉蚧
(Phenacoccus manihoti~及木薯绿蚁 (Mononychellus sppJ、螟虫及根癌线虫 (Meloidogyne spp.)等.培
育抗病 抗虫的品种将有助于增加木薯的产量
除因病虫导致的减产外,木薯育种中另一重要的方面是提高块根的质量 木薯的块根含有氰化
物,食用未经加工或加工不彻底的块根对人畜均有害。木薯淀粉的质量也很大程度上受控于气候和环
境,块根的质量影响淀粉的质量及其加工后的食品质量.此外,木薯的块根与其它根茎作物不同,块
根收获后,很快会变质 块根收获一天后,即发生生理变化,三天后,块根表面出现黑点.条纹,使
食用质量降低 而且木薯的块根只吉有少量的蛋白质,且主要集中在不可食用的含有高鲁【化物的皮层
上,对于以木薯为主食的地区,会导致严重的营养不良。
传统的育种方法在木薯育种中遇到的困难主要有:1.木薯的高度杂合特性 经过长时问的无性
繁殖,木薯植株已成为一个高度杂合体,花粉育性低.即使获得种子,其有性子代也产生严重分离,
因此,很难通过杂交的方法有目的地引人某一性状,而继续保持原有亲本的优良性状.2、种质资源
的局限性 现有的木薯品种中没有抗天蛾科幼虫的品种,也没有不含鲁【酸的品种。生物技术作为一个
有力的工具能弥补传统育种方法的不足,能有效地利用不同的种、属,甚至动物 微生物的基因资源
来改良植物,它能向植物导人单个或多个具有重要农艺性状的基因,而不象传统育种方法那样舍导致
原有品种的优良特性的改变.丢失或增加不需要的特性。可以采用不同的策略来培育抗 ACMV的品
种,奶通过转人病毒外壳蛋白基因.反义 RNA.核糖体失活蛋白 复制酶l及干扰 DNAs或 RNAs;
也可通过导入苏云金杆菌的Bt基因使木薯能抗一些鳞翅目、双翅目,鞘翅目的昆虫及线虫和蚁类;
采用正向调节氰化物降解酶类或者降低鲁【化物合成途径的酶类的活性来培育不含氰化物或鲁【化物含量
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4期 李洪清等: 术薯的组织培养和基因转化 36l
{氐的术薯品种;向术薯导人储藏蛋白基因可克服术薯蛋白质吉量低的问题;另外,应用生物技术还能
调控淀粉合成等
要想成功地应用基因工程改良术薯,首先应该建立一套高效的植株再生及基因转移系统,经过
10多年的努力,这方面的研究已取得了很大的进展.
3 木薯的组织培养和转化研究进展
3.1
3.1.1非不定再生逢径 术薯组培的早期工作主要是分生组织培养,即所谓的非不定再生逮径。再
生植株来源于高度联系的多细胞团,如茎尖及_!I!I芽 该方法用于种质资源的保存和交换,品种的提
纯、复壮、脱毒等.Kartha等 ¨首次进行术薯的分生组织培养,用该方法获得 5个品种的再生植
株,所用培养基中加入低浓度的激素 (BAP0.1 mg/L,GA3 0.04mg/L,NAA0.2mg/L)。近年
来.研究发现加入高浓度的激动素 BAP 2~10 mg/L能促进_!I!I芽分生组织以组织块 的形式迅速增
殖 将这些丛芽转移到吉低浓度 BAP的培养基上,即可再生苗.每个外植体经一个培养周期可产生
多达 14条苗 ,在丛芽诱导培养基中加入表面活性剂 PIu10n 一F68能增强诱导效果 。另外,
采用低浓度的Thidiazuron(TDZ)预处理也可增加丛芽的形成数量 “ .
3.1.2休 细胞胚胎发生逢径 体细胞胚胎发生 术薯体细胞胚胎发生首次报道于 1982年,Stamp和
Hemhaw⋯ 以术薯合子胚的子叶和胚轴为外植体成功诱导出胚状体,该方法现已广泛地用于术薯的
组培及再生.术薯的体细胞胚胎发生能从多种外植体类型获得,它们主要位于分生组织及胚性组织区
域,如合子胚的子叶及胚轴 ‘。,“,幢 、幼叶 ‘ 卜∞ .茎尖分生组织 ‘ ‘ 等等 术薯初生胚状体的诱
导可采用 Picloram 1~ 12 nag/L,d[camba1~66mg/L及 2,4一D 1~16 nag/L,使用生长素的类型
及浓度据不同的品种、外植体的类型而变化 ¨r趣2土 ·川 .术薯的胚状体发生能力总的说米与基因型
的关系很大,模式品种 M Col 22具有较高的胚状体发生频率及成熟胚状体的产量。而有些品种,尽
管经过大量的实验,仍然不能诱导出胚状体.对外植体用 2,4-D或 ABA进行预处理,以及在诱导
培养基中补充少量的硫酸铜,能提高胚状体的诱导效率 ,巩笠, -甜 通常情况下,外植俸在诱导初
期能产生颗粒状结构及球形胚,但随后愈伤化,以至获得成熟胚状体的频率较低 (27,28) 诱导的胚性
愈伤块,如果继续培养在含生长素的培养基上,一部分胚状体会发育至带有绿色子叶的成熟胚状体,
而如果将胚性愈伤转入不含激素或含低浓度的 BAP 0.1 mg/L上,胚状体的成熟会加快 成熟胚状
体的萌发 (即再生植株j频率一般很低,且根极的发育不完垒。因此,通常需采用两个步骤,先将萌
发胚状体培养在含 BAP的培养基上促进芽的生长,然而转移到含低浓度 NAA 上长根.Matthcws
等 为了提高胚状体的再生植株的频率,先将诱导胚状体转到含 。.5%活性炭的培养基上成熟,然
后进行脱水处理,最后转到不含激素的培养基上萌发.使初生胚状体的再生频率达到 85.4%.其它
的处理,如加人 GA3也有利于胚状体的萌发 t4)。次生旺状体硬循环旺状体诱导 术薯初生胚状体也
能经继代培养诱导出次生胚状体 .某些品种初生胚状体的发育阶段对次生胚状体的诱导效率影响
很大t如在 MCol 22中,成熟胚状体 (带绿色子叶)比早期胚状体产生更多的次生胚状体,因此在
进行 次生胚状体诱导之前,增加了一个培养过程 (胚状体的成熟),将培养方法 改为循环胚状体
诱导 ¨¨ ,大大提高了胚状体的增殖效率。 姓 胚状体诱导除可采用前述的生长索外,还可采用高浓
度的 NAA·且由 NAA诱导的胚状体其根极发育完全,植株再生额率有所提高 (31,32 3。将次生胚状
体诱导培养方式由液体培养代替固体培养也能显著提高诱导频率.脱水处理对次生胚状体的植株再生
也有一定的效果,但较初生胚状体差 ”¨。一般认为脱水至原重量的60%时效果较好 (33】 我们实
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— ● — — — — — - — - ● _ _ ● _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ● — _ — — — — — — 一
验 (未发表)表明以麦芽糖代替蔗糖,
配合使用能显著提高植株的再生频率。
广 西 植 物 19卷
能同时提高次生胚状体的产量和植株再生频率,2,4—D 与PP3~3
研究发现连续继代培养在 MS基
本培养基 (含 12mg/L Pick)ram)上的胚性愈伤能产生一种主要由细小的球形胚组成的结构,即所
谓脆性胚性愈伤,将这种愈伤分离出来,就可进行迅速扩增 (34 2。以GD 培养基 C35 7代替 MS培养
基可提高胚性愈伤的产量,一旦获得纯的脆性愈伤,即可进行悬浮培养,在 sH 培养基中 (含6%蔗
糖,12 mg/L Pick)ram)进行迅速扩增.当将培养物转人不含激素昀培养基时,就可得到成熟的胚
状体,但效果很差.如果将培养物继续培养在含低浓度的 Pick)ram(1.2 rag/L)或 1 rag/L NAA
上,球形胚状体刘鱼雷型肛状体转变的频率有一定的提高,但球形胚向鱼雷胚的转变仍是植株再生的
瓶颈,只有极少效的胚状体能发育至鱼雷胚.另外,采用该方法由于组培时间太长可能产生较高的体
细胞变异,导致再生能力下降 .
3.1.3 器 官发生 系统 Tilquin‘36 3曾经报道以术薯的茎切段为外植体,通过器官发生途径获得再
生植株,但该实验结果一直没有得到重复.Sharin等 ”¨也报道从术薯幼叶分离原生质体,诱导愈
伤而再生植株,其结果也是设有得到重复.最近,我们 “ 以术薯体细胞胚的子叶为外植体,成功
地进行 了高频率器官发生诱导并再生植株。将诱导的次生胚状体转人成熟 培养基 (MS附加 0.1
mg/L BAP)培养一定的时间后,取子叶,切碎;在 MS附加 BAP上诱导器官发生 一般诱导 20 d
后,可见叶状结构,芽原基及愈伤组织的形成.通过对多种激素配 比的试验表明,培养基 中含 l
mg/L BAP及 0.5 nag/L IBA有利于获得高频率器官发生.将培养物进一步转移到古 BAP 0.40
mg/L的 MS培养基上进行扩增,即可获得再生的苗,苗的长根可在含低浓度 NAA 或不含 NAA
的培养基上形成。对不同术薯品种的研究表明,该系统适台于多个术薯品种。与经体细胞胚胎发生再
生植株相比,该方法植株再生快,(60-65 d),操作简便。对再生植株的细胞起源研究表明:植株的
再生可起源于子叶的各部位,切 口、叶面、叶柄等,即有起源于表层细胞,也有起源于深层维营束细
胞。我们的实验还表明全量 MS培养基诱导器管发生频率最高,而 GD培养基诱导器管发生频率虽
低.AgNO3具有促进器官发生的作用,但长时间培养在含高浓度 AgNO3培养基上的组织会产生生
长钝化。麦芽糖和蔗糖在器官发生诱导及植株再生方面优于其它碳源 (山梨醇、乳糖、葡萄糖、果糖
或纤维素)。术薯的器官发生能力也与其品种的基因型有关.术薯的组培及植株再生途径如下图所
示:
3.2 槽 随 髓 惘 黜 展 椭 戢 麟 融
随着对术薯组培研究的深人,结合
现有的植物基因转移的方法,术磐的转
化先后进行了下列方面的研究:
3.2.1 以分生组织培养系统为基础
的转化 以分生组织 (茎尖及侧生分
生组织 )诱导的体细胞胚状体及丛芽为
材料t以基因枪及农杆菌的方法进行转
化t相继得到瞬时表达及稳定表达的
GUS及萤火虫萤光素酶,但没有再生
植株的报道 ”。
茎尖、侧葬 种胚子叶、蚺叶、茎尖 侧牟
诱导丛芽 胚壮体块
: 暨芝 /\
瞎性胚性盎伤 胚拄傩块
胚壮 体
I
檀株再生 植株再生
成熟 胚壮体
子 叶
官发 生
株 再生
3·2·2 以体细胞胚胎发生为基础的转化 术薯的体细胞胚胎发生无论是初生还是次生均属于多细
胞起源t通常这些细胞位于或接近维管束部分 f~,3gJ。多细胞的起源给转化体的筛选带来一定的困
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4期 李洪滴等: 木薯的组织培养和基固转化 363
难。另外,对体细胞胚胎发生的组织学研究表明,再生的细胞起源于深层的细胞·采用现有的转化方
法,包括基因枪法,农杆菌法及电激法,较难将外源基因高效导人目的细胞。采用电激胚状体的方法
也曾获得转化的组织块,但没有再生植株的报道 .采用基因枪的方法.几个实验室已获得报道基
因的高效表达.但在最好的情况下,也只是获得转化的嵌合体.尽管以循环胚状体为材料很容易获得
转化的愈伤,但经抗生素筛选后.培养物体细胞胚胎发生能力下降
采用胚状 体发生系 成功获得转基 因的例子只有一 例,且转化株的分子证据只有 DCR 结
果 “ 他们以 M Per 183的次生胚状体的子叶为外植体.与农杆菌 CIAT 1182共培养 (CIAT
1182中的双元载体带有 gua及 bar基因) 在古 16~32 rag/LBast.a上进行胚状体的诱导并再生植
株.木薯品种M Per 183及农杆菌菌种 CIAT 1 182是经过大量的瞬时表达试验筛选出的最好组
合 )。有关此方法的重复性还需进一步试验,尤其是 Southern方面的证据.另外 CIAT l182是一
个没经改造的野生农杆菌,其 Ti质粒上的编码激素的基因会影响植株的再生.
3.2.3 以胚性悬浮细胞为基础的转化 与初生及次生胚状体不同的是.如果将胚状体连续墟代会
发现培养物中除胚状体,非胚性愈伤,还有出现一些臆性胚性愈伤。以 GD培养基代替一直用于木
薯的体胚诱导的 Ms培养基,并以 Picloram代替 2,4一D,胚性愈伤的数量会大量增加,进而可在
SH 液体培养基中进行悬浮培养并大量扩增 H 。该方法由于培养物细小 (一般由几十个细胞构
成),相应的转化方法一般能将外源基因导人具有再生能力的细胞.同时小的细胞团也方便转化体的
筛选,以此系统为基础.采用 Paramomycin为选择时,schopke等 耳4 以基因枪法获得转化植株。
他们将转化了的细胞先在古 12mg/LPicloram的液体培养基 中培养 2周,然后转人液体培养基古
15mg/L的 pararaomycin进行选择,4~5星期后将液体培养物转人固体培养 (同样条件下 )4星
期 由于选择压会干扰再生,所以再生阶段去掉筛选压,将固体培养的材料依次转人不同的培养基来
诱导球型胚向鱼雷胚发育 (培养基中加 1.2mg/LP~doram),然后经成熟培养 (0.5% 活性炭的 MS
培养基 )发育至成熟胚状体。成熟胚状体经干燥处理后在 1 mg/L BAP培养再生植株。不同的悬浮
系再生植株能力差异很大,在某些悬浮系中没有再生植 株,采用该方法只有一个 品种 (TMS
60444),转化株经 Southern证实是外源基因的导人。
3.上4 建立于末薯器官发生系统上的基因转化 以木薯次生胚状体的子叶为外植体,在古BAP的
培养基上能诱导高效率的器官发生及植株再生.且器官发生主要起源于切 口及表皮细胞,为采用现有
的基因转化方法提供了较为有利的条件,同时与建立了胚状体途径的筛选方式相 比,几种常用的转化
体筛选标志基因均可用于转化操作 19,21 .以农杆菌介导的转化通过 GUS基因瞬时表达研究几个品
种对农杆菌的亲和性试验也表明.木薯细体胚子叶对 LBA4404(pTOK233) t46 和 LBA4404
(pBin9GusInt) ¨ 表现出很高的瞬 时表达效果. 我们 以次 生胚状体 子叶为外植 体,与农 杆菌
LBA4404 (pTOK233)共培养后.在台 15 mg/L的选择培养基上可诱导抗性愈伤、芽原基的形
成 GUS染色表弱:30株 hygromycin抗性芽中,6株表现为GUS阳性.转基因的芽经进一步培养
后,移人温室 (Li等 1996).与此同时我们还以试管苗繁殖的转基因材料研究了35S启动子驱动下的
GUS基因在木薯中的表达情况.与早期基因枪的瞬时表达对 比 ,转基因株的各部位均表现为较
强的 GUS染色,包括根的各部分。表达最强的部分在最劫嫩的组织、顶端,侧生分生组织,根
尖等 “¨。有关转基因株的检测经 PCR Southern、Northern等检测.最近我们又运用农杆菌介导
方法将一个抗叶片衰老的基因成功地导人木薯 (未发表)。
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广 西 植 物 9卷
4 木薯的基因工程育种的研究方向
4l1 提高转化效率
从已发表的两个转化系统来看,转化频率都偏低。Schopkc等 ‘* 报道采用基 因枪的方法获得转
化株,而具有确切分子证据的只有 2株。造成这种情况的原因除与转化方法、筛选条件有关外.重要
的是再生植株途径.虽然脆性胚性愈伤途径能使得培养物更分散,细小化,扩增效率更高 (4天增殖
l倍),方便于转化。但由珏性愈伤再生植抹需要的周期长,且再生效率很低,其中由球形胚至成熟
胚状体的转变仍是一个瓶颈,由胚状体再生植株也有一定的难度.艏性胚性愈伤与胚状体发生途径都
属于体细胞胚胎发生途径,只是由于改了培养基而使得培养物的细小化,从而只是部分解决 转化 与
再生 的予盾,这也可能是导致转化频率较低的原因。我们 ””采用的农杆菌介导结台器官发生系统
的方法虽然获得多个转化抹,但其频率也只有 0.2%~0.4%.虽然我们的实验没有受再生植抹方面的
限制,但该再生方法由于其 自身的特点,很难避免假阳性、嵌台体的存在.且由于植株再生时间相对
较短,难以通过连续扩增来对转化体进行严格筛选.解决转化频率低的方法除了进一步研究转化过程
中的各个环节外,仍需提高组培效率.对于前者,必须提高球形胚状体的成熟、萌发及植株再生效
率,对后者需采取更有效的扩增方法。
4l 2
基因转化作为基因工程育种的基础,最终必须用于改造一些生产上应用广泛的品种,现有的两个
系统均建立于模式品种 (M Col 22和 TMS 6O444)上.尽管在上述转化系统建立的同时,也报道了
瞻性胚性愈仿途径 (Taylor等 1996)及器官发生途径能诱导适用于多个品种,但至今没有转化其它
品种的报道,这有待于进一步的研究.
4l 3 向术薯导人有用基因
要充分利用基因工程改良木薯,业 须针对木薯上的重要的病虫害.营养成分 氰化物、淀粉合成
等,利用已有的基因进行大量的转化工作,如:通过导人抗病毒基因,抗虫基因,控制氰化物的合成
及代谢酶类的基因,淀粉合成酶基因等来培养优质 高产的木薯品种,为生产服务。
参考文献:
(1) FAO、Food and agricuhuraloq[aniatlionoflheUnitedNa~om 【M1 Pree~tioayearbook,Rome.1989.
(2) RogersD StudimonManihot eseutentaCtantz snva)and related sp。d∞ ButtTorreyBot.1963.90 42-54
(3) JennlngsD k Cassavaldcmihot escufema(Euphorhiactae)【Cl-In:Ec~tutien ofcrop plants(edited by SimmondsNW).
#976.B1~ 84
(4] GreenwayP J Origins ofsomeEastAfricanfood platts E 妒 口nAgri t994,10:34~39
(5) FAO-FAOSTATl>atabasvhltp://ap阵 fao.org/.1997
[6] CIAT,Cassavaprogram 【c CIAT,CalColombia.AnnualRcpor~1989,1980
卵 ) KarthaKK.Regenemtionofcassavaplantsfrom apicalmeristems【耳 Plant曲 Lett.1974.2:107~ l】3
[B] Kon~n N Sangvam R S
. Sangwan-Nonmel B S.E~clent in vitro Shoot n口1t n systems in 血ssava(M 娴 ^
e~ emaCrantz Plant Breed, 1994a,113:22 236
(9) Kon~n N K,Schol~e C,Carmmo R 口 An dficient m螂 pcolmgation s~tm for蝴ssa啪l‘ 4nf excutem4 Crantz)
based on nodal ex#anms and axillary bud derived metisten~ Plato CetfRep
, 1997.16 444~449
[10) Bhagwat B1 Vie/ra L G 且 Erlckson L R.Stimulation of讯 vitro sltoot prolifcration from tedal~aplanb 0f ssava by
thidi~zuron bcTlz, .me and gibbet~41i~acid【耳 P~antCel[TissueOrganCult.1996,46: 7
(11] st丑mpJ^ Heml~wGG Somadc embryogcncsisinca~ava【耳zpftanzan~, .1982.10s 183~18,
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 李洪清等: 术薯的组织培养和基因转化 3 65
(12) Kona n N K.Sang wan R S.Sangwarr-Norreel B S.Sornatic embryogenesis from ~ulturnd n~tllre ootylnd ons ofcassava
(Mard[mtecute,UaCrantz).Id~ntlfw,atlonofparametersinfluencingthefrequencyof embryogenesis【J]-PlantCeltTissue
OrganC .1994b.37:91~ 102
(t3) StampJ A.HcnshawGG.Somatic embryosen=isfrom clonalleaftissuesof㈣ va【Jl- 栅 Bot.1987 a.59 445~450
(14) Szabados L.Hoyos R,Roca W.In vitro somatic embryogenesis and plant regeneration ofcas~.va【耳 PlantCelRep.
1987 b.6:瑚 ~ 25I
(15) M athe~ H,SchopkeC,CarcamoR.Improvement ofsomaticembryogencsis and plant recoveryin planzCeil
Rep.1993.12 328~ 333
(16) RaemngersC J JM.Primary and cyclic somatic embryogen~isin∞ssaⅦ (Ma~ihot escalentaCrantz 【D PhDtht*is.
Agricultund UniversityofW ngen ingen.Netherland s,1993
(17) Ra=nake~ C JJM,B~ssembinderJ JE StazitskyG Induction.germination and shootd~ optnent ofsomatic embry
osin∞ p PlantCelTissueOrganCult.1993 a,33:15 156
(18) LiHQ,Huan8YW.Lian8CY eta1.Improvement of#ant regenerationfrom cyclic somaticembryosin C~SSaVd【R|In:
Cassava Biotcchndogy Ner,~ork:Proc=dings ofthe 2nd Interna tiona l Scientific Meeting,Bogor

lndone*ia

CIAT work-
irrgdocument.1995. 15o:289~ 302
(t9) Li H Q,Sauter C.Potrykus I et at.Genetic trarrdormaticn of龆ssa (Ma~ihot e跗I ⅡCrantz) 1.Nature B~otech
1996.14:736-740
(2O) LiHQ,Fhan8Yw.Liang cY aLRegeneration ofcassava plants via shoot organogenesis【Il PlantCelRep.1998.
17:4tO-414
(21) Puonti—Kacclas FreyP.SautterC etat.Development ofmeristem genttransfertechnklu= farcassavalR In:Proceed,
ings of e 3rdInternational ScientifcM eetoftheCassavaBiotechnologyNetwork. Kampala,Uganda AfiicanCropSci
J(in ,1997
(22) NgSYC.T u£cxtlthre of rot andtuber crops atⅡTA【c In:Biotaohnology:enhancing researehontropical cropsin
Africa(edited byThotapilyG.MontiLM,MohanRajDR,MooreAW)1992,135~ 14I
(23) Sudatr~ novati E Hensha w o G.The induction of somatic embryogenesis of rccaldtrant~ ssava cultivars using
plcloram and dkamba【RI.In:Proceedings of the 1st International Scientifc Meet of the Cassava Biotechnology Net
w0 rk_Cartagena,Colombia(edited byRocawM,ThroAM),CIATworkingdocument,1993.123:128-133
(24) Te.ylor N J,C~rk~ M ,He【l皇haw G G.T i 如 n 0f somatic embqog~Besis iB nn睇 n AfrlczB aB6 one south
Amerkan口s懿lva cultivars expression in sava root and Imf tissues【R}In:Pmcedinp of the[st Inlernational
ScientificMet oftheCassavaBictechnologyNetwork
, Cartagena,Cololmbia(edited byRoca WM.TaroAM Ct.4T
★i昭 document.L993.123 134~ 139
C25) Malsumoto K.Cabral G B
.Teixeira J B et aL Embriogenese scmatiea a partir de folhas imaturas de mandioca in vt州 Jl
Revista& a~ilettadeFiMalogiaVegetal 199l
、 3:107- 1l0
(26) Schopke C

CM va rc/aga A P
. Fauquet C M et at.Cassava tissue culture and tram fotmation:imptowmcnL。r culture
media and theetTvct ofdiferent antibiotics onleafti~u= [R In:Proceedingsofthe1stInternational ScicntifcM薯t of
the Cassava Biotechnclof Net,~ rk
, Cartagena,Colombia(edited Roca WM,Thro AM),CIAT working docuntent
1993.123 :140--145
(27) Sndarmonowatl E Bachtlar A s.Induction of somatic embryogen=is in Indonesian cassava genotypes【R In Cassava
Bioto:hnology Network:Proceedings ofthe 2nd h en1a 0口跗 Sdetatif~M eeting.Bogor Indonesia
. CtAT worMrrg docu.
raent.1995 I 324- 335
(28) Raeroakers c ¨ M .Sofiari E
, Javobsen E eta1.Regeneration and tramfromatlonofCaSSaY~.【c}Euphytica(in press).
I997 a
C29) Stamp J A.Henshaw G 6 S*condary somatic embryogenes/~and plant regeneration in cassa憎 【 plant Cel Tissue Or-
ganCult, 1987 10:227~ 233
[∞ ) RaemakezsC J JM

AmatiM
, StamkyG eta1.Cyclic somatic embryogen=is and plant regenerationincaSSaV&【. M
Bat.I993 b 71:鳓 ~ 294
(31) Ra咖 ak盯s c J J M .So fiari E
. K丑nju E et at.NAA-induend somatic embryogenesis in aⅦ [R In Casava
维普资讯 http://www.cqvip.com
366 广 西 植 物 19卷
B JotcchnologyNetwork:Proceedings ofthe 2ndInternational ScientiFtcMeetilug.Bogor.Imonwaia,CIAT workingdoc-
竹 Er 1995 a.I50:355~363
Sofiari E.Raemake~C J J M,Kanju E el aL Comparison ofNAA and 2,4-D indu~~l somatic embryos in cassav.~【RI·
In:proceedings of the 3rd Intetnational Scientifc M et of the Cassava Bio~x:hnology Network.Kampala,Uganda·
Af~canCrop J(inpres)1997
Raemake~ C J J M .Rozemboom M G M,Dar~0 K at.Regeneration of plants from somatic embryos and friable
embryogenic call~ ofcassava M ardhot escatenta fcrantz)【RI.In Proceedings of the 3rd International Scientifc M辟‘of
theCassava Blote~hnologyNetwork,Kamp~la,Uganda.AfricanCropSci in prmm).1997C
Taylor N J.Edwards M.Kiernan R J et at Development offriabte embryogenic callus and cmbryoge nia suspemion cuL
taresystemsin ca~ va (Manihot escatentaCrantz) NatureBiotech.1996.14:726~730
GresshofP
,Doyc D vatlonofa haploid cellinefromVitis vin和陌 and E importanceofthe stage ofmeiotic devel-
opment of Ehe anthe~forhap~Jd cultureofthis andothergenerap Zpflan.~enphys.1974,73:I32~ 141
Tilquin J P.Plant regenemtionfrom stern calus ofcassava f Can,Bot.1979,57:1761~ l763
Shahln E 1^ Shepard J F.Plant Science Lett.1980,17 459--465
Raemake~ C J JM

Jacobsen E.VisserR G Histology of somatic~mbryogcnmJs and evaluation of somaclonal varia
tion【RIInC&s,~va B Jo[~x:hnologyNetwo rk:Proceedings ofthe 2ridInternational ScientifcMeeting.Bogor,Indonesia
CIAT working docam~nt 1995 150 336~ 354
Luong H T,Shewry P R.Lazzeri P A_Transient gent expression in ca ssava sornatic embryos by tissue electro poration
PlantSci,1995.107:105~ 15
Chavarriaga-Aguirre P,Schopke C.Sangare A et aL Tramformation ofcassava.(Manihot e~ enta Crantz)embryogemc
tisues using Agrobactexlum tomefaciem pa1.In:proceed ings of the Ist International Scientifc Meet of the Cassava
Biot~chnology Network
. Cartagena,Colombia(edited by Roca WM.Thro AM CIAT working documem.1993.123
222—228
Schopke C,Franche C,Bogusz D et at.Transfonmtion in龆s5ava(Manihot etcatenta Cramz)fM】.1n Biotechn~logy in
AgnctdtureandForestry.Baijai~ S.(ed.】,Sl~ringer-Verhg,Berlin.1993.273~289
Sarria R A.Torres E.Balcazar N ef目 Progress in Agrobactexium-med iatad transformation of G&ssava M anihot
esculenta《Cran z)畔l In:Cassava Biotechnology Network:Pr0。∞djDgs of the 2nd Interna tional Scientifc Meeting,
Bogor,Ind0瞄 CIAT*口 增 document 1995
, 150:24I~ 244
Sarria Rt Gom~~ A.Catano M aL Towards the development of Agrobactarium tumefaciem and Particle
cagsava transformation【R In:Proceedings of the 1st Internationa l Scientifc M辟l of the Cas.
sa~dl Biotechnology Network

Cartagena
, Colombia(edited by Roca WM ,Thro AM CIAT working documem1.1993 a.
123 216~ 221
C44) Schopke C.Taylor N,Carcamo R 酣 at.Regencaatlon cf transgenic cassava plants (Manihot e~atenta Crantz from
microbombarded embryoge nJc suspension culturm NatureBiotech
. 1996.14:731~ I35
(45 Hoekema 1^Hoyka~ P,SehltlxaootR Transfer cf octopin~T-DNA segmentto plant eetlsmediatedby difmcnttyl:a~
ofAgrobacter~um tumorof rootinducing plasmids :generalityofvirulence systems JBact
, 1994,I 383~385
[46) Hiei Y,Ohta S,Komari T etat.Eficienttrar-=dormat~on of rice ryza saliva L_)mediated by Agrobacterium and sc.
quenc~ana lysis ofthebound arie~of EheT-DNA f .plant 1994
, 6:27I~ 2吕2
(47) HoltorfS,ApelK
. BohlmannH,Co mparison ofdiferent oomtititive andind ucible promo tersf。rIhe ovcrexpresslon of
transgenminAm~domisthatianaf PlantMatBiot,1995.29:∞7~646
(45) AriasGarzon D I

Sar6a R
、 Gciv/n S 4‘New Agrobactetium f iens Plasmids for cassa、 tramfofmation fa1.Sec-
ondlnt~-nationa lScientificM eeting, Cassavaaioteehnolngy舳 f 《印 NⅡ),1995,4B
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