全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(5)：792— 795 2007年 9月
罗汉果雌雄株同工酶性别鉴定研究
李惠敏1，黄夕洋1，2，
(1．广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004；2
高成伟1，秦新民1
； 籍 广西植物研究所，广西桂林541o。6)
摘 要：采用电泳技术结合同工酶染色，分析了罗汉果雌雄株叶片的过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶、超氧化
物歧化酶同工酶、多酚氧化酶同工酶和过氧化氢酶同工酶。结果表明：罗汉果雌雄叶片在同工酶谱上 ，存在着
与性别性状相关的酶带 ；雌雄问的差异酶带在每一种同工酶中均有一条以上，可作为罗汉果雌雄株问的性别
鉴定。此外，还比较 了高产、低产、不结果雌株之间同工酶的酶带和活性差别。
关键词 ：罗汉果；性别性状 ；同工酶 ；雌雄株
中图分类号：Q946．5 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2007)05～0792—04
Sex identification 0f Siraidia gros venorii
by isozyme analysis
LI Hui—Min ，HUANG Xi—Yang 一，GAO Cheng—Wei ，QIN Xin-Minz
(1．College of Li Sciences，Guangxi Nomnal University，Guilin 541004，China；2．Guangxi Institute of Botany，
Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China)
Abstract：The peroxidase，esterase，superoxide dismutase，polyphenol oxidase and catalase isozyme of Siraidia
grosvenorii were analyzed with vertical slab PAGE and specific cytochemical staining．The results showed that
isozyme bands have apparent difference between the male and female plant．The number of different band of
sex character was above one in each isozyme．It is concluded that the difference on isozyme bands can be used
for sex identification of Siraidia grosvenorii．In addition，the isozyme bands and enzyme activity of high yield
female plant，low yield female plant and acarpous female plant were compared．
Key words：Siraidia grosvenorii；sex character；isozyme；male and female plant
罗汉果 (Siraidia grosvenorii(Swingle)C．Jeff—
rey)雌雄异株 ，为广西的特有植物 ，也是一种具有很
高经济价值和良好发展前景的经济作物。但是罗汉
果雌 、雄株从生长到开花期需要一定的时间，植株在
开花前没有明显的差异，对于罗汉果等以果实为收
获对象的作物 ，较 多的雌花是 获得高产的基础 。因
此罗汉果植株性别的早期鉴定在理论和生产实践上
都具有重要的意义 。
同工酶的概念早在 1895年就由 Fischer提出，
但是直到2O世纪 5O年代后，Hunter及 Markert发
明了酶谱技术，才促进了世界各国学者对同工酶的
广泛研究。在利用同工酶进行植物雌雄株的鉴定方
面，Penel等(1972)和 Petig等(1972)分别报道了
与菠菜和黄瓜性别有关的同工酶研究结果，其后 ，国
内在猕猴桃、葡萄、黄瓜、石刁柏和华中五味子等植
物雌雄 性 别 的同 工酶 鉴定 也 有报道 (陈 晓玲 等，
2004；张立平等，1998；艾辛等，2000；范双喜等，
1995；袁仕禄等，1 999)。本研究 以罗汉果雌、雄植株
的叶片为实验材料，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合
同工酶染色分析其在过氧化物酶同工酶(POD)、酯
收稿日期：2006—04一l0 修回日期 ：2006一l0一l 5
基金项目：广西科技攻关项目(0228019—2)；广西师范大学科研基金[s pp【)md by Key Technologies Research and Development Program of Guangxi
(0228019—2)：Scientific Research Foundation of Guangxi Normal University]
作者简介：李惠敏(1978一)，女 ，广西北流人 ，硕士，讲师，主要从事分子生物学研究
通讯作者(Author for c0respDndence)
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 李惠敏等：罗汉果雌雄株同工酶性别鉴定研究 793
酶同工酶(ES~I、)、超氧化物歧化酶 同工酶(SOD)、多
酚氧 化 酶 同工 酶 (PPO)和 过 氧 化 氢 酶 同工 酶
(CAT)之间的差异，旨在 找出与罗汉果雌、雄株性
别相关的特异性同工酶谱带 ，为罗汉果性别的早期
鉴定及野外标本的雌、雄株鉴别提供依据 。同时，也
希望能找出与雌株结果数量相关的同工 酶标记 ，为
罗汉果高产单株的鉴别提供参考 。
1 材料与方法
1．1材 料
雌雄株 同工酶的比较为罗汉果(青皮果 品种)幼
苗的雌、雄株成熟叶片。高产、低产和不结果雌株之
间的分析以结果后期植株 的成熟叶片为材料(青皮
果品种)。
1．2酶液的制备
分别称取 1 g叶片样 品，置于预冷的研钵中，过
氧化物酶同工酶提取按质量体积比 1：1O，其余 4种
同工酶提取按质量体积比 1：3加入 0．2 mol／L磷酸 ．L
缓冲液(pH7．0)，并加入少许石英砂，冰浴研磨成匀
浆，4℃静置 5～10 min，然后于 4℃，8 000 r／rain离
心 10 min，取上清液即为酶液。所有取样重复3次。
1．3凝胶电泳
采用垂直板状不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，分
离胶及浓缩胶 的浓度分别 为 7．5 (pH8．9)和 4 9／5
(pH6．8)，电极缓冲液为 Tris一甘氨酸(pH8．3)，凝胶
大小为 13 cmXll m1×0．1 cm。过氧化物酶上样量
为 15 L，酯酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化
氢酶上样量均为 60 L，4℃条件下电泳，浓缩胶电压
为 8O V，分离胶电压为 200 V，电泳时间约 3 h。
1．4同工酶染色
过氧化物酶 同工酶染 色采用醋酸 一联苯胺法 ，
酯酶同工酶采用 a一醋酸萘酯、l3一醋酸萘酯和固蓝盐
B染色(李惠敏等 ，2004；刘东旭等 ，l995)；超氧化
物歧化酶 同工酶染色参 照 Beauchamp等(1971)的
负染法；多酚氧化酶 同工酶采用邻苯二酚一对苯二
胺染色(高丽锋等，1997)；过氧化氢酶同工酶染色采
用铁染色法(董泗建等，l996)。
凝胶进行染色后 ，用 7 醋酸保存并拍照 ，所有
样品重复实验3次，根据Rf值(同工酶带迁移距离／
溴酚蓝指示剂迁移距离)绘出各酶谱图并记录各酶
带的活性度 。活性度按酶 带显示程度分为 5个等
级 ：最强带>次强带> 中强带>较强带>强带>弱
带 ；用符号依次表示为 +++++ ，+ +++，++
—一，—一—一，—一，——
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶 带编号
— — — — 一 P1
—— ⋯ ⋯ —— P2
图 1 罗汉果过氧化物酶同工酶图谱
Fig．1 Peroxidase isozyme pattern of
S．grosvenorii in PAGE
最强带>次强带>中强带>较强带>强带>弱带。1，2，3
为雄株 ；4，5，6为高产雌株 ；7，8，9为低产雌株 ；1O，
l1，12为不结果雌株。下同。
1，2，3：舍；4，5，6：high yield旱；7，8，9：low yieldg；
1O，11，12：acarpous旱．The same as folows．
2 结果分析
2．1过氧化物酶 同工酶分析
在罗汉果叶中，POD同工酶含量最高，活力也
很强 ，雌、雄株间及不 同种类雌株问的活力显示出较
表 1 罗汉果雌雄株 POD同工酶的迁移率
Table 1 Rf of POD isozyme of male and female plant
为明显的差异。其同工酶图谱、各酶带的迁移率 Rf
值和 3种类型雌株的酶带活性度分别见图 1、表 1
和表 2。
从图1可以看到，罗汉果雄性植株只有第 2、3、
4、5、8、11条酶带，其中雄株的特异酶带是 P5和
P11；而雌性植株 的酶 带为 P1、P2、P3、P4、P6、P7、
P8、P9、P10，其中P1、P6、P7、P9、P10这 5条带是雌
株的特异酶带。雌、雄株的共有酶带是第 2、3、4、8
O
0^ B 1 二 兰
． _ -- ● =
_ _ __=
兰
- ．● ●--
_ 二 皇 一
兰
二 II—
维普资讯 http://www.cqvip.com
794 广 西 植 物 27卷
注 ：A为活性度 ，下同。 Note：A represeDt activity
图 2 罗汉果酯酶同工酶图谱
Fig．2 Esterase isozyme pattern of
S．grosvenorii in PAGE
条，共有带的迁移率见表 1。
从酶带的活性度上看，雌株的整体活力较雄株
强。在三种不同类型的雌株中，高产雌株、低产雌株
和不结果雌株在酶的活性上有较大的差异 (图 1，表
2)。P1、P2、P3、P4条 ，高产雌株和低产雌株的活力
一 样，而不结果雌株的活力均比它们强；高产雌株则
在 P7～Pl0酶带是最强的。
2．2酯酶同工酶分析
从 EST酶谱 (图 2)可 以看 出，3种雌性材料具
有完全相同的酶带：E1、E2、E3、E5、E6、E7、E8、E9
和 El0(迁移率见表 3)。而雌、雄植株酶谱之 间存
在明显 差 别。E4为 雄 性 株 的 特 异 带 ，Rf值 为
0．524；E8和 El0是雌性植株 的特异带 ，Rf值分别
为 0．719和 0．934。
2．3超氧化物歧化酶同工酶分析
罗汉果SOD同工酶分析结果表明，叶片的 SOD
同工酶在雌、雄株之间也存在着明显差别(图 3)。相
表 3 罗汉果雌雄株 EST同工酶的迁移率
Table 3 Rf of EST isozyme of male and female plant
+
酶带编号
一 三 蠢 ：-_Us2sS3
== = == = S4 一 _ ‘s5蚤
图 3 罗汉果超氧化物歧化酶同工酶 图谱
Fig．3 Superoxide dismutase isozyme pattern of
S．grosvenorii in PAGE
应酶带的迁移率和活性度分别见表 4和表 5。从图
3中可看出，雄株仅有 S3、S4、S5三条带，而雌株除
了具有与雄株相同的 S3、S4、S5三条带外 ，还有 S1、
S2、S6特有带。高产雌株与低产雌株、不结果雌株
的酶带活力 主要差 异在 第 1、2条 上 ，高产雌 株 的
S1、S2酶带活性程度强 ，而低产雌株和不结果雌株
的活性则弱。
表 4 罗汉果雌雄株 SOD同工酶的迁移率
Table 4 Rf of SOD isozyme of male and female plant
酶带编号 No． s1 s2 s3 s4 s5 s6
Rf0 0．416 0．666 0
．
716
Rf 0．375 0．390 0．416 0．666 0
． 716 0．781
表 5 三种类型雌株的 SOD同工酶酶带的活性度
Table 5 Activity of SOD isozyme of three
kinds of female plant
酶带编号 No． s1 s2 s3 S4 s5 s6
2．4多酚氧化酶同工酶分析
在 PPO同工酶图谱(图 4)中，雄性植株的 PPO
图谱较为简单，仅有 2条酶带(03、04)，而雌性植株
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 李惠敏等：罗汉果雌雄株同工酶性别鉴定研究 795
具有 7条酶带(O1～O7，迁移率见表 6)，其中 03和
O4带与雄性植株共有 。
2．5过氧化氢酶 同工酶分析
CAT同工酶酶谱(图 5)表明，雌株和雄 株之 间
存在明显差别，雄株仅有 C3和 C4二条带 ，其 中 C3
为雄株特有 ，而雌株的特异带 为 C1和 C2。在酶的
活性上，三种雌性材料 的 CAT活性在酶带 图谱上
没有明显差别。
+
酶带编号
== == =： == 04／J． ●■⋯ 00一
■■ ●⋯
= 二 = O6
图 4 罗汉果多酚氧化酶同工酶图谱
Fig．4 Polyphenol oxidase isozyme pattern of
S．grosvenorii in PAGE
O1
O2
O3
O5
O7
表 6 罗汉果雌雄株 PPO同工酶的迁移率
Table 6 Rf of PPO isozyme of male and female plant
酶带编号 No． Ol 02 03 04 05 06 07
Rf0 0．566 0．626
Rf．／ 0．399 0．434 0．566 0．626 0．667 0．761 0
． 799
+
酶带编号
_- _- _- C1
0 0 0 C2
一 C3
04
图 5 罗汉果过氧化氢酶同工酶图谱
Fig．5 Catalase isozyme pattern of
S．grosvenorii in PAGE
3 讨论
在植物雌、雄性别的鉴定和分化机理的研究中，
同工酶标记是常用的一种研究手段。由于酶是基因
表达的直接产物，不同组织器官的同工酶谱特异性
也反映了基因表达的特异性，所以同工酶技术是一
种有效的手段 ，可用于鉴别许多在开花前从外部形
态上难以鉴别雌雄的植物(董莉娜等，2006；李瑞丽
等 ，2006)。
表 7 罗汉果雌雄株 CAT同工酶的迁移率
Table 7 Rf of CAT isozyme of male and female plant
本研究对罗汉果雌、雄植株之间的 POD、EST、
CAT、SOD和 PPO 同工酶谱进行 了比较 ，雌、雄株
在上述 5种同工酶的酶谱上都有明显的区别。特别
是CAT、SOD和PPO同工酶酶谱较为简单，容易辨
认，可作为罗汉果雌、雄株鉴别的指标。罗汉果雌株
的特异带 比较多，在 POD有 Pl、P6、P7、P9、P10，
EST中为 E8、E10，SOD中是 S1、S2、S6，PPO中有
O1、O2、O5、06、O7，CAT 中有 C1、C2。这些差异
带也可作为罗汉果雌、雄植株的鉴定依据。
除了在雌、雄性别鉴定研究外，本研究还发现高
产雌株、低产雌株、不结果雌株在所研究的5种同工
酶中，其酶谱相 同，仅在 活力上有所差别。如 POD
酶谱中，高产雌株的P7～P10带最强，SOD酶谱中，
高产雌株的S1、S2酶带活性程度强，而低产雌株和
不结果雌株的活性则弱。但这些酶谱活性程度的不
同还难以作为罗汉果产量的明显标记，故罗汉果高
产植株的的鉴定还需利用其他分子标记进行分析。
参考文献：
AiX(艾辛 )，Zhu LL(祝莉莉)，Shu LH(舒理惠)，el a1．2000．
Correlation of sex expression and three oxidase isozyme in CU—
cumber plant(Cucumis sativus)(黄瓜植株性别表现与 3种氧
化酶同工酶的关系)EJ]．J Wuhan Bot Res(武汉植物学研
究)，18(3)：187～188
Beauchamp C，Fridovich I．1971．Superoxide dismutase：Improved
assays and an assay applicable to acrylamide gels[J]．Ann
Bichem ，44：276— 287
Chen XL(陈晓玲)，Liang H(梁红)，Zhu DH(朱东华)．2004．A—
nalysis of Est and Pox isozyme in the sex of Attinidia(猕猴桃
不同性别过氧化物酶及酯酶同工酶分析)[J]．Agric (农
业与技术)，24(1)：40—43
Dong LN(董莉娜)，Su X(苏雪)，Zhang K(张昆)，el a1．2006．
Application of DNA molecular markers on sex identification of
dioecious plants(DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中
的应用)[J]．Guihaia(广西植物)，26(1)：63—68
Dong SJ(董 泗 建 )，Liu CL(刘 昌玲 )．1996．An iron staining
method for determination of catalase activity(-种鉴定过氧化
氢酶同工酶活性的铁染色法)[J]．Progres ”Biochemistry
(下转第 672页 Continue on page 672)
维普资讯 http://www.cqvip.com
672 广 西 植 物 27卷
伏雄等(1997)报道的结果不尽一致，其观察材料采
自广东连州。两者 的主要区别在于：前者花粉具 3
拟孔沟 ，具沟膜 ，膜上有数量较多的、粗的颗粒 ；后者
花粉具 3拟孔沟 ，具沟膜 ，膜上有稀疏的、细的颗粒。
结果表明不同居群的报春苣苔在花粉形态上存在着
一 些差异和分化。笔者在对采 自湖南江华、广东连
州的报春苣苔花部结构进行的初步研究中也发现一
些差异：湖南居群的叶较厚 ；花较大 ，花冠呈较深紫
红色；花药位置较低，距离花冠筒基部约 1 mm；花
盘由几枚连成环状的腺体组成。而广东居群则叶较
薄；花较小，花冠呈浅紫红色，花药位置较高，距离花
冠筒基部约 2 mm；花盘明显为 2近方形腺体组成。
这些报春苣苔不同居群的分布区彼此相距上百千
米，初步推测可能是 由于地理隔离的原因而引起上
述差异和分化。
中国科学院昆明植物研究所韦仲新研究员的热
情帮助和悉心指导，广西植物研究所韦毅刚先生提供
部分实验材料，中国科学院植物研 究所肖荫厚工程师
在技术上给予许多有益的帮助，在此谨致谢意!
参考文献 ：
王文采．199o．中国植物志(69)——苦苣苔科EM]．北京：科学
出版社 ：125—581
王文采．1983．苦苣苔科三新属Ec]．植物学集刊 ，1(1)：15—24
王伏雄，钱南芬 ，张玉龙，等．1997．中国植物花粉形态[M]．第 2
版．北京 ：科学出版社 ：5—10，204—206
韦仲新．2003．种子植物花粉电镜图志[M]．昆明：云南科技出
版社 ：1—5
李振宇 ，王印政．2004．中国苦苣苔科植物[M]．郑州 ：河南科
学技术 出版社 ：475-476
Cao M(曹明)，Lin CR(林春蕊)，Tang SC(唐赛春)，et a1．2003．
Polen morphology of some species of Oesneriaceae from Guangxi
(广西苦苣苔科植物花粉形态)[J]．Cruihaia(广 西植物)，23
(2)：139— 142
Erdtman G．1952．Polen morphology and plant taxonomy：angio—
sperms[M]．Stockholm：Almquist Wiksel
Erdtman G．1969．Handbook of palynology-an introduction to the
study of polen grains and sporeEM~．Copenhagen：Munksgaard
Luegmayr E．1 993．Polen characters of Old World Gesneriaceae
(cytandroideae)，with special reference to SE Asian taxa[J]．
Grana，32：221— 232
Wang wT(王文采)．1984．Duo Genera Nova Oesneriacearum E
Sina Australi(华南苦苣苔科二新属)[J]．Acta Phytotaxon Sin
(植物分类报)，22(3)：185—19O
丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 木 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰 丰
(上接第 795页 Continue from page 795)
and Biophysics(生物化学与生物物理进展)，23(1)：86—88
Fan SX(范双喜)，Song XF(宋学锋)．1995．Relationship between
sex and isozymes of peroxidase in Asparagus plants(石刁柏性
别表现与同工酶的关系)[J]．Acta Agric Boreall—Sin(华北农
学报)，10(2)：67—71
Gao LF(高丽锋)，Li CX(李彩霞)，Mao X(毛雪 )，et a1．1997．
An analysis of polyphenol oxidase isozymes between resistant
and susceptible coton varieties to Cotton Aphid(棉花不同抗、感
蚜虫品种的多酚氧化酶同工酶分析)[J]．J Shanxi Agric
Univ(山西农业大学学报)，17(3)：229—23l
Li RL(李瑞丽)，Lu LD(卢龙斗)，Gao WJ(高武军)，et a1．2006．
Advances in sex identification of dioecious plant(雌雄异株植物
性别鉴定的研究进展)[J]．Guihaia(广西植物)，26(4)：387—
391
Li HM(李惠敏)．Qin XM(秦新民)．2004．The analysis on pollen
isozymes of Citrus grandis var．shatinyu(沙 田柚花粉萌发前后
同工酶分析)[J]．J Guangxi Normal Univ(Nat Sci)(广西师
范大学学报 自然科学版)，22(3)：85—90
Liu DX(刘东旭)，Li ZX(李子先)．1995．Studies on the charac—
teristic bands of esteras in the leaf blades of rice and the possibil—
ity of identifying interspecific hybrids using them as biochemical
markers(水稻叶片酯酶同工酶特征酶带鉴定远缘杂种的研
究)[J]．J Southwest Agric Univ(西南农业大学学报)，17(5)：
386— 39O
Lou QF(娄 群峰)，Yu JZ(余 纪 柱)。Chen JF(陈劲枫)，et a1．
2002．Studies on genetic bases and markers of sex differentiation
in plants(植物性别分化的遗传基础与标记物研究)[J]．Chin
Bul Bot(植物学通报)，19(6)：684—691
Penel Ci，Greppin H． 1 9 72．Evolution of the auxin-oxidase and
peroxidase activity during the spinach s photoperiodic induction
and sexualistion[J]．Plant Cell Physiol，13(1)：151—156
Petig N，Rudich J．1972．Peroxidase and IAA oxidase activity and
isoenzyme patterns in cucumber plants as afected by sex expres—
sion and ethephon[J]．Physiol Plant，27：156—160
Yuan SL(袁仕 禄)，Jia WG(贾卫 国)，Zhan JR(战景仁)，et a1．
1999．Se~ng of Schisandra sphenantherazothz Rehd Wils by
isozyme preoxidase(华中五味子雌雄株过氧化物酶同工酶性别
鉴定研究)[J]．J Northeast Agric Univ(东北农业大学学报)，
30(2)：195— 198
Zhang LP(张立平)，Lin BN(林伯年)，Shen DX(沈德绪)．1998．
The study on sexual distinction of dioecism in Fitis(雌雄异株葡
萄的性别鉴定研究)[J]．Chin Bull Bot(植物学通报)，15(4)：
63— 67
维普资讯 http://www.cqvip.com