全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(5)：679— 683 2011年 9月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．05．021
银杏胚的培养及不定芽的产生
陈 颖，徐彩平，盛丽莉，李淑娴，曹福亮
(南京林业大学 森林资源与环境学院，南京 210037)
摘 要：通过对银杏未成熟胚和近成熟胚的培养 ，研究其不定芽的发生情况 。结果表明：(1)银杏的种胚存在
生理后熟现象 ，1O月上旬，胚未成熟 ，在 360个种核中，小子叶胚数(1．0～3．0 mm)为 26．1 ，大子叶胚(3．0～
5．0 mm)的种子数 占总种核数的 42．2 ，种核的出胚率为 7l_1％；(2)大子叶胚和小子叶胚接种在不同的培养
基上后，发现大子叶胚膨大，子叶伸长膨大，胚愈伤化程度小。而小子叶胚全部愈伤化，继续培养出现芽点，频
率在 35．0 以上 ；(3)大子叶胚继代在改 良 MS+0．2 mg·L IAA+0．75 mg·L- KT培养基后，发现子叶远
基端有不定芽的产生 ，最高频率达 2O．0 ；(4)近成熟胚在改良 MS+NAAO．01 mg·L- +6-BAI．0 mg·L-
培养基上 ，胚芽出芽率最高达 42．5 ，继续培养后发现有丛芽点的出现 ，再继续生长 20 d后出现许多芽丛 ，芽
数达 3个 ，频率在 30．0 以上。
关键词：银杏 ；未成熟胚；近成熟胚 ；不定芽
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2011)05—0679—05
^l ·● ● l 1 n J■ J■ ● 』 AdventitioUS buds t0I．Inatl0n [rom lm m ature 0r
near mature embryo cultures 0f Ginkgo biloba
CHEN Ying，XU Cai-Ping，SHENG Li-Li，LI Shu-Xian，CAO Fu-Liang
(Colege of Forest Resource and r0M ，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract：The formation of adventitious buds of( 咄gU were studied by using near mature and immature embryos cul—
tures．The results were as followed：(1)G embryo had characteristic of physiological after-ripening．The rate of
small cotyledon embryos(1．O一3．0 mm)was 26．1 ，the rate of large cotyledon embryos(3．0-5．0 mm)was 42．2
and the total rate of the seed with embryo was 71．1 in October；(2)The coW1edons from large cotyledon embryos be—
came swolen and few calus was produced after cultured on different induction mediums，but the smal cotyledon embryos
0f al could induced calus and the green spots were intiated on the surface of calus after subculuring two times；(3)The
adventitious buds formed from cotyledon of large cotyledon embryos after subeultured on modified MS medium with 0．2
mg·L IAA and 0．75 mg·L- KT．The highest emergence of adventitious buds was 2O．O ；(4)The highest frequen-
cy of embryo bud germination of near ma ture embryos(42．5 )and the highest number of bunNe buds per explant(3．O)
were obtained on modified MS medium with 0．O1 mg·L- NAA and 1．0 mg·L 6-BA．
Key words：Ginkgo biloba；immature embryo；near mature embryo；adventitious buds
在银杏的组织培养中，国 内外学者先后在未成
熟胚 、成 熟胚 、子 叶、茎 段 的分化有 了一定 的研究
(Choi等 ，2003，Tommasi等，2004；Camper等 ，
1997；郭长禄，2004，2005；陈颖等，2006)。但仍然存
在分化难、分化数少、体系不稳定的问题。我们已通
过对无菌苗茎段部位的分别培养，建立了一个稳定
收稿 日期；2010 10 13 修回日期 ：2011—03—16
基金项目：国家科技支撑计划项目(2oo6BAD18Bo301)；江苏省普通高校 自然科学研究计划(07KJB220048)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目
[Supported by the National Science and Technology Research and Development Program of China(2006BAD18130301)；Scientific Research Fund of Jiangsu
Common Institutions of Higher Education(07KJB220048)；Priority Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions]
作者简介：陈颖(1966一)，女 ，副教授 ，主要从事抗性生理和生物技术研究 ，(E-mail)chynjfu@163．corn。
通讯作者：曹福亮，博士，教授，主要从事经济林 、生物技术方面的研究 。
680 广 西 植 物 31卷
的银杏茎段组培快繁体系 (陈颖等 ，2010)。通过定
芽 (包括顶芽和腋芽)的繁殖可以获得遗传性状稳定
的植株，但仍然存在繁殖系数少的困难。为进一步
提高银杏不定芽的发生频率和减少偶然性因素，笔
者对银杏的成熟胚和未成熟胚愈伤组织诱导和不定
芽的分化进行了研究，以期为建立高频率的不定芽
或体细胞胚再生体系提供有力的技术指导。
1 材料和方法
1．1种胚来源及分类
种核来源于江苏邳州和盐城(品种 ：大佛指)，种
核 9月下旬收获后放入 4℃冰箱 中储藏 2周左右。
银杏种子具有休眠特性，收获时胚很小或没有，称为
胚未发育完全型，在储藏的过程中种胚逐渐长出或
长长 。种胚在发育过程中出现不同步性 ，参考 Choi
等(2003)和郭长禄(2005)法以及胚的长度可将银杏
的胚分为 5种类型 ：一类胚长小于 1 mm 以下呈米
粒状 ，子叶和胚芽均未 出现 ，称 为圆球胚 ，第二类在
1．o～3．0 1Tim之间，在体视显微镜下可观察到子叶
刚开始膨大 ，称为小子叶胚(图版 工：A1)；另一类胚
长 3．O～5．0 mm，这一类胚子叶已经出现，但子叶
稍部尖削，胚芽部开始膨大，称为大子叶胚(有时有
双胚现象，图版 I：A2)。这 3种类型的胚出现在 1O
月 1O号之前 (南京地区)统称为未成熟胚 。11月上
旬～12上旬的胚大都在 5．0 mm左右，子叶和胚芽
都已完整出现，介于成熟胚与未成熟胚之间，称为近
成熟胚(子叶有两片 ，也有 3片的，图版 工：A3)。次
年 2月的胚完全成熟称为完全成熟胚(有的胚长可
以达到 10 mm以上，不同品种之间有差异，但大都
超过 5．0 mm以上)(陈颖等，2006)。本研究接种的
胚为 1O月上旬和 11月上旬的胚 。
1．2种胚的处理与接种
将银杏种 核用 5 84消毒液浸泡 10 min后 ，
剥去骨质中种皮 ，依次用 7O％的乙醇浸泡约 2 min
和 0．1 的 HgC1 浸泡 8～10 min，无菌水清洗 5
次 ，用无菌的滤纸吸去材料表面的水份 ，在无菌条件
下从胚乳中取出胚 ，接种在新鲜培养基上 。
1．3胚的培养
将胚 接种 在 MS、改 良 MS(NH NO。减半 )、
DCR 3种基本培养基，同时附加不同浓度的 6-BA、
KT、TDZ、2，4-D、CH(水解酪蛋白)进行培养 ，每瓶
4个或 5个外植体 ，每个处理 4-10瓶 。
1．4培养基配制、灭菌及培养室条件
在以上培养基 中各添加蔗糖 3O g·L 、琼脂
7．0 g·L ，pH值 5．8左右；121℃高压灭菌 20 min，
每25 d继代 1次。培养室温度为(25±2)℃，光强为
30~40 tLmol·m-z． ，每天 14 h光照 10 h黑暗。
1．5统计分析
所有数据采用 SPSS12．0进行方差分析，Dun—
can检测方法在 0．05水平检测差异显著性 ，所有百
分数在统计分析前均进行反正弦数据转化 。
2 结果与分析
2．1种核 出胚率
通过剥取银杏种核 中的胚(10月上旬 的邳州种
胚)发现，在 360个种核中有胚的种核总数为 256
个，无胚的种核数为 104个。具大子叶胚的种核数
占总种核数的 42．2 ，具小子叶胚 的种 核数 为
26．1 ，具 圆球胚的种核数为 2．8 ，该种核批的出
胚率为 71．1 ，无胚率为 28．8 。
2．2不同调节剂对未成熟胚愈伤组织诱导的影响
’ 将不同类型的种胚接种在不 同的诱导培养基上
培养 20 d时发现，胚诱导的愈伤组织生长状况出现
差异 ，小于 1．0 mm 的圆球胚易褐化 ，不易成活。小
子叶胚(1．0～3．0 mm)由于分化程度较低 ，经培养
后极易进入脱分化阶段而产生愈伤组织，诱导率达
100 ，诱 导的愈伤组织呈 白色透明状 ，继代两次后
出现多个芽点 (图版 I：B1一B3)，其发生频 率在
35．0 以上 ，继续培养后芽点继续生长成完整芽 ，但
最终没有成苗。
银杏大子叶胚(3．O～5．0 mm)由于分化程度较
高 ，进入脱分化时间较迟 ，一般在愈伤组织形成前胚
继续发育，胚芽部膨大、子叶张开 ，呈黄绿色 ，整个胚
愈伤化不明显。从愈伤组织诱导率来看，高浓度的
6一BA(2．5 mg·L- )比 KT更易诱导愈伤组织 ，如 1
号培养基中大子叶胚 的愈伤组织诱导率最高达
100 ，高浓度的 2，4一D也使胚易愈伤化。另外愈伤
组织诱 导率还与基本培养基有关，改 良 MS培养基
较 DCR培养基更容易 ，后者(6号培养基)诱导率 只
有 6O (表 2，Pd0．05)，但 DCR培养基较改 良 MS
培养基更有利于子叶的生长 ，500 mg·L CH(水解
酪蛋 白)对胚愈伤组织的诱导效果不明显。
2．3不 同调节剂对大子叶胚不定芽诱导的影响
上述大子叶胚诱导的愈伤组织继代 2次后，在

682 广 西 植 物 31卷
1～2号培养基上愈伤组织易 出现褐化 ，严重的出现
死亡 ，可能 6-BA浓度过高所致 ，而在 3～6号培养
基上褐化较轻。将无褐化已愈伤化的胚接种到改 良
MS+0．2 mg·L。IAA+0．75 mg·L。 KT与改 良
M S4-0．2 mg·L。6-BA4- 3．0 mg·L。2，4一D4- 500
mg·L。CH培养基上，发现在其子叶上不定芽的产
生，发生频率最高在 20％左右(表 3)，但不定芽继续
培养后没有继续生长 。
2．4不同调节剂、不 同培 养基对近成 熟胚不定芽诱
导的影响
将银杏的近成熟胚(11月上旬接种，胚长在 5
mm左右)接种在改良MS和DCR培养基上附加不
同浓度 NAA和 6-BA培养 ，10 d后发现胚芽长 出并
膨大化(图版 I：B3)，继续培养 20 d后芽体达 3～4
cm 。
，不同培养基和不同品种间成芽率存在显著性
差异 (P<0．05)，在改良 MS+0．01 mg·I NAA
表 1 银杏种胚的分类及出胚率
Table 1 Embryo classification and percentage
of seeds with embryo in total seeds
表 2 不同培养基对银杏幼胚(邳州)愈伤组织诱导的影响 (接种 20 d，调节剂浓度 mg·L 1)
Table 2 Effect of different regulators on calus induction of Ginkgo immature embryos
注：****表示外植体全部愈伤化；***表示外植体 3／4愈伤化；**表示外植体 1／2部愈伤化；同列内相同字母表示邓肯氏新复极
差法检验在0．05水平上差异不显著，下同。小于 1．0 1Tim 的胚由于死亡，未计算在内。
表 3 大子叶胚继代培养后不定芽的发生 (调节剂浓度 mg·I 。)
Table 3 The occurrence of adventitious buds after embryo subculture
+1．0 mg·L。6-BA出芽率最高 ，邳州胚达 42．5 Vo，
盐城胚达 40．0 (表 4)。尽管出芽率在改 良 MS培
养基上稍优于 DCR，但主要还是不同的调节剂配 比
和浓度在影响着出芽率 ，如加 TDZ后盐城胚的出芽
率达 4O．0 ，芽很健壮。而邳州胚只有 10．0 ，说
明产地不同也影响银杏胚的出芽率。将上述胚的子
叶、根部剪去 ，胚芽继续在原培养基上培养 30 d后 ，
发现胚芽继续膨大 ，这些胚芽会 出现不同的发育状
态 ，有的上面出现许多圆球状凸起 ，凸起数最高多达
9个(图版 工：C1)。有 的出现许多叶丛 ，这些叶丛丛
5期 陈颖等：银杏胚的培养及不定芽的产生 683
生状 ，长度差别不 大，没有主枝之分 (图版 I：C2)，
有的叶丛长度差异明显，有主枝之分 (图版 工：C3)。
这些 叶丛继续培养 20 d后 ，叶丛间逐渐变为可辩的
芽丛，有顶芽和侧芽之分，丛芽数可达 3个(图版 I：
D1一D4)，其发生频率在 30．O 以上，将其分割成单
芽继续培养 ，芽不断抽长生长良好。
表 4 不同培养基对近成熟胚胚芽生长的影响 (调节剂浓度 mg·L- )
Table 4 Effect of different mediums on growth of near mature embryo buds
3 结论与讨论
在 10月上旬 ，胚未成熟 ，大子叶胚的种子数 占
总种子数 的 42．1 ，小子叶胚数为 26．1 ，种子 的
出胚率为 71．1 ；胚接种后，发现大子叶胚胚芽部
膨大 ，子叶伸长膨大，胚愈伤化程度小 。而小子叶胚
无胚芽长出，整个胚全部愈伤化，继续培养出现芽
点，发生频率在 35．0 以上；大子叶胚继代在改良
MS+0．2 mg·L- IAA+0．75 mg·L- KT培养基
中，其子叶远基端 处有不定芽 的产 生 ，最 高频率达
20．0 ；近成熟胚在改 良 MS+0．01 mg·L。NAA
+1．0 rng·L- 6-BA 培养基上 ，胚芽 出芽率最高达
42．5 ，最多的丛芽数达 3个 ，频率在 30．0 以上 。
银杏的种胚存在生理后熟现象(芮海云，2009；
曹福亮，2002；曹邦华，2001)，但对于未成熟胚和成
熟胚 的大 小 和时 问并 没 有 明确 的划 分 。Choi等
(2003)根据胚的长度不同将银杏未成熟胚划分为球
形胚(< 1 mm)、心形 胚 (1．0～ 1．5 mm)、鱼雷 形
(1．5～2．5 mm)、子叶形 (>2．5 mm)四种类型。郭
长禄(2005)将未成熟胚划分 为>3．0 mm 和<3．0
mm的两种。我们通过数年的银杏胚培养发现，从
9月份采收到次年的 2月份是银杏种胚从未成熟到
成熟到完全成熟的发育阶段 ，根据胚 的长度和子叶
的大小及采收后储藏时间长短可把胚的成熟度划分
为圆球胚、小子叶胚 、大子 叶胚、近成熟胚 、成熟胚 5
种，作为对银杏胚发育成熟度类型的补充。
银杏的胚发育和离体培养早就引起 了学者们 的
注意(吴元立，1998)。Laurain等(1993a，b)通过雌
配子体 、未成熟胚培养成功地诱导了胚状体的发生 。
郭长禄等(2005)发现未成熟胚的下胚轴易产生胚状
体 ，Choi等(2003)发现未成熟胚 的子叶可以产生不
定芽，但这些芽并没有继续发育。我们在未成熟胚
愈伤组织和子叶远基端也 都发现 了不定芽的产生 ，
验证了他们的结果。尽管未成熟胚的分化能力最
强，但材料受季节和取样时间的限制太大 ，过早过晚
都不易诱导胚状体和不定芽的产生，至今大部分学
者诱导出来的不定芽或胚状体只发育到某一阶段，
并未完全成苗 ，这限制 了银杏这一古老树种的快繁
和基础理论的深入研究。
利用近成熟胚(11月上旬)的培养 ，发现胚芽是
产生丛生芽的很好材料，在胚外植体上可观察到芽
点的出现，由于银杏的芽体是轮生叶形，芽体很大，
刚开始出现的芽点或突起很多，似有许多不定芽，如
果这些芽点不继续发育，就很难辨认芽丛的个数，很
可能把叶丛误认为是大量 的芽丛 ，经过我们数次 的
试验证明，这些芽点或叶丛能够发育成 3个正常丛
芽 ，且能够稳定地继代 和生长 。这一研究结果为建
立高频、稳定遗传的银杏再生体系提供了技术指导。
参考文献 ：
曹福亮．2002．中国银杏[M]．南京 ：江苏科学技术出版社
Camper ND，Coker DE，W edge DE，ela1．1997．In vitro culture of
Oainko[J]．In Vitr Cell Dev Biol Plant，33：125—127
Cao BH(曹帮华 )，Cai CJ(蔡春 菊)．2001．Physical research of
Ginkgo seeds(银杏种子 生理 研究进展)[J]．ShandongAgric
Sci(山东农业科学)，(1)：40—42
Chen Y(陈颖)，Cao FL(曹福亮)．2006．Studies Oil organ differ—
entiation of different explants of Ginkgo biloba in vitro(不同银
(下转第 705页 Continue on page 705)
5期 刘金磊等：新鲜罗汉果风味成分的 GC—MS分析 705
(3．81％)、醋酸仲丁酯 (3．05 )；占挥发油 总量 的
64．18 。另外 ，在罗汉果 的挥发油中 尚有 16种组
分经过计算机检索质谱库及其它标准谱对照无法准
确定性 ，有待今后工作 中进 一步确认 。罗汉果风味
主要成分为 2一甲基一2一丁酸 丁酯 与已发表 的文章一
致 (黄丽捷等，2009)，但是含量明显较高。2～甲基一2一
丁酸丁酯具有有强烈的、甜润的水果香气 ，并有香蕉
和菠萝似的香韵 ，现被广泛用于食用香精 、烟草、日
用化学品香精中。
冷冻干燥提取低温富集风味成分的方法是一种
超低温 (一50℃)的分离技术，由于提取温度极低，与
水蒸气蒸馏法相 比，能最大程度的避免植物挥发油
提取过程 中化学成分 的破坏 ，反 映出植物挥发油的
实际组成。随着罗汉果果酒、新鲜罗汉果速冻粉茶
等产品的相继面市，如何更好地去除或者利用其香
味成分是必须解决 的问题 ，希望本研究能为鲜 罗汉
果产品风味质量的控制提供理论依据 。
参考文献 ：
中华人 民共和国卫生部药典委员会．2005．中华人民共和 国药
典[M]．北京 ：化学工业出版社 ：148
竹本常 松，在原 重信，中岛正，等．1983．罗汉果成 分研究 (I)
[M]．药学杂志(日)，103：1 151
李锋，李典鹏 ，蒋水元 ，等．2003．罗汉果栽培与开发利用EM]．
北京 ：中国林业 出版社
李锋 ，蒋水元 ，李典鹏 ，等．2010．罗汉 果栽 培与化学成分研究
EM]．南宁：广西科学技术出版社
Chen QB(陈全斌)，Zhu J(朱静)，Tan HS(谭洪盛)．2011．Iden—
tification of flavone aglycones in Momordica grosvenorii flower
EJ]．J Anhui Agric Sci(安徽农业科学)，39(2)：792—794
Huang LJ(黄丽婕)，Su XJ(苏小建)，eta1．2009．Analysis of vol—
atile oil components from Siraitia grosvenorii and S．grosvenori
wine quality(鲜罗汉果挥 发性风 味成 分分析 )EJ]．Food Res
Develop(食品研究与开发)，30(10)：106—109
Kasai R，Nie Ruiliu，Nashi K，et a1． 1989． Sweet cucurbitane gly—
cosides from fruits of Siraitia siamensic(chi-zi Luo-han-guo)a
Chinese folk medicine[J]．Agric Biol Chem，53(12)：3374
Li DP(李典鹏)，Chen YY(陈月园)，Pan ZH(潘争 红)，et a1．
2004．Study on variation of mogrol glycocides from fruits of Si—
raitia grosvenorii in diferent growing ages(不同 日龄罗汉果甙
类变化研究)EJ]．Guihaia(广西植物)，24(6)546—549
Matsumoto K，Kasai R，Ohtani k，et a1．1990． Minor cucurbitane
glycosides from fruits of Siraitia grosvenori(Cucurbitancaae)
[J]．Chem Pharm Bull，38(7)：2030
Si JY(斯 建勇 )，Chen DH(陈迪 华)，Chang Q(常 琪)，et a1．
1996．Isolation and determination of cucurbitane_g1yc0sides from
fresh fruits of Siraitia grosvenorii(罗汉果 中三萜甙的分 离和
结构测定)[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，38(6)：489—494
Xu WK(徐位坤)，Meng LS(孟 丽珊)，Li ZY(李 仲瑶)．1992．I—
solation and identification of a bitter constituent from Luo—han—
guo，sunripe fruits(罗汉果嫩果 中一个 苦味成分 的分离和鉴
定)IJ]．Guihaia(广西植物)，12(2)：136—138
(上接第 683页 Continue from page 683)
杏外植体器官分化的研究)[J]．J Northeast Fore Univ(东北
林业大学学报)，(6)：4—6
Chen Y(陈颖)，Cao FL(曹福亮 )，Xu CP(徐彩平)，et a1．2010．
Studies of stem segments culture in vitro of Ginkgo biloba(不同
部位银杏茎段培养及其位置效应研究)[J]．J Zhejiang Fore
Sci Tech(浙江林业科技)，(1)：28—31
Choi PS，Cho DY ，Soh W Y． 2003． Shoot organogenesis from
immature zygotic embryo culture[J]．Biologia Plantarum，
47(2)：309—312
GuoCL(郭长禄)，Chen LG(陈力耕)，He XH(何新 华)，et口 ．
2005． Plant regeneration from immatureembryos of G／nkgo bi—
loba(银杏幼胚离体培养再生植株的研究)[J]．Acta Hort Si
(园艺学报)，32(1)：105—107
Guo CL(郭长禄)，Chen LG(陈力耕)，He XH(何新 华)，et a1．
2005． Study on somatic embryogenesis of embryonic axis and
cotyledon in Ginkgo biloba and plantlet formatition(银杏胚轴、
子叶诱导胚状体发生及 成苗 的研 究)[J]．Sci Silv Sin(林业
科学)，41(2)：178—181
Laurain D，Jean CC，Tremouilaux GJ．1993a．Direct embryogene—
sis from female haploid protoplasts of Gi nkgo biloba，a medicinal
woody species[J]．Plant Cell Reports，12：656～660
Laurain D，Tremouillaux GJ．1993b．Embryogenesis from micro—
spores of Ginkgo biloba_J]．Plant Cell Reports，l2：501—505
Rui HY(芮海 云)，Gu GP(顾龚平 )．2009．Study of biological
character and storage of Gingko seeds(银杏种子的生物学特
性及储藏)rJ]．Chin Plant Res(中国野生植物资源)，
28(5)：10一 l3
Tommasi F，Scaramuzzi F． 2004． In vitro propagation of
Ginkgo biloba by using various bud cultures[J]．Bilogia
Plantrum，48(2)：297—300
Wu YL(吴元立 )，Yan XC(严学 成)．1998．The mature em—
bryo Ginkgo bilba：in vitro culture and its cytohistololo ca1
studies(银杏成熟胚培养 的细 胞组织学 观察 )[J]．Sci Silv
Sin(林业科学)，34(4)：8—13