全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(3)：407— 41O 2O1O年 5月
鼎湖山紫背天葵组织培养及植株再生
陈 刚，陈雄伟，王瑛华
(肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061)
摘 要：选用紫背天葵无菌苗叶片为外植体，建立了离体培养体系，并探讨其愈伤组织生长和不定芽诱导的
适宜培养条件 。通过研究得出：愈伤组织诱导的最佳培养基是 Ms+2，4-D 1．00 mg／L+6-BA 1．0 mg／L+
LH 200 mg／L+CH 200 mg／L+YE 200 mg／L，愈伤组织诱导率为 96．88％。不定芽诱导培养基为 MS+6一
BA 1．0 mg／L+LH 200 mg／L+CH 200 mg／L+YE 200 mg／L，不定芽诱导率为 77．3 。不定芽转至 1／2MS
培养基中均可 100 生根并长成完整植株 ，小苗移栽成活率达到 9O％。
关键词：紫背天葵；愈伤组织 ；不定芽 ；再生植株
中图分类号 ：Q943．1；$567 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)03—0407—04
Tissue culture and plant regeneration
in Begonia fimbristipula
CHEN Gang，CHEN Xiong-W ei，WANG Ying-Hua
(Faculty of Life Science，Zhaoqing University，Zhaoqing 526061，China)
Abstract：An efficient and rapid regeneration protocol was developed using leaves from geminating seedlings of Be—
gonia(imbristipula．MS medium containing 1．00 mg／L 2，4一D，1．0 mg／L 6-BA，200 mg／L LH，200 mg／L CH and
YE 200 mg／L was most effective in inducing calli．The frequency of callus induction was above 96．88 ．Optimal
medium for inducing adventitious buds is MS+1．0 rag／L 6-BA+200 mg／L LH+200 mg／L CH+YE 200 mg／L，
and the highest frequency reached 77．3％．The proper culture medium of rooting was 1／2MS and the rooting rate
was 100 ．The survival rate of the plantlet was up to 90％ after being transplanted into soil．
Key words：Begonia fimbristipula；callus；adventitious buds；plant regeneration
紫背天葵(Begonia／’imbristipula)为秋海棠科
植物，分布于我国广东、广西、福建和江西等地，模式
标本采自广东鼎湖山和罗浮山(中国科学院中国植
物志编辑委员会，1999)。它既可作为中药使用，同
时还被用于开发出多种紫背天葵的饮品和食品，现
已享誉全国(赵秀贞，1998)。但是，由于长期采挖野
生紫背天葵，自然繁殖系数低，自然资源已日益缺
乏，现已被列为珍稀保护植物(李耿光等，1983；陈刚
等，2008)。通过用组织培养的方法进行繁殖，能实
现紫背天葵人工栽培，可解决野生资源 日益短缺的
问题 ，避免野生紫背天葵的破坏性开采 ，满足人们生
活中对紫背天葵的需求 。同时为紫背天葵的药用研
究和大规模综合开发利用提供基础条件。
植物组织培养中的再生可通过两条途径，即体
细胞胚胎发生和器官发生。紫背天葵可通过体细胞
发生途径实现植株的再生(张兰英等，1988)，也可通
过叶片不定芽诱导及生根进行离体快速繁殖(陈刚
等，2008)。但器官发生途径中经过愈伤组织获得再
生植株的研究并不完善(李耿光等，1983) 不定芽
的分化与细胞分裂素的种类和浓度密切相关。国内
收稿日期：2008—12—19 修回日期：2009—05—02
基盆项目：广东省农业科技攻关项目(2007B020704001)；肇庆学院自然科学基金(0651)[Supported by Agricultural Science and Technology Research
and Development Program of Guangdong Pro~nee(2007B020704001)；the Natural Science Foundation of Zhaoqing University(0651)]
作者简介：陈刚(1974一)．男，安徽宿县人 ，博士，副教授，主要从事植物细胞工程和基因工程研究 ，(E-mail)ehengang@zqu．edu．cn。
408 广 西 植 物 3O卷
外有银星秋海棠、红叶秋海棠 、变色秋海棠和裂叶秋
海棠等组织培养成苗的报道，结果发现，6-BA对丛
生芽的诱导和增殖具有较明显的效果，但 6一BA的
使用浓度和组合激素种类各不相同(李任珠等，
1997；田代科等，2001；唐荣华 等，2004；Espino，
2004；Burritt，2008)。本文 旨在研究不同种类和不
同浓度的激素对其诱导愈伤组织和不定芽分化的影
响，筛选出培养基中激素的最佳浓度，建立紫背天葵
器官发生途径中经过愈伤组织获得再生植株的体系。
1 材料与方法
1．1实验材料
紫背天葵引种于广东省鼎湖山自然保护区，种
植于肇庆学院生物园。
1．2方法
1．2．1愈伤组织诱导 将紫背天葵蒴果消毒后的种
子接种于 MS(Murashige＆ Skoog，1962)培养基 ，
萌发后将紫背天葵 叶片切成小块，接种 于上述培养
基上进行愈伤组织的诱导。愈伤组织的诱导以 MS
培养基为基本培养基，0．5～2．0 mg／L 2，4-D和 1．0
mg／L 6一BA不同浓度组合作梯度比较，同时添加有
机附加物 200 mg／L LH(水解乳蛋 白)，200 mg／L
CH(水解酪蛋 白)和 200 mg／L YE(酵母提取物)，
培养基 pH5．8～6．2，琼脂 0．8％。种子萌发采用光
照培养，愈伤组织诱导采用暗培养。培养条件为：温
度(25±2)℃，光照强度为 40 gmol·m≈·s～，光照
时间为 14 h／d。
1．2．2不定芽的诱导 将诱导形成的愈伤组织接种
于添加不同浓度 6一BA与 NAA组合的培养基，诱导
表 1 不同浓度 2。4-D对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of different concentrations of 2。4一D on callus induction
编号
No．
激素 Hormone(mg／l ) 愈伤组织形成时问
Cali induction
time(d)
接种个数
No．of plant
inoculation
愈伤组织块数
No．of callj
愈伤组织诱导率
Callus induction
rate( )
55．6
81．25
63．89
84．38
69．44
93．75
72．22
96．88
38．89
84．38
不定芽的形成，同时添加有机附加物(同愈伤组织诱
导培养基)，培养基 pH5．8～6．2，琼脂 0．8 光照
培养，条件同种子萌发，30 d后统计不定芽诱导率
和增殖系数。
1．2．3不定根及球茎的诱导 当不定芽长成较健壮
的小苗后，转入生根培养基。比较培养基中离子浓
度和有机附加物的有无对生根的影 响，培养基
pH5．8～6．2，琼脂 0．8 。每种处理接 3O个小苗，
光照培养，条件同种子萌发，14 d后观察有无球茎
的形成，统计生根率和平均根数。
1．2．4炼苗及移栽 根据紫背天葵的生长特性及对
环境条件的要求，以腐殖质土为移栽基质。将生好
根的试管小苗移出培养室，在室外炼苗 3 d，洗净根
系上的培养基，移栽至装好基质的花盆中，在荫蔽度
7O 大棚中培养，3O d后统计成活率。
3 结果与分析
3．1愈伤组织的诱导
3．1．1不同浓度 2，4一D和 6一BA 1．0 mg／L组合对愈
伤组织诱导的影响 紫背天葵叶片外植体接种在表
1所列的各培养基上，均可形成愈伤组织(图版 I：
1)，在接种后 9～12 d开始卷曲膨大，叶片边缘出现
少量淡黄绿色的愈伤组织。2O d后愈伤组织增殖
明显，并表现出不同培养基上愈伤组织诱导率差异
较大，最大差异达到 57．99 。在添加 2，4一D的培
养基 C1、C3、C5、C7和 C9上，外植体愈伤组织诱导
率随着 2，4一D的浓度增加逐渐增加，最高达到
72．22 ，在 C9上愈伤组织诱导率明显下降，较 C7
的愈伤组织诱导率低 33．33 9／6。在 2，4一D和 6一BA
u 0 心 玷
O O O O O
O O O O O
5 5 ； O 0 O O ∞ c=∞ ∞
O L 2
￡；∞ 凹 ∞
3期 陈刚等：鼎湖山紫背天葵组织培养及植株再生 409
组合的培养基 C1、C3、C5、C7和 C9上 ，也表现出愈
伤组织诱导率随着 2，4一D的浓度增加逐渐增加的趋
势，但在 CIO上愈伤组织诱导率略有下降。添加
1．0 mg／L 6-BA能明显提高愈伤组织的诱导率，平
均提高愈伤组织诱 导率达 28．12 ，最大 提高幅度
达到 57．99 。以上结果表明：1．00 mg／L 2，4-D和
1．0 mg／L 6一BA对紫背天葵愈伤组织的诱导效果最
好，对愈伤组织的生长有促进作用。
3．2不同浓度 6-BA与 NAA组合对愈伤组织诱导不
定芽的影响
愈伤组织接种于不定芽诱导培养基上，7 d左
右愈伤组织表面开始产生绿色 突起 。接种 12 d后
诱导形成不定芽(图版 I：2)，30 d后统计不定芽的
诱导情况(表 2)。结果证明：在 NAA浓度相同的条
件下，愈伤组织诱导不定芽的时间随着 6-BA浓度的
升高而缩短，如 S1、s4和 S6比较，2 mg／L 6-BA比
0．5 mg／L 6-BA诱导不定芽时间缩短 3 d。但是，随
着 6-BA浓度的升高 ，不定芽的诱导率和增殖倍数也
逐渐升高，同时诱导效果也更好(图版I：3)，当 6一BA
为2．0 mg／L时趋势平缓。在 6-BA浓度相同的条件
下，愈伤组织诱导不定芽的时间随着 NAA浓度的升
高而延长，不定芽的诱导率及增殖倍数也随着降低。
即紫背天葵愈伤组织的不定芽诱导率与6-BA浓度成
正相关 ，而 NAA则抑制不定芽的发生。
图J扳I 1．紫背天葵愈伤组织；2．愈伤组织分化⋯ ：3．丛生芽；4．根的分化；5．紫背天葵球茎；6．开花的 Ⅱ¨生植株。
Plate I 1．c￡lIl of Begonia bri tipula；2．Shoots diferentiation from cali,3．Multiple shoots；
4．Rot differentiation 5．Corm of B．fimbriaipula 6．Flowering of regeneration plantlet．
3．3不定根的诱导
当不定芽长到 2 cm 以上时，转入生根培养基
(表 3)进行壮苗和生根，6 d后就可在不同培养基上
逐渐见到不定根长出，2～3周就可形成根系，且生
长健壮 ，生根率均达到 i00 (图版 I：4)。对 比可
知：在基本培养基强度为 1／2MS上紫背天葵不定芽
长根时间较 MS提前，如 R1比 R3开始长根时间提
前 3 d，R2比R4提前 4 d；R1和 R2、R3和 R4比较
说明，添加有机附加物对平均根长有明显抑制作用。
所得结果显示对于不定根的诱导，各因素的最佳组
合为：1／2MS+糖 3 +琼脂 0．7 ，生根最早，最
快，而且经观察，在这种培养基 中新长的球茎红褐
色，叶片正面鲜绿，叶背紫红色(图版 I：5)。
3．4植株移栽
当紫背天葵的幼根在生根培养基 R1上长到 1
～ 3 cm时，去掉玻璃瓶的封 口膜，在室内炼苗 2 d
后 ，取出组培苗用 自来水洗净根部黏附的琼脂 ，移栽
到腐殖土中，盖塑料薄膜保湿 3～5 d，保持湿度 8O％
--90}／6，温度 25℃左右，植株成活率达9O 以上。目
前首批移栽的紫背天葵已开花结实(图版I：6)。
4 讨论
秋海棠类植物组织培养常选用叶片或叶柄为外
41O 广 西 植 物 30卷
表 2 6-BA与 NAA组合对不定芽诱导的影响
Table 2 Effect of different combinations of 6-BA
and NAA on differentiation of adventiti0us buds
激素(mg／l )
编号 Hormone
No ·-—。·--------··--·-·--——
6一BA NAA
1．65
0．89
0．78
3．01
2．23
1．86
3．13
2．86
2．1l
表 3 MS的强度和有机附加物对生根的影响
Table 3 Effect of MS strength and organic
substances on rooting
MS培养基
编号 强度
N0． MS
strength
R1 1／2：MS 无
R2 1／2MS 有
R3 MS 无
R4 MS 有
6 有 100
8 无 loo
9 无 100
12 有 100
5．239
1．156
1．81O
1．222
植体 ，如以球根秋海棠 (Begonia×tuberhybrida)的
叶片为外植体进行离体繁殖(Peck& Cumming，
1984)；也有以叶柄为外植体对红叶秋海棠(Begonia
×erythrophylla)进 行 不 定 芽 的诱 导 (David，
2008)，甚至有以叶片和叶柄为外植体对 4种秋海棠
科植物进行组织培养(Espino等，2004)。本研究
中，紫背天葵叶片接种后 10 d左右外植体开始卷曲
膨大，4周后部分外植体边缘出现少量淡黄绿色的
愈伤组织，并不断增殖。这 一结果 与李任 珠等
(1997)对银星秋海棠的研究结果相似。在紫背天葵
愈伤组织诱导中，当单独使用 2，4-D时，其浓度为
0．50 mg／L即能较好地诱导出愈伤组织，2，4一D
1．00 mg／L时愈伤组织诱导率最高，浓度达 2．OO
mg／L时诱导率降低。此时，愈伤组织质地较为稀
疏，叶片外植体颜色偏黄，生长较慢，说明高浓度的
2，4一D抑制愈伤组织的诱导。相似的研究结果还有
裂叶秋海棠，若单独使用 2，4一D，当其浓度为 0．5
mg／L即能较好的诱导出愈伤组织，当浓度达 2．0
mg／L时诱导率最高。本研究还表明 1．0 mg／L 6一
BA对紫背天葵愈伤组织的诱导率有明显的提高，
并能促进愈伤组织生长 。如 2，4-D 2．0 mg／L时，愈
伤组织诱导率仅有 38．89 ，当2，4-D 2．0 mg／L和
6一BA 1．0 mg／L组合 时 ，愈伤 组织诱 导率提 高到
45．49 。最 佳组 合 为 2，4一D 1．0 mg／L和 6一BA
1．0 mg／L，愈伤组织诱导率高达 96 ；同时诱导出
的愈伤组织性质均一、生长旺盛、叶脉及叶片边缘具
有大量致密的瘤状突起。经比较确定 C8培养基
(MS+2，4一D 1．00 mg／L+6-BA 1．0 mg／L+LH
200 mg／L+CH 200 mg／L+YE 200~g／L)为愈伤
组织诱导的最佳培养基。这一结果与唐荣华等
(2004)对裂叶秋海棠的研究结果基本一致。
本研究发现，在 6一BA和 NAA组合的不定芽诱
导培养基上，紫背天葵愈伤组织表面可产生多个生
长中心从而长成不定芽。15 d后愈伤组织表面形
成许多半透明的圆形突起，紧接着突起伸长，每个小
突起逐渐成为一个或多个生长中心，随后发育成无
根小苗。其中 6一BA的浓度为 2．0 mg／L时，分化率
降低。这一现象在变色秋海棠不定芽分化时表现更
为明显，使用高浓度 6-BA时，外植体能产生芽原
基，但不能分化出芽，出现分化停滞现象，最后逐渐
发黑趋于死亡(田代科等，2001)。紫背天葵不定芽
诱导随着 NAA浓度的增加，诱导率降低，NAA对
不定芽形成表现出抑制作用。因此，不定芽诱导的
最适培养基为 MS+6一BA 1．0 mg／L+LH 200 rag／
L十CH 200 mg／L+YE 200 mg／L，不定芽诱导率
最高，增殖率较好。这一点与大多数秋海棠科植物
不定芽分化时添加 NAA或 lAA有促进作用的结
果相反。
不定根形成受到植物生长物质和培养基中离子
浓度的共同影响(王瑛华等，2007)，大多材料在 l／
2MS或者低离子强度的条件下进行生根实验。紫
背天葵不定芽在 4种生根培养基上均可 i00％诱导
不定根形成，但 1／2MS长根 时间最早 ，根 的平均个
数最多，并且有球茎形成，更易储藏和运输，更有利
于移栽成活。
参考文献 ：
赵秀贞．1998．青草药彩色图谱[M]．厦门：福建科学技术出版
社 ：65O一65l
中国科学院中国植物志编辑委员会．1999．中国植物志(第 52
卷第 1分册)[M]．北京：科学出版社：190—192
Burritt DJ．2008．Eficient cryopreservation of adventitious shoots
of Begonia×erythroph ／a using eneapsulatiordehydration re。
quires pretreatment with both ABA and pmlineD]．Plant Cell
(下转第 421页 Continue on page 421)
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3期 毛艳萍等：矮晚柚的组织培养与快速繁殖 42l
导，感谢邹利娟、余阿梅、曾艳、杨敬天在研究过程中
给予的帮助 ，同时还要 感谢重庆江津果树研 究所对
本研究的大力支持。
参考文献 ：
王玉英，高新一．2006．植物组织培养技术手册[M]_北京：金盾
出版社 ：49—5O，82—83
谭文澄，戴策刚．1991．观赏植物组织培 养[M]．北京 ：北 京林
业出版社 ：124—125
Bach A． 1 988． Efect of AC on in vitro propagation of Iris×
Houandica[J]．Bul Poilsh Acad Sci Biol Sci，36(46)：107
DongGF(董 高 峰)，Huang T(黄 涛)，Li GG(李 耿 光)，et a1．
2001．Studies on the tissue culture of different explants in vitro
and plant regeneration from Citrus grandis cv．Shatian Yu(沙田
柚不同外植体离体培养与植株再生的研究)[J]．J Wuhan But
Rear武汉植物学研究)，19(5)：44O一444
Han ML(韩美 丽)，Lu RS(陆 荣生 )，Du XL(杜 晓莉)．2004．
Studies on factors affecting shoots regeneration from epicotyls of
Citrusgrandis cv．Shatian-Yu(沙 田柚上胚 轴离体培养影 响因
素研究)[J]．SoutM1)est China J Agric Sci(西南农业学报)，17
(5)：639—641
Lj GP(李国平)，Huang QC(黄群策)，Qin GY(秦广庸)．2005．
In vitro culture of Hedyotis diffusa leaves and establishment of
regeneration system(白花蛇舌草 叶片离体培养及试管无性 系
的建立)[J]．Guihaia(广西植物)，25(5)：455-458
u Q(李群)，Liu GY(刘光勇)，Wang L(王丽)．2004．Effect of
hormone on plantlet regeneration and studies of rot regeneration
culture of Eustoma sp．(激素对洋桔梗植株再生的影响及生根
培养的研究)[J]．Guihaia(广西植物)，24(1)：4O一42
Li SX(李盛先)．1998．Say god fruit golden grapefruit(金秋佳果
话柚子)[J]．Zh iang Fore(浙江林业)，5：20
Liang QH(粱倩华)，wang RX(王任翔)，Chen TT(陈腾土)，et a1．
1994．Tissue culture of Citrus grandis(砧板柚的组织培养)[J]．
Plant P^ iol G， 7 un(植物生理学通讯)，30(3)：204—206
LinXH(林小桦)，He H(贺红)。wu LR(吴立蓉 )，et a1．2007．
In vitro culture of diferent explants from pogostemon cablin(广
藿香不同外植体离体培养的研究)[J]．Guihaia(广西植物)，
27(4)：658——661
Wang RX(王任翔 )，Liang QH(粱倩华 )，Chen 1vr(陈腾 土)，et
a1．1996．Tissue culture of Citrus grandis(酸柚的组织培养)
[J]．Chin Bull Bot(植物学通报)，13(增刊)：7o～71
Xia ST(夏石头)，Xiao LT(萧浪 涛)．2003．Regulation of polar
transport of auxin and its mechanism(生长素极性运输 的调控
及其机制)[J]．Plant Physiol C~mmun(植物生理学通讯)，39
(3)：255—261
Xu XF(徐晓 峰)。Huang XL(黄学林 )．2002．Establishment of
broccoli plant regeneration system with orthogonal design(应用
正交设计建立青花菜植株的再生体系)EJ]．Guihaia(广西植
物)，22(6)：513—516
Zou JM(gl金美)，YujF(余金富)，Ye GL(叶国利)，et a1．2006．
Studies on the technique of tissue culture in vitro and rapid prop—
agation of Citru5 grandis cv．Wendan and Citrus grandis ev．
Miyou(文旦柚 和下河蜜 柚组织培养 快速无性 繁殖)[J]．J
angzhou Teach CoU：NatSci Edi(漳州师 范学院学报 ·自
然科学版)，2：74—77
(上接第 410页 Continue from page 410)
1issOrgan Cult，95：209—215
Chen G(陈刚)，Chen XW(陈雄伟 )，Wang YH(王瑛华)．2008．
In vitro rapid propagation in Begonia mbristipula Hance[J]．
J modern Agric Tech(现代农业科技 )，36(24)：23—24
Espino FJ，Linacero R，Rueda J，eta1．2004．Shot regeneration in
four Begonia genotypes[J]．Biol Plant，48：101—104
Li GG(李耿光)，Zhan LY(张兰英)，Zhu BQ(朱宝卿)，el a1．1983．
Calus induction and organ diferentiation in the tisue culture of
Begonia fimbristipula Hance(紫背天葵的愈伤组织诱导和器官
分化)[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，25(3)：238-244
Li RZ(李 任珠 )，Lu HQ(卢 海 强)，Xing ZS(邢 增 盛)，1997．
Study on the tissue culture of Begonia argenteo-guttata(银星秋
海棠组织培养的研究)[J]．J Hainan Univ：Nat Sci Edi(海南
大学学报 ·自然科学版)，15(4)：331—336
Murashige T，Skoog 1 962．A revised medium for rapid growth
and bioassays with tobacco tissue cultures[J]．Physiol Plant，15
(3)：473—497
Peck DE，Cumming BG．1 984．In vitro·propagation of Begonia×
tuberhybrida from leaf sections[J]．Hort Sci，19：395-397
Tang RH(唐荣华)，Li YF(李云飞)，Wang L(王丽)．2004．The
rapid propagation in vitro of Begonia 西 “ (裂叶秋海棠的
离体快速繁殖)[J]．J Sichuan Univ：NatSci Edi(四川大学学
报 ·自然科学版)，41(3)：637-640
Tian DK(田代科)，Guan KY(管开云)，Guo RX(郭瑞贤)，et a1．
2001．Propagation and cultivation of Begonia versicolor(变色秋
海棠的繁殖栽培)[J]．Guihaia(广西植物)，21(4)：375—380
Wang YH(F：瑛华)，Chen G(陈刚)，Chen XW(陈雄伟)．2007．Es—
tablishment of a high frequency eficient regeneration system from
leaf in Torenia fournieri Linden(蓝猪耳叶片高频率再生体系的
建立)[J]．J Zhaoqing Univ(肇庆学院学报)，28(2)：58—61
Zhang LY(张兰英)，Li GG(李耿光)，Guo YJ(郭俊彦)．1988．
Study on the somatic embryogenesis from leaf of Begonia fim—
bristipula in vitro(紫背天葵叶片培养体细胞胚状体发生的研
究)[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，30(2)：134—139