全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 19(3)：246—25O 999年 8月
文章编号：1000—3 142(1999)03-0246—05
影响木薯次生胚状体发生及植株再生因素的研究
李洪清，粱承邺v黄毓文，郭俊彦
_ _ — ～
— — —
_ — — 一
f中国科学院韭南植物研究所，广东广州 610650)
摘 要 研究了在外植侔的不同发育阶段中，碳源以及不同的生长激素配 比对木薯次生胚状侔诱导
及植株再生的影响。结果表明：以固体成熟培养基上生长 15 d的胚状体子叶为外植 侔，戊生胚状
侔的产量最高，达 29．3个成熟胚状体／1个外植体．在次生胚状体的诱导阶段，以麦芽精(40
g／L)代替蔗糖作碳操，能 同时提高次生胚状体的产量 (32．5个胚次侔／1个外植体 )及植株再生
频率 (74．3％)．2，4—D 与 PP拼 (0．1 mg／L)配合能提高植株再生频率到 77．6％．2，4一D 与 BAP
【2mg／L)或激动索 (2．0mg／L)配合则大大降低了胚状侔诱导及植株再生频率。
关蛙词：木薯：次生胚状体发生：植株再生
中圈分类号： · 文献标 5争j 。；I-
Factors influencing the development of secondery
embryoids and plant regeneration on Cassava
(Manihot esculenta Crantz)
L1 Hong—qing，LIANG Cheng-ye，HUANG Yu—wen，GUO Jun—yan
(South Chana imnnne ofBotany Academia Sinica Guangzhou 510650 China)
Abstract： During the diferent growth stages of Cassava explants
，
the efects of carbon sources and
growth regutators with diferent concentrations and combinations on the development of secondary
embryoids and plant regeneration were investigated with an approach based on the cyc Lic
embryogenesis liquid culture system．The highest embryoid production i． ^．29．3 maturation
embryoids per exptant，was obtained from initiat embryoids being maturated on the so Lid med ium
(MSmedium supplementedwith 0．1mg／LBA P)for15 d as explants．Whenmaltose(40 g／L)was
substitutedfor SUCrOSe．as carbon SOUlX~einthe culturemedium,therewas anincreasing pomntiatbo th
inthe eficiencyofembryoid development(32．5mature embryoids per expLant)aswel asthefrequen-
cy of plant regeneration(7 3％l An increase of 38．5％ to 77．6％ regeneration frequency was demon-
stratedwhen 2,4一D andPP333(O．1mg／L)werecontained inthe cultureinthe culturemedium．How-
ever,with a combination of2,4一D and either BAP(2 mg／L】or kinetin(2．0 mg／L)，a considerable
reduction both in embryoid induction and frequency ofpLant regeneration was observed．
收稿 日期 19~8--06-08
怍者 介：李洪清 (1966-)，男，博士，助理研究员，从事植物遗传转化研究．
基 I顼且．中国科学皖掸优留学基金受中国科学院“九五 育种瓷助项 ~(KZ95IAIIOl一儿4)
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3期 李洪清等： 影响木薯次生胚状体发生及植株再生因素的研究 247
Key words： CaSSava；secondary embryogenesis；plant regeneration
组织培养及再生系统是基因转化的基础之一，就木薯而言，其胚状体诱导的频率及植株再生频
率，是能否获得转化株的关键。从 1982年木薯的胚状体诱导成功以来 ” ，木薯的胚状体发生及植株再
生系统已成功地应用于多个品种 ‘ 。但由于木薯胚状体诱导及发育是一个连续的过程，胚状体一经
诱导就不可逆地向前发育，进入成熟阶段 而不能象其它植物一样通过愈伤组织继代培养而在前胚状体
及球形胚状体阶段进行扩增 ，因而很难适应转化的要求。因此，近年来的一些工作主要研究如何从
初生胚状体诱导次生胚状体，经过多次的连续胚状体诱导来快速扩增材料，同时也方便转化体盹筛选
( ]。在模式品种 M Col22上的研究结果表明，次生胚状体可以由初生胚状体诱导并连续继代，作为外
植体的胚状体的发育程度会影响着次生胚状体的产量，采用成熟的胚状体 (即带绿色子叶)作外植体较
采用非成熟胚状体作外植体效果更好，因此，Raemakers等 0 提出在两次胚状体诱导之间，增加一个
胚状体成熟阶段，即所谓循环胚状涔的诱导。采用该方法大大地有利于胚状体的扩增，也给转化带来了
极大的方便。其它品种如 M Col1505，TMS604444等也有不经成熟阶段而直接转入诱导培养基进行继代
的。另外还有一种所谓 胚性愈伤组织培养 ，Taylor等 发现某些品种如MCol1505、TMs604444在
诱导培养基上能形成一种胚性愈伤组织，经改变基本培养基， GD代替 MS、picloram代替 2_4—D
后，胚性愈伤组织的产量增加，转入 SH基本培养基可进行悬浮培养从而大量扩增。从上面研究看。胚
状体诱导效率已太大提高，但无论是循环胚状体发生及脆性胚性窟伤组织发生，所用的品种均有一定的
局限性，如何将这些方法应用于更多的品种，有待进一步的研究。
在植株再生的研究上，Raemakers等 。 发现较高浓度的 BAP(o．4 mg／L)比较适台胚状体再
生·Szabados等 认为在再生培养基中加入 G 能提高植株再生频率，但频率均较低。至今在木
薯再生上作用明显的处理是将胚状体首先在含活性炭的培养基上成熟培养，然后进行脱水处理 ’，
该方法将初生胚状体的再生频率提高到 85、4％，次生胚状体也得到一定程度的提高 但其高频率是
数量极少的、生理状态台适的成熟胚状体为基础的，而大多数不同发育阶段的胚状体仍不能再生植
株，因此要想进一步提高木薯胚状涔发生及植株再生效率，还必须从胚状体的诱导，即改善胚状体的
状态方面进 行研 究
鉴于 上原因，本文 模式品种 M Col 22为材料，在液体培养的基础上，研究通过采用不同发育阶段
的胚状体1在胚状体诱导阶段采用不同碳源、不同激索配比来提高次生胚状体诱导及植株再生频率。
1 材料与方法
1·1供试材料
4个木薯(Manihot escule~la Crantz)品种，其中 M Col 22和南植 培8来 自CIAT,Colombia(哥伦
比亚热带作物研究中心)，华南 205和红尾为中国品种。各品种的无菌苗培养保存在基本培养基上
(BM)，基本培养基的组成为 MS培养基的大量元素、微量元素和维生素，跗加 20 g／L蔗糖，0。6％
琼脂糖，pH5．8，高温高压灭菌 (121℃，20rain) 材料 的培养温度为 28±2℃，光照强度为 1 600
lx， 照光 16 h／d。1个月继代一次，中国品种红尾的幼叶直接取材于温室，其生长条件为：温度 21
～ 28℃ ，光照 12 h
1。2初生胚状体的诱导
参照 Stamp和 Henshaw ¨。取试管苗靠 近顶端分生组织的幼 叶 (其 中红尾的幼叶取 自温室
，
经s％ 的次氯酸钠消毒 5 rain，洗净)，长约3～6 mm 的外植体被切成 3～4片，培养在直径 lO cm 的
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培养皿里。胚状体诱导培养基为 BM 附加不同浓度的2,4．D，黑暗下培养，温度为 28=2℃。诱导培
养 20 d后，统计胚状体诱导频率
1，3胚状体的成熟
所谓胚状体的成熟是指由球形胚或鱼雷胚发育到子叶胚，成熟胚状体具有明显根、茅二级结构及
伸展的绿色子叶。将诱导 20 d左右的胚状体连同愈伤组织一起转人成熟培养基培养，15 d后统计成
熟胚状体的数量．胚状体成熟培养基为 MS附加 0，1mg／LBAP，培养温度为 28±2℃，光照强度
为 1 200Ix，照光 16 h／d。
1．4循环胚状体诱导及植株再生
木薯的初生胚状体转人成熟培养基 (BM 附加 0．1 mg／L BAP)，光照强度及照光时问同上，培
养 15 d后 ， 取子 叶切碎 进 行次生 胚状 体 的诱 导。
于 5个成熟胚状体的子叶切碎，放人 100 m1
的三角瓶中，加人 20而1培养液 (液体 BM
附加 6 mg／L 2，4-D)。黑暗下培养，摇床转
速为 120 rpm，后面的循环均采用与前面相同
的过程，即胚状体诱导——胚状体成熟—— 胚
状体诱导．同时，成熟的胚状体也可转入再生
培养基，分别长苗及长根．具体过程如示：
1．5 胚状体阶段对次生旺状体诱导的影响
将液体悬浮培养诱导出的胚状饿 分别转
人 固体 及液体成熟培养基，光照培养下 5、
10、 15、20 d后取 出，进行次生胚状体的诱
导 ．
次生胚状体 的诱导在液体培养基 中进行，将来源
循环胚状俺发生(液体培养)
以成熟胚状体为外植体，以 20，40 g／L的蔗
糖、葡萄糖及乳糖分别作为旺状体诱导阶段的碳源，
在悬浮培养下进行次生胚状体的诱导．20 d后，将
诱导的肛状体 团转人含 20 g／L蔗糖的胚状体成熟、
萌发培养基上进行植株再生 激素配比的处理只在肛
状体阶段进行。
2 结 果
2．1培养基类型及胚状
导的曩耋响
以初生胚状体为外植体，经诱导产生次生胚状体
(循环 1次，cycle I)．本实验以次生胚状体 (循环
(次生件细胞旺壮件的诱导)
渣件 BM 附加 6mg／L的 2,4D．黑暗
28± 2℃．培 养 20 d(Io d更新培 养液)
(悻细胞旺状悻的成熟)
固体或}瞳体 BM 附加 0．Img／L BAP
暇光 16 h 培 养时 间约 15～20d
(茎轴的伸长)
rIM 附加 D．4mg／LBA 光 16’h．时
间 约 30-40d
步骤 4 (长幄]
『 ： 薯 “ 1 黼 蚴
d啦 株 (准备移植到温室)
次生胚状俺发生的影响
Table】 Influenceofmaturat10ntimeand
medium type on secondary embryogenesis
~ [ions,
2次，cycleⅡ )为外植体，分别转人固体及液体的成熟培养基。研究固体培养、液体培养及不同肛
状体成熟时间对次生胚状体即对 cyclelII胚状体的产量的影响．结果表明 (表 1)：固体培养基上胚状
体生长较液体 中的快，而且次生胚状体发生频率随成熟培养时间的延长而提高，在 15 d左右达到最
大值，而在液体培养基上达到最大值的时间稍迟，且在相同的胚状体成熟时间内救生胚状体发生频率
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3期 李洪清等： 影响术薯次生胚状体发生及植株再生因素的研究 249
较固体培养的要低
2．2不同
的影响
植株再生
分别以 20~40 mg／L的麦芽糖、葡萄
糖、乳糖及蔗糖为碳源，加入胚状体诱导培
养基，研究它们对次生胚状体发生及植株再
生的影响。 四种碳源中以麦芽糖的效果最
好，当麦芽糖浓度为 40 g／L时，胚状体诱
导效率较蔗糖 20 g／L时稍高，而植株再生
的频率则 由蔗糖的 38．5％提高到 74_3％，成
熟胚状体的再生植株数由蔗糖的 1 1,6增加到
24’1，分别为蔗糖对照的 2倍。葡萄糖及乳糖
对胚状体的诱导效果均较蔗糖的差 (表 2)。
2．3不同激素配比对木薯扶生胚~kCt~t_Ck及植
株再生的影响
为了研究不同的激索配比对次生胚状体
诱 导 及 植 株 再 生 的 影 响 ， 采 用 2,4．D 6
mg／L分别 与其它 的激 素，BAP．KT，
GA]及 PP 配台进行 了次生旺状体的诱
导 结果表明 (表 3)，虽然 2,4．D 在诱导
培养基中占主导地位，但加人其它墩素对胚
状体的诱 导频率及植株再生产生很大的影
响。2,4一D 与 BAP及 KT配合，外植体上愈
伤组织生长旺盛．胚状体产生数量极少，
胚状体 表面 出现一层 海绵状愈伤组 织。
2．4-D 与 GA3及 PPm 配合对胚状体的诱导
较单独用 2， D 时稍差，但对植株再生有显
著的促进作用。2,4一D 与 P (0A mg／L)
配合使用时，植株再生频率由对照的38．5％
提高到 77。6％，提高 1倍，植株再生数量接近
对照fl匀2倍。进一 步的实验采用 2,4．D 6
mg／L与不同浓度的 PP] 配比的结果表
明：随着 PP3浓度由低到高时，次生胚状
体的诱导频率及植株再生频率均下降(表 41
表 2 不同碳潭对木薯姓 I匠状体发生爰植椿再生的影响
TabM 2 Influence ofcarbon sources On cassava secondary
emlo~ogenesis and plant regeneration
2O 啪 don re1 dal ex#amsfor chIr
表 3
Table3Infloenceofofdiferent combinations ofgrowth regulators
0n socondazy embryogenesis andplant regenerationm C．-q5S~．eft
t 罂 ， - ant regcneratlon No．fplant
∞ mam~tkm口nh) ∽ l p bbreacht／ea~ nL
D∞r唰 mt n6mg／L
表4 不同浓度的PP|n与 互4_D结合对末暮敬生I匠妆体
发生及植株再生的影响
Table4Influe／lce of2,4-D anddiferent conoentrations ofP 3
onsecondaryembryogenesis and plant regeneration in cassava
Treatmlm 罂If／Jbt~， [ ant regnesation 尹
3 讨 论 ：： ⋯ ～
在次生胚状体的诱导中，作为外植体的胚状体，其发育的程度对次生胚状体的诱导频率的影响很
大，Raemakers等 研究表明成熟胚状体较其前期的胚状体作为外植体形成的次生胚状体的数量多
本实验结果表明，固体成熟培养较液体成熟培养，其胚状体生长快，在较短时间内能达到成熟，而液
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体培养则相对较差。其原因可能是固体培养中极性固定，透气及光照好，使得胚状体生长较快。
虢源在植物组织培养中起着非常重要的作用，它们既可提供植物细胞生长的能量，叉可作为渗透
调节剂。不同的糖类由于其特性而影响组培的效果。木薯的组培中主要是以蔗糖作为碳源。事实上t
其它的碳源如麦芽糖、葡萄糖、乳糖等在一些植物的组培上效果也很好 ”。本实验结果也表明麦
芽糖比蔗糖在木薯体细胞胚状体诱导及植株再生中更有效。
不同激素配台使用是常用的改善组培系统的方法之一。在术薯的胚状体诱导中常用的是 2,4-D或
picloram，用 NAA诱导次生胚状体。然而在许多其它植物的组培过程中发现，生长素与细胞分裂索及
其它激素一起使用能起到较好的效果。本实验采用 2，4-D配合 P ”使得植株再生频率及数量都得到显
著的提高，由单独用 2,4-D 时的38。5％和 I1。5％增加到 77。 和 21。4％。P 是一种植物生长的阻滞
剂，生产上常用于使植物生长呈矮壮形。我们以2,4-D和 P 配台在胚状体的诱导上作用不大，却显
著提高了植株再生数量。鉴于 目前使用 PP3 提高植株再生的研究较少，对其机理需进一步研究。
在双子叶植物中，由胚状体的诱导到植株再生需经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚、胚状体
的成熟及萌发各阶段 由于体细胞胚在早期发育过程中表现出形态的可塑性及多样性 ¨ ，即使非正
常胚状体也不会妨碍其后续发育 ”¨，以至许多研究都侧重于如何增加成熟胚状体的产量，促进胚状
体的萌发，而没有充分注意刘胚状体早期发育对最终植株再生的影响。在术薯的组培中也是如此。本
文的结果表明在木薯的组培中改善早期胚状体诱导有助于植株再生。
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