全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(6)：823— 826 2008年 11月
华南忍冬组织培养的无菌体系建立
李 翔1，2，杨美纯 ，全 泉 ，吴庆华0
(1．广西大学 农学院，南宁 530005；2．广西甘蔗研究所 ，南宁 530007；3．广西药用植物园，南宁 530023)
摘 要：以广西山银花的种植品种华南忍冬带腋芽茎段为外植体建立无菌体系。结果表明，较适宜的灭菌处理
为外植体用 75％酒精处理25 S，再用0．1％升汞溶液(加吐温 80)处理9 min，污染率最低为 6．7％；初代培养腋芽
萌发较适宜的培养基为 MS+6一BA2．0 mg／L，萌发率 63．3 ，比CK组的高33．3 ；继代周期为 3O d，继代增殖
较适宜培养基为MS+6一BA1．7 mg／L，芽比较粗壮，平均每丛丛芽增加芽数为 1O．7个，比CK组高 9．5个。
关键词：华南忍冬；组织培养；快速繁殖；愈伤组织
中图分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-3142(2008)06-0823-04
Tissue culture and rapid propagation
of Lonicera confusa
LI Xiang 2，YANG Mei—ChunI，QUAN Quan ，WU Qing-Hua3
(1_Colege of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530005，China；2．Guangxi Sugarcance Institute，Nanning
530007，China；3．Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant，Nanning 530023，China)
Abstract：The sterns with axilary buds of Guangxi Lonicera confusa were taken as explants tO build aseptic system．The
results showed that the suitable disposal of sterilization was using 75 alcohol to dispose for 25 S firstly，and then using
0．1 HgCI2(with Polysor6-BAte 8o)to dispose for 9min，the minimum rate of polution was 6．7 ；the suitable intial medi—
um to germinate amdliary buds was MS supplemented with 6-BA1．7 rng／L，germinative rate was 63．3 which was higher
than CK 33．3 ；the period of subculture was 3O d，the suitable subculture proliferous medium was MS supplemented with 6-
BA1．7 mg／L，the buds were strong，and the average of the proliferous buds were 10．7 which was more than CK 9．5．
Key words：Lonicera C012fusa；tissue culture；rapid propagation；callus
华南忍冬(Lonicera confusa)，忍冬科多年生半常
绿木质藤本植物(中国植物志编委会，1988；江苏新医
学院，1997)，是广西山银花中药材的主要品种。《中
国药典》把山银花来源规定为忍冬科植物灰毡毛忍冬
(L．macranthoides)、红腺忍冬(L．hypoglauca)、华南
忍冬(国家药典委员会，2005)。山银花叶、藤、花蕾均
可入药，尤以花蕾最佳，具清热、解毒、抗菌等功效，是
传统的名贵中药材。山银花的有效成分绿原酸(chlo—
rogenic acid)、异绿原酸 (iso-chlorogenic acid)具有抗
病毒的特殊疗效。据广西中医学院王柳萍(2005)测
定，广西山银花干燥花中绿原酸的含量为 4．72 ，
高于《中国药典}2005年版一部所规定的绿原酸含
量不少于 1．5 的标准。
由于多年的开垦荒山导致我区山银花野生资源
日益减少 ，很多地方的山银花 已濒临灭绝 ，目前山银
花药材的供需缺口很大，仅靠野生资源已难以满足
市场需求，必须快速发展人工种植(袁航远，2005)。
山银花喜湿、耐寒、耐旱、耐涝，适宜在山区丘陵地带
栽培，这几年我区山银花种植面积逐渐扩大，2006
年忻城县种植面积 0．47万公顷，计划 3年内扩大到
1．33万公顷，至少需要 400万株种苗。山银花种子
萌发率不高，实生苗种植 3年以上才开花(农训学，
2005)；枝条扦插成活率也较低，扦插苗种植第二年
有少量植株开花，到第 4年盛花期后植株容易出现
收稿 日期：2007—07—13 修 回日期：2008-01-17
基金项目：广西创新能力建设项目(桂科能0443001—16)[Supported by the Foundation of Innovative Ability Construction of Guang)d(o4430O1—16)]
作者简介：李翔(1981一)，男，广西梧州人 ，硕士研究生 ，主要从事药用植物的有关研究。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E—mail：meichunyang @163．com)
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早衰(柏雪云等，2004)。因此必须寻求更好的山银
花种苗繁殖途径。植物组织培养是植物种苗快速繁
殖的有效手段，本试验研究华南忍冬的组织培养快
繁技术，可以解决山银花规模化种植的种苗短缺问
题，为山银花的良种繁育及推广提供技术支持。
山银花中只有灰毡毛忍冬品种的组织培养已获
得成功(王晓明等，2005)，华南忍冬是广西山银花的
一 个种植品种。目前尚未见关于该品种的组织培养
研究报道。
1 材料和方法
1．1材料
广西药用植物园当年生华南忍冬枝条。
1．2试验方法
(1)外植体灭菌：将华南忍冬嫩枝去除叶片后剪
成 1．O～1．5 cm长带一对腋芽的茎段，用洗衣粉溶
液和高锰酸钾溶液分别浸泡 15 rain，自来水漂洗 l
h，在超净工作台上分别用 3％次氯酸钠溶液灭菌 7
～ 11 rain；75％酒精浸泡 15～35 S；0．1 升汞溶液
(加吐温一80)灭菌7～10 rain；先用 75 酒精浸泡再
用0．1 升汞溶液(加吐温-8O)处理。无菌水冲洗 5
～ 6次。(2)培养基：培养基中均加入白糖 3O ，琼
脂 4．5 g／L，pH6～7。(3)接种方法：将华南忍冬
1．O～1_5 cm长带一对腋芽的茎段接种于诱导培养
基中，诱导腋芽萌发；待腋芽长出2～3节时，转到分
化培养基上诱导丛生芽。(4)培养条件：光照强度
35~46#mol·nr。·S- ，光照时间为 12～14 h／d，温
表 1 酒精与升汞配合使用的灭菌效果
Table 1 Results of sterilization with alcohol and HgCI2
采样时间
Date
灭菌方法 Sterilized method 外植体 污染外植数(段)
75 酒精(s) 0．1 升汞(min)
75％ alcohol 0．1 HgClz
数(段)
No．of
explants
No．ofthe
pollutive
explants
污
ativ
腋
rate ofth e poluti。n g
t m rvb d
2006．05．18
2006．O8．07
2006．09．O6
2006．10．13
2006．11．10
2006．12．22
注：基本培养基为 MS，下同。Note：MS as the basic medium，the same below
度为 26~28℃。
2 结果与分析
2．1灭菌方法的确定
华南忍冬幼嫩枝芽表皮附着疏柔毛和疏腺毛(钱
关泽，1998)，灭菌比较困难，灭菌处理时间短，污染严
重；时间稍长，则对外植体产生毒害导致腋芽萌发困
难。因此本试验用四种灭菌方案对华南忍冬外植体
茎段进行灭菌处理 ，灭菌后的材料接入 MS+6一BA2．
0 mg／L培养基中，每种灭菌方式接 3O瓶，每瓶一个
茎段，20 d后观察。试验结果表明，使用 3 次氯酸
钠溶液进行灭菌处理，外植体污染严重，当灭菌时间
低于9 min时，外植体污染率在 80 以上，当灭菌时
间在9 min或以上时，大部分外植体死亡，腋芽萌发
率为0。单独使用酒精进行灭菌处理，灭菌时间在 15
～ 3O S之间污染率较高，灭菌时间为 30 S或以上时，
虽然污染率降低了，大部分外植体死亡，腋芽萌发率
几乎为0。各种处理中，浸泡时间 25 S的灭菌效果稍
好。单独使用升汞处理，效果好于酒精，但污染率仍
较高。各种处理中，浸泡时间 9 min的灭菌效果稍
好。因此选用 75 酒精 25 S与0．1 升汞溶液(加吐
温 80)9 rmn配合进行灭菌处理，接入 MS+6-BA2．0
mg／L培养基中，20 d后观察(表 1)。由表 1可知，将
外植体先用 75 酒精处理 25s，再用 0．1 升汞溶液
(加吐温80)处理 9 min，污染率最低，为6．7 ；外植
体的萌发率在 60．0 以上。
2．2基本培养基的筛选
将腋芽茎段 接种于 附加 6一BA2．0 mg／L+
NAA0．05 mg／L的 MS、B5两种培养基上，每个处
理接种 30瓶，每瓶一个茎段。试验结果表明 MS为
较好的基本培养基(表 2)。
2．3 6-BA对腋芽诱导的影响
将带腋芽茎段接种于附加不同浓度 6一BA的
MS培养基中，每个处理接种 l5瓶，每瓶接种 2个
茎段，接种后 30 d内记录外植体出芽数总数、萌发
6期 李翔等：华南忍冬组织培养的无菌体系建立 825
表 3 不同浓度的 6-BA对腋芽萌发的影响
Table 3 Effects of 6-BA different concentrations on germination of auxiliary buds
表 4 不同浓度的 6-BA和 NAA配比对腋芽萌发的影响
Table 4 Effects of 6-BA and NAA different concentrations on germination of auxiliary buds
率、出芽所需时间(表 3)。
从表 3可知，在 6一BA 1．0～2．0 mg／L处理的
范围内，芽的诱导率与 6一BA浓度成正相关，较适宜
的6-BA浓度为2．0 mg／L。当 6-BA浓度超过 2．0
mg／L，芽体开始出现扭 曲、叶色变黄。接种 15 d
后，6一BA 2．0～2．5 mg／L处理的幼苗基部逐渐形成
小块白色疏松的愈伤组织，而且愈伤组织块的大小
随着 6一BA浓度的提高而增大。因此，在初代诱导
阶段，6一BA浓度不宜超过 2．0 mg／L。
2．4不同浓度的激素配比对腋芽萌发的影响
将腋芽茎段接种于附加不同植物生长调节剂
(6一BA、NAA)组合的 MS培养基中，每个处理组合
接种 15瓶，每瓶接种 2个茎段，接种后 30 d内记录
出芽外植体数、出芽总数、出芽所需时间、愈伤组织
产生情况(表 4)。
接种 7 d后 ，茎节上 中的腋芽膨大。15 d后除
CK2组外，其余处理组的芽不断伸展，25 d后一般都
能长出对生腋芽。从表 4可以看出，NAA对华南忍
冬腋芽萌发没有作用，在 6-BA浓度相同的情况下，
NAA从0．1 rag／L增加到0．15 mg／L时，腋芽的萌
发率、平均每外植体出芽数都下降，茎段基部产生愈
伤组织增多。愈伤组织的产生明显抑制了丛芽的形
成，导致丛芽产生数量少，芽体不壮。与单独加 6一BA
的CK1处理组相比，腋芽抽出所需时间长，形成的丛
芽数少，所以，华南忍冬茎段培养不需加 NAA。
2．5激素对丛芽增殖的效果
当腋芽产生的丛芽长到 0．5～1 cm高时，将其
切割成带3个芽的小丛芽块，接种于附加不同植物
826 广 西 植 物 28卷
生长调节剂(6一BA、NAA)组合的 MS培养基 中。每
个处理接种 15瓶，每瓶接种 2丛丛芽，接种 30 d后
记录芽增殖总数(表 5)。
表 5 激素对丛芽增殖的效果
Table 5 Effects of various phytohormones
concentrations on proliferous buds
m g／ m g／ ， L LJ L LJ
由表 5可知，6一BA浓度在 0．5～2．0 mg／L时，芽
增殖数与 6-BA的浓度基本成正相关，但当 6-BA浓
度超过2．0 mg／L后，芽数开始减少，芽体出现扭曲，
6一BA2．0 mg／L处理组的芽增殖数最多，但是芽比较
短、细，不利于继代。6-BA1．7 mg／L处理组的平均每
丛丛芽增加芽数与 6-BA2．0 mg／L组的差不多，但芽
稍长，比较粗壮。加入 NAA后 ，6-BA2．0 mg／L组的
平均每丛丛芽增加芽数比 6-BA2．0 mg／L单因子诱
导时少7．2个。说明即使低浓度的NAA的加入也抑
制了丛芽的形成，因此，在丛芽诱导过程中不应加
NAA。接种 7 d后 ，6一BA2．0～2．6 mg／L以及加人
NAA的各组的丛芽基部逐渐形成小块白色疏松的愈
伤组织，而且愈伤组织块的大小随着 6-BA浓度的提
高而增大。因此，在继代增殖阶段 ，6-BA的浓度同样
应该控制在 2．0 mg／L以下 ，以 1．7 mg／L较适宜。
CK处理组的芽数很少 ，芽细长。
3 小结
(1)华南忍冬幼嫩茎部表皮附着疏柔毛和疏腺
毛，灭菌比较困难。本试验摸索出了对华南忍冬茎段
外植体较好的灭菌方法：经过预处理后，先用 75 酒
精浸泡25 S，再用 0．1％升汞溶液(加吐温一80)处理 9
min，污染率可以控制在 25 以下，初代诱导率可保
持在 6O 以上。(2)华南忍冬茎段腋芽在 B5基本培
养基中前期生长较好，但后期生长速度下降，出现较
多的愈伤组织。在MS培养基中，茎段腋芽前期生长
速度较慢，但后期分化的芽数多，小芽长势很好，因
此，确定了MS为初代诱导、丛芽增殖的基本培养基。
(3)试验中发现 ，6一BA浓度在 2．0 mg／L以下时，丛芽
的产生量与 6一BA的浓度基本成正相关，当 6一BA浓
度超过 2．0 mg／L后，分化芽数减少，芽体畸形，所以
认为华南忍冬茎段培养初代诱导的 6-BA浓度以2．0
mg／L为宜，较好 的丛芽增殖 的 6-BA浓度为 1．5～
1I 7 mg／L。本试验结果表明，华南忍冬茎段初代诱导
和丛芽增殖均不应加生长素，否则就会产生较多的愈
伤组织，抑制丛芽的产生，这与前人报道金银花的红
河(李军等，2000)、凤爪(孟庆杰等，2002)等品种及山
银花灰毡毛忍冬品种组织快繁需要 6-BA与 NAA配
合使用的结果有所不同。
参考文献 ：
中国植物志编委会．1988．中国植物志 [M]．北京：科学出版
社 ：238
王光全，孟庆杰．2004．金银花繁育方法与技术[J]．江苏农业
科学，6：117—118
王柳萍．2005．广西山银花绿原酸的含量测定fJ]．中国药理通
讯 ，3(3)：67
农训学．2005．金银花种子繁殖方法[J]．河北农业科技，3：l1
江苏新医学院．1997．中药大词典[M]．上海：上海科学技术出
版社：1 403—1 405
李军，乔元伟．2000．红河金银花的组培快繁技术[J]．山东林
业科技 ，3：41—42
国家药典委员会．2005．中华人民共 和国药典(一部)[M]．北
京 ：化学工业出版社
孟庆杰，王光全．2002．凤爪金银花的组织培养技术[J]．河北
林业科技 ，5：25
柏雪云，王常东，等．2004．金银花的扦插繁殖技术[J]．时珍国
医国药 ，6：27
袁航远．2005．金银花[J]．农业知识 ，8：35
钱关泽．1998．金银 花茎 的比较解剖研究[J]．聊城师 院学报
(自然科学版)，3：65—67
Chai XY(柴兴云)，Li P(李萍)．2004．Studies on chemical constitu—
ents in dried buds of Lonicera COnfluse(山银花化学成分研究)
[J]．China J ChinMaterIVied(中国中药杂志)，9：865-867
Di SL(耿世磊)，Xu HH(徐鸿华)．2004．Distribution of chloro—
genic acid in branch，blade，and flower of Lonicera COH^ Ⅲ(山银
花茎叶花 中绿原酸分布规律研究)[J]．Chin Trad Herb
Drugs(中草药)，3：315—318
Wang XM(王晓明)，Yi AQ(易霭琴)．2005．Germfree tissue cul—
ture system establishment of new varieties in Lonicera rnacran-
thoides(灰毡毛忍冬新品种组织培养的无菌体系建立)I-J-1．
Economic Fore Res(经济林研究)，23(4)：14—16
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