全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(1)：87— 91 2O09年 1月
匙羹藤组织培养条件优化研究
苏 钛1一，黄宁珍 ，付传 明1
(1． 籍 毳广西植物研究所，广西桂林541oo6；2．广西师范大学生命科学学院，广西桂林541o4)
摘 要：以匙羹藤无菌种子苗为外植体，通过预备实验确定基本培养基后 ，采用完全实验和正交设计相结合
的方法，研究植物生长调节剂两因素配合和多因素组合(NAA、TDz、2一ip、IAA、6一BA和 KT)对匙羹藤芽体诱
导及继代培养的影响。结果显示，匙羹藤组织培养最适的基本培养基为 N68；N68+NAA 0．o5 mg／L+2一
ipo．4 mg／L+TDz o．oo1 mg／L利于芽体增殖，可用于继代培养；N68+NAA O．o5 mg／L+TDz o．。O5 mg／L
促进植株长根，可用于生根培养。
关键词 ：匙羹藤；组织培养；完全实验；正交设计
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号 ：1O0O一3142(2O09)O1一。087一O5
Optimizati0n Z Z JP．D culture c0nditi0ns
n 1 T ．
t0r IJ V7 e7 VZ JP．e
SU 1 i 1一，HUANG Nin Zhen ，FU Chuan-Ming
(1．G船 ， s嘶“ 0，B0￡彻)．，G“ A“￡0 伽 “ R Dn彻 ￡ sP A∞ D_厂Sf F fP ，
Gu n 541oo6，China；2．G 。厂Li ＆ 硎肼 ， 口卵彬 聊地 ，Guilin 541。。4，China)
Abstract：The optimum medium f0r tissue culture Of( m 口 Z s r were studied by using germfree tub—
seedling as explants． The effects of p1ant gr0wth regulator(NAA，TDZ，2一ip，IAA，6一BA and KT)on the
seed1ings pro1iferati0n were studied by complete experiment and orth。gona1 design． The results showed that
the optimum basic medium f0r G．s Z es rP was N68；N68+NAA O．O5 mg／L+ 2一ip O．4 mg／L+TDZ O．OOl
mg／L was the best for bud proliferation，and can be used in subculture；N68+NAA O．O5 mg／L+TDZ O．OO5
mg／L prom0ted rooting，can be used as rooting medium．
Key words：( 7 P7 n s Z s￡r ；tissue culture；comp1ete experiment；orthogonal design
匙羹藤(G 7ze “ rP)别名武靴藤、金刚
藤、心服黄，为萝摩科匙羹藤属植物，分布于印度、越
南、印度尼西亚、非洲及我国的广西、云南、广东、海
南、浙江、福建、台湾等地，主要生于山坡林缘或灌木
丛中(中国科学院植物研究所，2O02)。全株入药，其
性平，味苦，具祛风止痛、解毒消肿之功效；主治风湿
关节痛、咽喉肿痛、无名肿毒、毒蛇咬伤等(江苏新医
学院，l977)。近年来研究发现匙羹藤叶具有独特的
降血糖、降血脂、抗龋齿和抑制甜味等作用(韦宝伟
等，l996)。可见，匙羹藤无论是作为药品还是保健
品，均有较好的开发前景。在匙羹藤组培快繁技术
研究中发现，存在继代增殖时落叶、玻璃化以及重复
性差等问题。为此，在确定基本培养基的基础上，通
过完全实验和正交实验设计相结合，对匙羹藤离体
培养体系进行系统研究，以期筛选出合适的继代和
生根的培养基配方。
收稿日期 ：2。O7—03—19 修回日期 ：2。08—06—13
基金项目：广西科技攻关项目(桂科攻 0330。03—1，O424。o8—1H)[suppomd by Key rechno1ogies Research and Deve1opment Pr0gram of Guang)d
(O3300O3—1，04240O8—1 H)]
作者简介：苏钛(1982一)，男，云南大理人，在读硕士，研究方向为植物组织培养和细胞培养研究。
。通汛作者(Author for c0rrespondence，E—mai】：hnzhen68@yahoo．com．cn)
88 广 西 植 物 29卷
1 材料和方法
1．1材料
1．1．1匙羹藤无菌种子苗 选取表面无伤痕、健康、
新鲜、淡黄色的成熟蒴果在流水条件下冲洗 3O min
后，在无菌台上用 7O 的酒精浸泡 0．5～l min，再
用 O．1 的 HgCl2(加 2～3滴吐温一8O作表面活性
剂)消毒灭菌 5 min，然后用灭菌水冲洗 3～5次，取
出种子接种在培养基上，获得无菌种子苗。
1．1．2试剂 植物生长调节剂 NAA(Naphthalene
acetic acid)、2一ip(6一(△一isopeny1amino)purine)、
TDZ(Thidiazuron)、6一BA(6_henzylaminopurine)和
KT(Kinetin)均为分析纯 ，为上海 Sigma公司生产。
1．2方法
1．2．1基本培养基的筛选 将匙羹藤种子苗切成带
芽茎段接种于以MS、N6、B5、white、N68为基本培
养基上，每种处理 1O～15瓶，每瓶接种 4～5个外植
体，在光照36 mo1·nr ·s～、12 h／d、温度 28±3
℃的培养室中培养(以下培养条件相同)，20 d后观
察记录。
1．2．2激素组合对继代增殖和 生根的影响 (1)增
殖培养基的筛选：以 N68为基本培养基，添加 NAA
(O．O5，O．O8，O．1mg／L)和 2一ip(O，0．1，O．4，O．8，1．2
mg／L)，以确定增殖培养中合适的 NAA和 2一ip浓
度及组合。每种处理 1O～15瓶，每瓶接种 4～5个
外植体，置于培养室中培养，30 d后观察记录。(2)
生根培养基的筛选：以 N68为基本培养基，添加
NAA(O．O2～O．1 mg／L)、 I、DZ(O．O01～0．Ol mg／
L)，对匙羹藤进行生根培养，3O d后统计生根率和
生根 系数 。生 根 率 一 生 根 茎 段 数／接 种 茎段 ×
lOO ，生根系数一生根条数／生根茎段数。
1．2．3多种激素组合对继代增殖影响 以N68为基
本培养基，采用正交实验设计分析 NAA(O，0．O2，
O．05，0．1，O．2 mg／L)、TDZ(O，O．OO1，0．OO2，
O．0O5，O．O1 mg／L)、2一ip(O，0．2，0．4，O．8，1．2 mg／
L)、6一BA(O，O．O1，O．O2，0．04，O．O8 mg／L)和 KT
(O，O．1，o．2，O．4，O．8 mg／L)等 5种不同激素 5个
浓度组合对匙羹藤继代增殖的影响。根据5因素 5
水平的正交表L25(56)(奕军，1995)，设计 25种组合
的培养基(表4)，每种组合 1O～15瓶，每瓶接种 4～5
个外植体，4O d后记录芽体增殖及根的生长情况。
2 结果与分析
2．1基本培养基的筛选
比较MS、N6、B5、white、N68等不同培养基中
匙羹藤的生长效果(表 1)，结果表明，在 N6、B5和
white培养基上，大部分材料死亡，少数存活的植株
生长不正常，叶片卷曲或发黄并大量落叶，因此，这
几种培养基不适合作为匙羹藤的基本培养基；在
MS基本培养基上，虽然落叶较少，但植株长势一
般，叶片卷曲，因此，MS也不宜作匙羹藤组培的基
本培养基；而在N68培养基上，材料生长良好，落叶
少，芽较粗壮，植株长势整齐，与其它几种培养基相
比，更适合作为匙羹藤组织培养的基本培养基。
表 l 基本培养基附加 NAA对芽长势的影响
Tab1e 1 Effect of basic culture medium with NAA on buds gr。wing trend
。0N ’
MS
N68
N6
B5
W hit0
5．8 粗壮 ，叶淡绿色且稍有卷曲，落叶 1～2片
7．1 粗壮 ，叶色绿色 ，落叶 1～2片
4．O 芽无生长且大部分死亡 ，叶黄且卷曲，落叶较多>4片
4．5 顶芽向内卷曲，叶黄色 ，落叶多>4片，死亡较多
3．8 芽短，叶淡绿色 ，较小，落叶 1～3片，多数死亡
比较 MS、N6、B5、white、N68各个基本培养基
的无机盐成分，发现几种培养基中NH 浓度相差
较大，从高到低依 次为 MS>N68> N6>B5>
white，其中MS中NH 含量最高，分别为 N68的
2倍、N6的5倍、B5的 17倍；而 white培养基中不
含 NH ；几种培养基中的NH ：NO_『分别为：MS
和N68为 1：2、N6为 1：8、B5为 1：22。材料生
长较好的 MS和 N68培养基 中，均含有较高的
NH 浓度和较高的 NH ：NO_『比。由此推测，
培养基中较高 NH 含量和 NH ：NOl『比值可能
利于匙羹藤组织培养过程中植株的正常生长。
而比较N68和MS培养基上的培养材料，无论
1期 苏钛等：匙羹藤组织培养条件优化研究 89
从生长速度、外形或者落叶情况等方面，前者均优于
后者。比较这两种培养基的其它无机盐成分，结果
显示 ，N68中 Mg、S元素含量是 MS的 3．3倍 、P元
素是 MS的 4倍 ，因此推断，可能较高的 Mg、S和 P
浓度也较利于离体培养中匙羹藤植株的生长。
表 2 NAA和 2一ip对匙羹藤继代培养的影响
Tab1e 2 Effect of NAA and 2一ip on Seedlings of
G 7 P7 d s Z s￡r in subculture(n= 5*)
激素浓度 芽体增
Hormone 殖倍数 株高
c0ncentrati0n Rati0 of Height
(mg／I ) bud 。f plant
— — pr0【i_ (cm)
NAA 2一ip feration
植株生长表现
Plant growth
perf0rmance
注：表中增殖倍数、苗高的数据为 5瓶材料的平均值。
N。te：The data 0f bud pr0liferation rati0 and plant hei t is the
average of 5 bott【es of plants．
2．2 NAA、TDz、2一ip两两组合对培养材料的影响
2．2．1 NAA、2一ip组合对芽体增殖倍数和株 高的影
响 比较不同浓度的NAA和 2一ip组合对继代增殖
和植株生长的影响(表 2)，结果发现：在所用的三个
NAA浓度中，低浓度(O．O5 mg／L)比高浓度(O．O8
～ O．1 mg／L)更利于芽的增殖和植株长高。而对于
2一ip而言，不论 NAA取何种浓度，增殖倍数均随 2一
ip浓度的升高而增大，但植株的高度却随 2一ip浓度
的升高而下降，当2一ip浓度达到1．2 mg／L时，培养
材料均出现严重的玻璃化现象，因此，2一ip的浓度不
能过高。
对表 2的数据进行方差分析，比较 NAA和 2一
ip两种激素对芽体增殖和株高的影响。结果表明，
2一ip对芽体增殖的影响显著而 NAA不显著；对株
高则相反，NAA的影响极显著而 2一ip不显著。综
合分析两种因素对匙羹藤离体材料增殖和生长的影
响，可以看出，两者浓度过高均会对培养材料产生负
面影响，如：2一ip浓度过高，芽体的增殖倍数虽然也
增大 ，但植株长势差、玻璃化 、落 叶严重等；而 NAA
浓度过高，则生长缓慢、植株矮 、叶片卷曲皱缩等。
因此，综合增殖倍数、株高、健壮度、落叶情况等多方
面的结果，匙羹藤继代增殖培养基中，NAA的适当
浓度为 O．O5 mg／L、2一ip为 0．8 mg／L。
2．2．2 NAA、TDZ组合对 生根的影响 不同浓度和
组合的NAA和 TDz对匙羹藤试管苗生根的影响
见表 3。方差分析结果表 明，NAA 和 TDZ两种激
素对生根率和生根系数的影响分别为极显著和显
著 ，可见 ，对生根而言 ，因素 NAA 比因素 TDZ更为
重要。直接 的 观测 结果 表 明 (表 3)，当 NAA 为
O．O5 mg／L、TDz为 0．。O5 mg／L时，生根率最高
(为 lOO )，生根系数也较大(6．3)，根的健壮度最
好。过高或过低的 NAA和 TDZ的浓度均不利于
匙羹藤的生根。因此，匙羹藤的生根培养基应为
N68+NAA O．O5 mg／L+TDZ O．OO5 mg／L。
表 3 NAA和 TDz对匙羹藤生根的影响
TabIe 3 Effect of NAA and TDZ on ro。ting
of( 7 n s Z s￡rP(n=5)
实验号 辫素浓度
ExDeri— Ho mone
ment !!竺
No． NAA TDZ
生根系数
Rooting
生根率
RD0ting
根健壮度
Ro0t
O．O2
O．O2
0．02
O．O2
O．O5
O．O5
O．O5
O．O5
O．O8
O．O8
O．O8
O．O8
O．1
0．1
O．1
O．1
1．2O
2．6O
3．8O
4．9O
2．4O
4．1O
6．3O
5．8O
5．3O
4．1O
6．9O
6．5O
5．6O
6．4O
5．OO
7．6O
注：根健壮度从好到差用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V级表示；生根系数、生根
率的数据为 5瓶材料的平均值
Note： I，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ and V respectively indicate r0ot health fr。m
strong to wea k_ The data of rooting coeficient and ro0ting rates is
the average height of 5 botles plants．
2．3正交实验筛选最佳培养基
用正交实验研究不同浓度 NAA、TDZ、2一 p、6一
BA和KT组合对材料增殖、苗高和生根的影响。
V Ⅳ Ⅳ V Ⅱ I I Ⅳ Ⅱ V I V Ⅱ Ⅱ Ⅲ V
驺 ∞ ∞
叭 叭 叭
c； O O 0 O
9O 广 西 植 物 29卷
No． NAA TDZ ?i p 6一BA KT coefficient seed1ing of stem
O
O
O
O
O
O．O2
O．O2
O．O2
O．O2
O．O2
O．O5
O．O5
O．O5
0．O5
O．O5
0．1
O．1
O．1
O．1
O．1
O．2
O．2
0．2
O．2
O
O．OO1
0．OO2
O．OO5
O．O1
O
O OO1
O．OO2
O．OO5
O．01
O
O．OO1
O．OO2
O．OO5
O．O1
0
O．0O1
O．002
O．OO5
O．01
O
0．O01
O．OO2
O．OO5
O
O．O1
O O2
0．O4
0．O8
0．O2
O．04
O．O8
O
O．O1
O．O8
O
0 O1
O．O2
O．04
O．01
O．O2
0．04
O．O8
0
O．04
O．O8
O
O．O1
25 O．2 O．01 O．8 O．O2 O．1
1．32
1．67
1．79
1．44
2．89
1．78
2
1．98
2．69
1．36
1．78
2．68
2．89
1．33
1．89
1．23
2．86
1．33
1 89
1．98
1．56
1
1
1．22
O
3．86
4．71
3．37
3．61
4．74
5．56
6．42
4．31
4．89
5．O6
3．97
5．14
4．O9
4．33
3．44
3．83
4．29
3．44
4
3．72
2．3
3．O6
4．16
O．44
O
健壮
健壮
接种 4O d后观测统计 ，发现各个组合对增殖 、
苗高、生根的影响差异很大(表 4)。
对实验数据进行极差分析(表 5)，结果表明，5
种激素对芽体增殖的影响依次为：2一ip>NAA>
TDZ>6一BA>KT，对株高的影响则依次为：NAA>
TDZ>6一BA>2一ip>KT。对结果进行方差分析，结
果显示，对增殖有 明显影响的只有 NAA、2一ip；对株
高有明显影响的只有 NAA。结合重要因子选择最
适水平，不重要因子按经济原则选择最低水平，得出
NAA的最佳浓度 O．O5 mg／L，2一ip的最佳浓度 O．4
mg／L，TDz为 O．。01 mg／L，值得注意的是得出的
各个最佳培养基并不在此实验中出现，这正体现了
正交试验设计的一个优点，不会因减少试验次数而
使最好的水平搭配落选。
表 5 增殖倍数及株高的极差分析结果
Table 5 The variance analysis of proliferati。n c。efficient and height of seedIings
注；“*”表示最佳的增殖倍数或植株高度。
Note：“*’’means the be5t pr。1iferation coefficient。r height of seedlings．
为进一步验证 5种激素对增殖培养的影响，对
最佳激素组合 NAA O．O5 mg／L+2一ip O．4 mg／L十
TDZ O．0O1 mg／L以及表 5中表现较好的 5、9、12、
13、17五个组合进行验证实验，培养 4O d后观测，
结果证明，NAA O．05 mg／L+TDZ 0．OO1 mg／L+
2一iP O．4 mg／L激素配比的培养基上的材料生长及
增殖效果最好，增殖倍数为 2．68，植株健壮，无玻璃
化苗，很少有落叶等现象。比其它两激素组合使用
细 中 中 中 中 中 中 中 中 中 细 细 细 细 中 细 细 细 细 细 细 死
1 2 4 8 4 8 1 2 1 2 4 8 8 1 2 4 2 4 8
0 0 0 0
2 4 8 2 2 4 8 2 4 8 2 2 8 2 ．
2 4 2
●
2 4
0 L o o o L o
0 0 n M
1期 苏钛等 ：匙羹藤组织培养条件优化研究 91
的效果也较好。因此 N68+NAA O．O5 mg／L+
TDZ 0．001 mg／L十2～iP O．4 mg／L可作为最佳的增
殖培养基 。
3 讨论
3．1无机营养种类、浓度和配对匙羹藤组织培养的
影响
不同氮形态对不同植物品种在不同试验条件下
的生长影响有明显差异 。这可能和不同无机氮形态
对植物矿质元素的组成，植物氮代谢酶和保护酶等
酶活性的影响，及其在吸收和同化上的相互影响有
关(王华静等，2O05)。在本试验中，材料生长较好的
MS和 N68培养基 中，均含有相对较高的 NH 和
较高的 NH ：NO 比，而 N6、B5、white却含有相
对较低 的 NH 或 不 含 NH 和 较低 的 NH ：
NO 比。可推测，培养基中较高 NH 含量和 NH
：NO 比值可能利于匙羹藤组织培养过程中植株
的正常生长。另外，由于在单独使用硝酸盐时，培养
基的pH值会向碱性方向漂移，加入少量铵盐则会
阻止这种漂移(李俊明，2OO2)。N6、B5、White也有
可能在培养过程中培养基碱性增强，从而影响了匙
羹藤的生长。这有待进一步的实验证明。
3．2激素种类、浓度和配对匙羹藤组织培养的影响
激素种类和浓度的搭配是诱导植物产生芽、根 、
愈伤组织的关键因素。在匙羹藤组织培养中发现，
NAA、2一ip两激素配合使用时，2一ip对增殖倍数具
有显著影响，而对株高没有显著影响；而 NAA却刚
好相反。两激素的最适浓度分别为 NAA O．O5 mg／
L、2一ipO．8 mg／L。
虽然在实验中，通过不断地改变激素种类和水
平配比，得到较好增殖、生根效果，但仍不能解决试
管苗落叶、多次继代容易出现玻璃化等问题，因此推
测，多种激素组合可能产生利于匙羹藤生长的交互
作用效果。为探讨不同激素组合对植物生长的影
响，获得更多的植物生长信息，采用正交实验设计分
析 AA、TDZ、2一ip、6一BA和 KT五因素对匙羹藤
生长的影响。当五因素配合使用时，仅 NAA、2一ip
对增殖有显著影响；NAA对株高有显著影响。最
适浓度分别为NAAO．O5 mg／L、2一ipO．4 mg／L。陶
静等(1998)的研究也认为激素间的协同作用效果要
远大于一种激素的单独使用的效果。不同的外源激
素极有可能引起内源的乙烯与多胺的变化，多胺对
植物的许多生理生化过程都有影响，它的变化影响
可溶性蛋白、过氧化物酶，进而导致不同的形态发生
(田长思等 ，1998)。在匙 羹藤增殖过程 中，NAA、
TDz、2一ip三种激素组合使用时，其间的协同作用大
于 NAA和 2一ip两因素组合，说明在促进匙羹藤生
长时，多种激素配合的效果大于两种激素配合的
效果。
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