全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(3)：388— 392 2011年 5月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．05．020
罗汉果果实不同发育时期 SSH文库的构建
唐 其 ，邱德有 ，马小军 ，3*，莫长明3，付 伟
(1．中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 ，北京 i00193；2．中国林业科学研究院 林业研究所 ，
北京 100093；3．中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所广西分所，南宁 530023)
摘 要 ：以罗汉果授粉后 5O d和 7O d果实为材料，利用抑制消减杂交技术构建了罗汉果果实在不同生育时
期皂苷生物合成相关基因的差减 eDNA文库。在正向差减文库(7O d为 tester，50 d果实为driver)中随机挑
选了641个 cDNA阳性克隆测序，得到622条有效序列，重组率在 96 以上。外源片段的长度分布在 101～
934 bp之间，平均长度约 500 bp。BLAsTN结果显示：201个 ESTs序列没有同源序列，可能是新基因；另外
421个 ESTs序列在核酸数据库中存在同源序列，其序列和已知功能(主要是能量代谢、次生代谢、转录因子、
衰老及抗病性等)的蛋白有高度相似性 。构建的 cDNA文库符合 SSH文库的质量标准，能满足下一步的实验
要求。该 sSH—cDNA文库为研究罗汉果差异表达基因、探讨三萜皂苷生物合成的分子机理 、提高罗汉果甜苷
V 的质量和产量奠定了基础。
关键词 ：罗汉果 ；甜苷 V；抑制消减杂交 ；三萜皂苷 ；EST
中图分类号 ：Q541 文献标识码 ：A 文章编 号：1000—3142(2011)03—0388—05
Construction of SSH-cDNA library from different
of Siraitia grosvenorii
TANG Qi1，QIU De-You2，MA Xiao-Jun1，3 ，
MO Chang-Ming3，FU Wei1 ‘
(1．Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical Colege，Beijing 100193，
China；2．The Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China；3．Guangxi Branch
Institute，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy oJ’Medical Sciences，Nanning 530023，China)
Abstra~：In order tO reveal the differentially-expressed genes involved in triterpenoid saponin biosynthesis of Siraitia
grosvenorii，50 DAF(days after flowering)and 70 DAF fruits from different developmental stages were employed to
construct subtractive eDNA library by suppression subtractive hybridization(SSH)in this study．Total 641 positive
clones were selected randomly and sequenced from the forwar&subtracted cDNA library(70 DAF as the tester and 50
DAF as the driver)，and 622 high quality sequences were obtained．The rate of the recombination fraction was above
96 ．The distribution of inserted fragments ranged from 101 bp and 934 bp，and the average fragment size was 500
bp．Folowed by BLASTN and BLASTX for sequences dates，201 ESTs showed no significant matches to any other
sequences in NCBI nucleotide sequence database，they were probably novel genes．The other 42 1 ES％ carried with
remarkable identity tO proteins with known function in the database，which fel into several functional categories inclu
ding energy and secondary metabolism，transcription factors，ripening，senescence and pathogen-resistance．Further
results indicated that the eDNA library quality were conformed to SSH library standard and could be used in further
收稿日期：
基金项 目：
作者简介：
通讯作者：
2010—08—06 修回日期：2010一l1—18
国家 自然科学基金(30560183，30860379)[Supported bytheNationalNatural Science Foundation ofChina(30560183，30860379)1
唐其(1981一)，男 。湖南株洲人 ，在读博士生，主要从事药用植物分子生物学研究。
马小军，博士，研究员，从事药用植物生物技术研究，(E—mail)xjma@public．bta．net．cn。
3期 唐其等：罗汉果果实不同发育时期 SSH文库的构建 389
studies，also would provide reference for studying the diferentially expressed genes，exploring molecular mechanism of
triterpenoid saponin biosynthesis，and increasing productivity and quality of mogrosides in S．grosvenorii．
Key words：Siraitia grosvenorii；mogrosides V；suppression subtractive hybridization；triterpenoid saponin；Ex—
pressed sequence tags
罗汉果(Siraitia grosvenori)是我国特有珍贵
药用和甜料植物，为葫芦科多年生藤本植物，主要分
布于广西北部山区。罗汉果苷的苷元类似，都含有
一 个葫芦烷型四环三萜(罗汉果醇)骨架，连接的糖
均为葡萄糖，差异仅在 C3和 C24上连接的葡萄糖
数目和方式不同，而形成多种罗汉果苷。不同生长
日龄的罗汉果苷类会发生变化，果实发育的 30 d前
后罗汉果苷代谢变化很大，其中罗汉果甜苷 V随生
长周期增加其含量也逐渐增加。坐果 50 d后，罗汉
果甜苷 V的含量增加较快，80 d达最高值，而后趋
于稳定(李典鹏等，2004；陈全斌等，2005)。本研究
的前期结果表明，授粉后30 d果实的甜苷 V含量与
50 d差别极小，而 5O d与 70 d存在一个急剧跃变
期，含量迅速达到高峰。因此，我们推测罗汉果甜苷
V含量的差异很可能与皂苷生物合成相关基因呈时
间性差异表达调控有关。罗汉果分子生物学研究还
处于起步阶段，目前的研究主要集中在分子标记应
用(周俊亚等，2006)、组织培养(郑晓峰等，2008)等
方面，而罗汉果基因序列目前未见报道，基因克隆还
是空白。对于罗汉果甜苷 V的生物合成途径也不
清楚。为了解罗汉果中葫芦烷型四环三萜皂苷合成
的分子机理，必须首先克隆到相关的差异表达基因
并进行深入的研究 。
抑制性消减杂交技术(SSH)是一种有效分离差
异表达基因的方法(Diatchenko等 ，1996，1999)。它
能富集稀少的 mRNA，有利于筛选低拷贝差异基
因，可一次检出上百个差异表达基因。许多研究人
员利用该技术已经从动植物的不同组织、器官以及
不同的发育时期成功地分离出了众多的差异表达基
因(Li等，2006；李小艳等，2006；刘阳等，2005；肖钢
等，2008；李红霞等，2008；和风美等，2010)。罗汉果
皂苷的生物合成涉及大量基因的协同作用，因此，
SSH成为研究罗汉果皂苷生物合成机理的首选便
捷技术。本研究以罗汉果授粉后 50 d和 70 d果实
为材料，首次利用抑制消减杂交技术(SSH)构建了
罗汉果差异表达基 因 cDNA文库 ，通过研究罗汉果
不同生育时期甜苷 V含量相关的差异表达基因，探
讨三萜皂苷生物合成的分子机理，以期为研究罗汉
果皂苷生物合成相关基因表达、差异基因筛选及 目
的基因的克隆提供依据。其结果有利于从分子水平
深入探讨罗汉果品质形成机理，也为其他果实类药
用植物品质改善研究提供参考。
1 材料与方法
1．1材料和试剂
罗汉果 F014(农院B6)×M028(红雄 1号)的杂
交果实，取授粉 5O d和70 d的果实。组培苗由桂林
亦元生公司提供，2008年 4月下旬种植于桂林兴安
罗汉果实验基地 ，8月初授粉挂牌 ，9月下旬和 10月
中旬取罗汉果授粉 50 d和 70 d的果实，取果肉迅速
置于液氮速冻后放在一8O℃超低温冰箱保存备用。
pMD19一T载体，大肠杆菌 DH5a感受态细胞，
Ex Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司，Trizol
RNA 提 取 液 购 自 Invitrogen公 司。PCR-SelectTM
cDNA Subtraction Kit，AdvantageTM 2 PCR Kit购 自美
国Clontech公司。Taq Mix酶购 自天根生化科技
(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1．2方法
1．2．1果肉总RNA的分离与纯化 分别取罗汉果
F014×M028的杂交果实授粉 50 d和 70 d材料 ，加
入液氮充分研磨，参照 Invitrogen公司 Trizol RNA
提取液操作说明提取总 RNA。按照 promega公司
DNase消化 方法 进行 DNA 消 化 ：取 1～ 8 L总
RNA，加人 1 I上L RQ1 10×Reaction Bufer，适 量
RQ2 DNase酶(1 U／Fg RNA)，用无 RNase酶的水
补至 1O L。37℃水浴 10 min，加入 1 L RQ1 DNase
Stop Solution终 止反 应 。65℃温 浴 10 rain灭 活
DNase酶。用 1．5 的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA
完整性，最后得到的总 RNA于一80。C保存备用。
1．2．2 SSH与 SSH cDN『A文库的构建 按 Clon—
tech公 司的 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit
的操作说明(Diatchenko等，1999)进行 cDNA的合
成、RsaI酶的消化和 SSH操作。以 70 d的果 肉
RNA为检测 子 (tester)、50 d的果 肉为驱动子
(driver)，构建罗汉果不同生育时期甜苷 V合成条
390 广 西 植 物 3l卷
件下特异表达基因的正向 cDNA文库。SSH—PCR
产物与 pMD19-T载体连接，然后转化大肠杆菌感
受态细胞 DH5a，涂布于含有 Amp／X—gal／IPTG 的
I B培养基上，37℃过夜培养，随机挑取白色克隆，
利用 M13引物检测目的片段的插入情况。
1．2．3序列测定和 BLAST分析 挑选阳性克隆送
往上海生工生物技术有限公司进行测序。所获序列
利用 DNAstar软件进行剪切与拼接而得到不含载
体序列的 EST。采用 NCBI(http：／／blast．ncbi．
nlm．nih．gov／Blast．cgi)的 BLASTN 或 BLASTX
在线序列比对工具，对所有 EST序列进行 同源性检
索分析。
2 结果与分祆
2．1罗汉果果肉总 RNA质量检测
琼脂糖凝胶电泳显示，果肉总 RNA中的 28S
rRNA与 18S rRNA的亮度比例约为 2：1，经紫外
分光光度仪检测，A 。／28。值在 1．8～2．0之 间，
A 值大于 2．0。表明所制备的总 RNA质量较
好，达到建库要求(图1)。
28S
1 8S
图 1 罗汉果果肉 RNA 的电泳检测
Fig．1 Detection of total RNA
2．2第一链合成和第二链合成
取适量果 肉总 RNA(2～1 000 ng)为模板 ，进
行第一链和第二链的合成。双链 cDNA琼脂糖凝
胶电泳见图 2。
2．3消减杂交
合成的双链 cDNA用 Rsa I酶切并纯化酶切产
物，用 0．8 琼脂糖凝胶电泳检测合格后，将酶切产
物 1：6稀释进行接头连接。确定接头的连接效果
后进行第一次杂交和第二次杂交。以Primer一1(5
CTAATACGACTCACTATAGGGC一3 )为引物进
行第一 次 PCR。以 Nest PCR Primer一1(5 TC—
GAGCGGCCGCCCGGGCAGGT一3 )和 Nest PCR
Prim er-2R (5 一AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT一
3 )为引物进行第二次PCR，结果见图3。
由图 3可知 ，第二次扩增后 ，未消减样(泳道 1)
产物条带变亮 ，弥散分布于 300～1 200 bp；消减样
(泳道 2)条带更加集中，主要分布在 250～800 bp。
这说明，通过两次消减杂交，达到了富集差异表达基
因片段，扣除非特异表达基因片段的目标。从图 3
中可看到 ，70 d主要 以 230 bp、400 bp和 520 bp处
的基 因表达为主。
4
300
50
o
0
b8
2000bp
1200bp
800bp
500bp
图 2 50 d和 70 d果实双链 cDNA合成
Fig．2 Electrophoresis of ds cDNA
from 50d and 70 d fruits
200bp
500bp
800bp
1．2kb
2．Okb
3．Okb
4．5kb
图 3 SSH第二次 PCR产物
Fig．3 Electrophoresis of the second SSH PCR products
1．未消减样 ；2．消减样
1．Unsubtracted sample：2．Subsracted sample
2．4差异表达 eDNA文库的 PCR产物检测
对随机挑取的克隆进行 PCR检测，除了有多条
扩增带的克隆和扩增带小于 200 bp的克隆以外，结
果 90 以上的克隆皆能扩增出有效产物。图 4为
文库随机挑取的菌落 PCR电泳图，其扩增片段大小
为25O～900 bp，且多数在 500 bp左右。
2．5 EST测序分析
从 SSH—cDNA文库中随机挑取 641个单克隆
进行测序，～共获得 622个有效测序结果，其中已知
3期 唐其等：罗汉果果实不同发育时期 SSH文库的构建 391
的 421条 ，占全部 EST的 67．7 ，所获 EST 中最短
的 101 bp，最长的 934 bp。在 BLASTx比对结果基
础上发现这些 EST主要和已知功能(能量代谢、物
质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相
似性。在功能已知的 EST序列中得到可能与罗汉
果甜苷 V生 物合成代谢 密切相关 的基 因，如 glu—
cosyltrasferse，cytochrome P450酶等。大部分已知
EST同源于葫芦科等。未知的占 201条，在 NCBI
上进行 BLASTN比对没有同源序列，可能代表新
基因，占全部 EST的 33．3％。
图4 70 d正向消减文库部分克隆的菌落 PCR检测
Fig．4 PCR identification of inserted fragments in 70 d forward SSH—cDNA library
3 结论与讨论
罗汉果甜苷V的母核一罗汉果醇的苷元的生物
合成是先经异戊二烯途径，经 2，3一氧化鲨烯环化酶
作用，使 2，3一氧化鲨烯先环化形成葫芦烷四环三萜
类骨架，该骨架经细胞色素 P450依赖性单加氧酶、
糖基转移酶及其他酶类介导进行如氧化、置换及糖
基化等化学修饰，最终形成不同三萜类苷元及糖苷
终产物 。然而 ，由于三萜类皂苷分子本身的复杂性，
加之缺乏生化途径研究的代谢中问体，人们迄今对
三萜类皂苷的生物合成途径仍缺乏深入了解，通过
调节三萜骨架合成关键酶基因来调控三萜皂苷的生
物合成难度较大(Haralampidis等，2002)。罗汉果
苷的苷元类似，都含有罗汉果醇骨架，连接的糖均为
葡萄糖 ，差异仅在 C3和 C24上连接的葡萄糖数 目
和方式不 同，而形成 多种 罗汉果苷 (图 5)。未成 熟
果实主要含有苦味成分苷 IIE，II，IV，而成熟果实
中以苷 V为主(李典鹏等，2006)。
在本研究 中，罗汉果 甜苷 V在授 粉后 50 d与
70 d之间呈急剧跃变的现象，在此阶段大量低糖苷
转化为高糖苷，而低糖苷向高糖苷的转化可能只是
单一的转葡萄糖基反应。因此推测，此阶段可能存
在特异的葡萄糖基转移酶起到这种作用。在以70 d
果实为 tester，50 d果实为 driver构建 的正 向 SSH
文库中筛选到了甜苷 V生物合成途径中下游基因，
如 P450酶和糖基转移酶。通过对糖基转移酶的进
4．5kb
3．Okb
2．Okb
1．2kb
0．8kb
0．5kb
一 步研究如 RACE技术克隆其全长、原核表达或通
过罗汉果转基因鉴定其基因功能等，对于提高罗汉
果中甜苷 V的含量具有重要 的指导意义 。
RIO
29 28
图 5 不同的罗汉果苷结构式
Fig．5 Structure of mogrosides in Siraitia grosvenorii
SSH的核心技术是抑制性 PCR(suppression
PCR)，它是一种将检测子(tester)cDNA单链标准
化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术，其中标
准化步骤均等了检测子中的 eDNA单链丰度，而消
减杂交步骤去除了检测子和驱赶子(driver)之间的
共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到
扩增，显著增加了获得低丰度表达差异 cDNA的概
392 广 西 植 物 31卷
率(楼士林等，2002)。SSH对实验起始材料要求较
多，需要 5～10 g的 mRNA，如果 tuRNA量不够，
那么低丰度的差异表达基因的 cDNA很可能会检
测不到。本研究没有纯化和分离 mRNA，而是用总
RNA直接进行反转录。采用 SMART cDNA合成技
术来弥补 SSH对样品需求量大的缺点。从本次实验
所建成的文库质量来看，用 SSH kit反转录总 RNA，
可以成功的构建罗汉果的抑制消减 eDNA文库。
本研究首次利用 SSH技术对罗汉果果实进行
测序研究，最终获得了许多基因的表达序列标签。
由于目前罗汉果的基因研究还是空白，所以EST中
已知基因主要比对上那些基因信息比较清晰的物
种，比如葡萄、拟南芥、西葫芦等物种。而未知基因
比例高达 33．3 ，这些未知基因可能代表了罗汉果
果实发育和三萜皂苷生物合成相关的新基因。这些
EST将为进一步大批量筛选、利用 RACE技术克隆
罗汉果皂苷生物合成途径中的关键酶基因，绘制差
异基因表达谱，最终阐明罗汉果甜苷 V生物合成机
制提供了重要的前提条件。
参考文献：
楼士林 ，杨盛 昌，龙敏南，等．2002．基因工程 [M]．北京 ：科学
出版社：230
Chen QB(陈全斌 )，Yi XH(义 祥辉 )，Yu LJ(余 丽娟 )，et a1．
2005．Study on the variation of mogroside V and flavone glyco—
sides in Siraitia grosvenorii fresh-fruits in diferent growth peri—
ods(不同生长周期的罗汉果鲜果 中甜苷V和总黄酮含量变化
规律研究)[J]．Guihaia(广西植物)，25(3)：274—277
Diatchenko L，Lau YFC，Campbell AP，et a1． 1996．Suppression
subtractive hybridization：a method for generating diferentialy
regulated or tissue specific eDNA probes and libraries[J]．Pro—
ceedings Nat Academy Sci(U )，93(12)：6 025—6 030
Diatchenko L，lukyanow S，Lau YF，et a1．1999．Suppression sub—
tractive hybridization：a versatile method for identifying differen—
tialy expressed genes[J]．Methods Enzymol；303：349—380
He FM(和风美)，Zhu YP(朱永平)，Yang XH(杨 晓红 )．2010．
Construcion of subtraetive cDNA Library of genes involved in
saponin biosynthesis from diferent age Sanchi root(不同年龄三
七根皂苷合成 相关基 因 的差 减 cDNA 文库构 建)[J]．Mol
Plant Breeding(分子植物育种)，8(1)：145—150
Haralampidis K，Trojanowska M，Osbourn AE．2002．Biosynthesis
of triterpenoid saponins in plants[J]．Advances in Biochemical
Engineering／Biotechnology，75：31—49
Li DP(李典鹏 )，Chen YY(陈月 圆)，Pan ZH(潘争 红)，et a1．
2004．Study on variation of mogrol glycosides from fruits of Si—
raitia grosvenorii in different growing ages(不 同生长 日龄罗汉
果苷类成分变化研究)[J]．Guihaia(广西植物)，24(6)：546
549
Li DP，Tsuyoshi Ikeda，Huang YL，eta1．2007．Seasonal variation
of mogrosides in Luohanguo(Siraitia grosvenori)fruits[J]．J
Nat Med，61(3)：307—312
Li HX(李红霞)，Zhang LY(张龙雨)，Zhang GS(张改生)，et a1．
2008．Construction on eDNA library from fertility-related genes
of male sterile wheat with Aegilops kotschyi Cytoplasm by SSH
(黏类小麦育性相关基 因 SSH 文库的构建 )EJ]．Acta Agron
Sin(作物学报)，34(6)：975—971
Li RJ，Wang HZ，Mao H，eta1．2006．Identification of differential—
ly expressed genes in seeds of two near-isogenic Brassica napus
lines with diferent oil content[J]．Planta，224(4)：952—962
Li XY(李小艳)，Zhao Y(赵云)，Zhou YT(周云涛)，et a1．2006．
Construction and primary analysis of suppression subtractive li
brary of dwarf mutant‘NDF-1’in Brassica napws(甘蓝型油菜
矮化突变体抑 制消减 eDNA文库 的构建及初 步分析 )EJ]．
ChinJ Oiz Crop Sci(中国油料作物学报)，28(4)：396—402
Liu Y(刘 阳)，Wang ML(王茂林 )，Qiu F(邱 峰)，et a1．2005．
The construction of the suppression subtractive library of the
Brassica napus Mutant Cr3529(甘蓝型油菜突变体 Cr3529抑
制性消减文库的构建)[J]．J Sichuan Univ：Nat Sci Edi(四川
大学学报 ·自然科学版)，42(5)：1 029—1 032
Qi xY(戚 向阳)，Chen WJ(陈维军)，Zhang LQ(张俐 勤)，et a1．
2006．Study on the inhibitory efects of natural sweetner mogro—
sides on radical and lipid peroxidation(罗汉果皂苷清除 自由基
及抗脂质过氧化作用的研究)『J]．SciAgric Sin(中国农业科
学)，39(2)：382—388
XiaoG(肖钢)，Zhang XY(张 秀英)，Zhang ZQ(张振 乾)，et a1．
2008．Co nstruction of subtractive library for differentialy-ex—
pressed genes at diferent developmental stages in Brassica napus
(甘蓝型油莱种子不同发育期基因差异表达 cDNA文库构建)
[J]．J Hunan Agric Univ：Nat Sci Edi(湖南农业大学学报 ·
自然科学版)，34(5)：513—518
Zhene XF(郑晓峰)，Huang G(黄 刚)．2008．Tissue culture and
rapid propagation of Momordicagrosvenorii seedlings(罗汉果种
苗组织培养与快繁技术)[J]．Seed(种子)，27(4)：102—104
Zhou JY(周俊亚)，Tang SQ(唐绍清)．2006．Genetic diversity of
cultivated Luohanguo(Siraitia grosvenori)Revealed by RAPD
Markers(栽培罗汉果遗传多样性的RAPD分析)IJ]．Molecu
larPlant Breeding(分子植物育种)，4(1)：71—78