全 文 ：中国生态农业学报 2010年 9月 第 18卷 第 5期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Sept. 2010, 18(5): 1022−1025


* 中国科学院知识创新工程青年人才领域前沿项目( 0707013603)资助
** 通讯作者: 刘合刚(1954~), 男, 教授, 研究方向为植物学和中药药理学, E-mail: liuhegang@163.com; 徐进(1973～), 男, 博士, 副研究
员, 研究方向为植物抗逆的生理和分子生物学, E-mail: xujin@sjziam.ac.cn
孙弘(1969~), 男, 硕士, 主要从事植物学和中药药理学研究。E-mail: shkshk1969@163.com
收稿日期: 2009-04-07 接受日期: 2009-08-05
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.01022
外源甘氨酸对镉胁迫下苜蓿幼苗生长和
氧化损伤的影响*
孙 弘 1 刘合刚 1** 崔谨谨 1 刘小京 2 杨丽琳 2 徐 进 2**
(1. 湖北中医学院药学院 武汉 430061; 2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心 石家庄 050021)
摘 要 以苜蓿为试验材料, 分析了甘氨酸处理对幼苗镉(Cd)毒害缓解的生理机制。Cd 毒害降低了苜蓿幼苗
超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性, 导致幼苗出现氧化伤害, 如丙二醛(MDA)含量升高, 伊文斯
蓝(Evans blue)染色加深。甘氨酸处理提高了苜蓿幼苗 SOD和 CAT活性, 降低了 MDA的累积, 减少了氧化伤
害。Cd 毒害还降低了幼苗硝酸还原酶(NR)活性, 外源甘氨酸处理则显著提高其 NR 活性。施用 NR 抑制剂钨
酸钠降低了苜蓿幼苗的 NR活性, 同时抵消了甘氨酸对 Cd胁迫幼苗的生长缓解作用。表明甘氨酸通过提高苜
蓿幼苗的抗氧化能力和 NR活性, 从而提高幼苗对 Cd胁迫的耐受性。
关键词 苜蓿 Cd胁迫 甘氨酸 抗氧化酶 氧化损伤 硝酸还原酶
中图分类号: X503.23 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)05-1022-04
Effect of exogenous Gly on the growth and oxidative damage of
alfalfa seedling under Cd stress
SUN Hong1, LIU He-Gang1, CUI Jin-Jin1, LIU Xiao-Jing2, YANG Li-Lin2, XU Jin2
(1. School of Pharmacy, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061, China; 2. Center for Agricultural
Resources Research, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Shijiazhuang 050021, China)
Abstract Protective effects of Gly against Cd toxicity in alfalfa seedlings were investigated. Cd toxicity reduces the activity of
SOD and CAT, resulting in oxidative damage such as high MDA content and Evans blue uptake by alfalfa seedling root. Supplemen-
tation of Cd with Gly increases SOD and CAT activity and decreases MDA accumulation, thereby reducing oxidative damage in al-
falfa seedlings. Cd treatment also reduces NR activity while Gly enhances NR activity in Cd-treated alfalfa seedlings. On the other
hand, tungstate (NR inhibitor) supply reverses the effect of Gly by decreasing NR activity and inhibiting seedling growth. The results
suggest that enhanced Cd tolerance by Gly treatment is correlated with increasing activities of antioxidative enzymes and NR in al-
falfa seedlings.
Key words Alfalfa, Cd stress, Gly, Antioxidative enzyme, Oxidative damage, Nitrate reductase
(Received April 7, 2009; accepted Aug. 5, 2009)
镉(Cd)是土壤污染中最具毒性的元素之一。Cd
毒害严重影响了作物生长, 导致作物减产。我国受
Cd、Cr、As、Pb等重金属污染的耕地面积近 2 000
万 hm2, 约占总耕地面积的 20%[1]。植物根系吸收
的Cd很容易向地上部迁移, 并在蔬菜可食部位和作
物籽粒中累积, 对人类健康造成威胁。近 30 年来,
对重金属超富集植物和模式植物的研究, 使人们对
植物 Cd 胁迫的耐受性和累积的生理和分子机制有
了较多认识[2−3]。深入研究 Cd 对植物的毒害以及植
物对Cd耐受性的机理, 是采用农业生物技术降低作
物重金属污染、提高作物品质的前提。
Cd 毒害影响着植物生长发育的很多方面。Cd
第 5期 孙 弘等: 外源甘氨酸对镉胁迫下苜蓿幼苗生长和氧化损伤的影响 1023


胁迫引起植物营养器官延迟生长和叶片卷曲、失绿;
光合作用受到抑制, 可溶性糖和淀粉含量降低; 矿
质代谢紊乱, Cd 毒害引起植株缺 Fe, 并对 K 和 Ca
的吸收降低。细胞内抗氧化系统的失衡是植物受到
Cd 胁迫的主要表现之一。Cd 胁迫导致植物体内活
性氧(ROS)含量迅速升高 , 引起植物氧化胁迫和膜
系统的损伤[4]。Cd胁迫还降低了植物氮代谢的效率,
抑制植物生长。Wang等[5]的研究表明, Cd胁迫下重
金属超富集植物龙葵幼苗中的硝态氮含量和硝酸还
原酶(NR)活性降低; 随着 Cd浓度的升高, 铵态氮含
量和谷氨酰胺合成酶(GS)活性也显著减少。上述结
果表明, Cd胁迫显著抑制植物的正常氮代谢途径。
植物对 Cd 胁迫的响应是一个由多基因控制的
复杂过程, 涉及其生理生化过程中的每一方面。植
物受到Cd胁迫时, 其生长状况发生变化的一个重要
指标就是由正常代谢转变为防御代谢。一方面, 植
物体内产生一些修复蛋白、运载蛋白和螯合蛋白 ,
对 Cd 胁迫造成的伤害进行修复和解毒; 另一方面,
植物体内会产生一些小分子物质(如 NO、氨基酸、
小肽)和蛋白质等, 这些物质可以作为植物体内的信
号分子, 快速启动下游防御系统的表达, 还可以作
为渗透调节物质, 用以维持细胞的正常渗透压。植
物细胞中有很多有机酸、氨基酸、可溶性糖、多肽
和一些螯合蛋白如脱水蛋白、金属硫蛋白和植物络
合素等, 在胁迫条件下这些物质的合成迅速增加[6]。
它们能以不同方式与金属离子络合, 降低重金属离
子对细胞的毒害。一些氨基酸分子, 如脯氨酸、半
胱氨酸等, 对于缓冲胞质金属离子浓度、提高细胞
对重金属的抗性和运输能力等发挥了重要作用[7]。
对这些蛋白质和小分子物质的研究, 将有助于深入
揭示植物对 Cd耐受的生理和分子机制。
甘氨酸是植物体内重要的氨基酸分子, 是硝态
氮的代谢产物, 也是谷胱甘肽和植物螯合肽合成的
前体物质。以甘氨酸作为氮源, 部分替代培养液中
的硝态氮, 明显降低了不结球白菜和生菜中的硝酸
盐含量, 并提高了植株的鲜重[8]。杨伟等[9]发现经甘
氨酸处理的黄瓜幼苗在光下明显促进了对硝酸盐的
吸收和还原, 叶片铵态氮累积增加, 硝态氮减少。陈
振德等[10]发现甘氨酸处理促进了小麦幼苗对硝酸盐
的吸收, 并提高了 NR活性。这些研究表明, 甘氨酸
参与了对植物氮代谢的调节。由于 Cd胁迫显著抑制
植物正常的氮代谢途径, 而甘氨酸促进植物体内硝
酸盐的还原, 推测外源甘氨酸可能通过调节氮代谢
途径, 从而缓解 Cd对幼苗的伤害。本研究以苜蓿为
试验材料, 分析了甘氨酸处理对幼苗Cd毒害缓解的
生理机制。
1 材料与方法
供试紫花苜蓿(Medicago truncatula)种子由北京
师范大学黄玮博士馈赠。挑选籽粒饱满、大小均匀
的苜蓿种子, 流水清洗干净, 75% C2H5OH表面消毒
30 s后, 置于 50%漂白水表面消毒 5 min。无菌水冲
洗 3~5 遍, 灭菌滤纸吸干水分。均匀播种于 MS 培
养基上, 每皿 15粒, 于 16 h光照 25 ℃环境中萌发。
将萌发 2 d的幼苗分别转入以下几种处理的MS培养
基中继续培养: (1) 50 μmol·L−1 CdCl2; (2) 50 μmol·L−1
CdCl2+100 μmol·L−1NR 抑制剂钨酸钠 ; (3) 50
μmol·L−1 CdCl2+100 μmol·L−1钨酸钠+甘氨酸(100
μmol·L−1、200 μmol·L−1、400 μmol·L−1、500
μmol·L−1)。
7 d后对幼苗进行生理检测, 试验设 3次重复。
数码相机拍摄幼苗, ImageJ 软件统计幼苗的生长指
标。丙二醛含量分析采用 Li等[11]的方法; 伊文思蓝
(Evans blue)不能穿越细胞膜进入活细胞, 因此, 采
用 Evans blue 染色可以检测根尖细胞死亡程度[12];
NR 活性采用分光光度法检测[13]; SOD 活性采用王
爱国等 [14]的方法, 以抑制氮蓝四唑 (NBT) 光氧化
还原的 50%酶量为 1个活力单位; CAT活性测定采用
高锰酸钾滴定法, 以每分钟分解 H2O2的毫克数为 1
个酶活力单位[15]。
2 结果与分析
2.1 甘氨酸处理缓解了 Cd 对苜蓿幼苗生长的抑制
作用
前期研究发现, Cd 胁迫显著抑制苜蓿幼苗根的
伸长生长, 且抑制作用随重金属浓度提高而加剧。
50 μmol·L−1 CdCl2 胁迫下, 幼苗根长约为对照的
50%。因此, 本研究选择 50 μmol·L−1 CdCl2处理作
为半致死浓度, 研究了外源甘氨酸对 50 μmol·L−1
CdCl2胁迫下苜蓿幼苗株高、根长、MDA 含量以及
伊文思蓝吸收的影响。表 1 表明, 甘氨酸处理缓解
了 Cd对幼苗的生长抑制。随着甘氨酸浓度升高, 幼
苗的株高和根长显著高于对照。400 μmol·L−1甘氨
酸处理的幼苗, 其株高和根长较单独Cd处理的对照
分别升高 36.36%和 36.57%。进一步分析表明, 甘氨
酸显著减低了幼苗的MDA水平和Evans blue染色程
度 , 说明甘氨酸处理降低了幼苗中活性氧的伤害 ,
改善了幼苗的生长状况。
2.2 甘氨酸处理提高了 Cd 胁迫下苜蓿幼苗的抗氧
化酶活性
SOD 和 CAT 是植物细胞中重要的活性氧清除
剂, SOD主要将超氧阴离子自由基歧化为 H2O2和 O2,
从而减轻超氧阴离子对细胞的毒害。CAT 能够通过
1024 中国生态农业学报 2010 第 18卷


表 1 外源甘氨酸对 50 μmol·L−1 CdCl2胁迫下苜蓿幼苗株高、根长、MDA含量以及伊文思蓝吸收的影响
Tab. 1 Effects of exogenous Gly on plant height, root length, MDA content and Evans blue uptake of 50 μmol·L−1
CdCl2-stressed alfalfa seedlings
甘氨酸浓度
Gly concentration (μmol·L−1)
株高
Plant height (cm)
根长
Root length (cm)
MDA含量
MDA content [nmol·g−1(FW)]
伊文思蓝吸收
Evans blue uptake (OD600)
CK 1.98±0.20 2.11±0.17 2.5±0.14 0.14±0.01
0 1.21±0.09 1.34±0.07 4.5±0.18 0.18±0.02
100 1.32±0.05 1.50±0.03 4.0±0.15 0.15±0.02
200 1.50±0.06 1.67±0.05 3.5±0.08 0.08±0.02
400 1.65±0.07 1.83±0.09 3.2±0.09 0.09±0.01
500 1.40±0.02 1.62±0.08 3.8±0.13 0.13±0.02
CK: 不加 Cd的 MS培养基 MS media without Cd. 下同 The same below.

电子传递而将 H2O2转变为 H2O 和 O2。进一步分析
甘氨酸处理的幼苗抗氧化酶活性表明, Cd 胁迫下,
苜蓿幼苗中 SOD和 CAT活性随 Cd浓度增加而降低,
甘氨酸处理可不同程度地提高其 SOD和 CAT活性。
与 50 μmol·L−1 CdCl2处理相比, 400 μmol·L−1甘氨
酸处理下, SOD 活性提高 74.86%, CAT 活性提高
48.65%(表 2)。

表 2 外源甘氨酸对 50 μmol·L−1 CdCl2胁迫下苜蓿
幼苗 SOD和 CAT活性的影响
Tab. 2 Effects of exogenous Gly on the activity of SOD and
CAT in 50 μmol·L－1 CdCl2-stressed alfalfa seedlings
甘氨酸浓度
Gly concentration
(μmol·L−1)
SOD活性
SOD activity (U)
CAT活性
CAT activity (U)
CK 2.80±0.10 53±4.0
0 1.83±0.12 37±2.7
100 2.00±0.20 43±3.0
200 2.34±0.18 47±3.5
400 3.20±0.23 55±4.5
500 2.67±0.20 45±4.2

2.3 甘氨酸处理提高了 Cd 胁迫下苜蓿幼苗的 NR
活性
已有研究表明, 外施甘氨酸提高了黄瓜、生菜
和小麦等植株幼苗的 NR 活性, 改善了植株的氮营
养, 促进了幼苗生长[8−10]。进一步研究甘氨酸对 Cd
胁迫下苜蓿幼苗 NR 活性的影响表明, 与对照相比,
Cd胁迫幼苗的 NR活性降低 26.97%, 而甘氨酸处理
则提高了幼苗的 NR 活性。采用 NR 抑制剂钨酸钠
显著抑制了苜蓿幼苗的 NR 活性, 同时抵消了甘氨
酸对 Cd胁迫幼苗生长的促进作用(表 3)。
3 讨论
植物通过多种途径降低重金属毒害, 包括合成
有机小分子物质, 如各种氨基酸分子, 是植物响应
重金属胁迫的重要机制之一。其中研究较多的是脯
氨酸。Cd胁迫显著诱导了细胞内脯氨酸的合成, 外
表 3 甘氨酸和钨酸钠处理对 50 μmol·L−1 CdCl2胁迫下
苜蓿幼苗 NR活性的影响
Tab. 3 Effects of exogenous Gly and tungstate on the activity
of NR in 50 μmol·L−1 CdCl2-stressed alfalfa seedlings
处理
Treatment
NR活性
NR activity
[μg·g−1(protein)·h−1]
株高
Plant height
(cm)
根长
Root length
(cm)
CK 97.5±7.3 1.98±0.21 2.11±0.17
Cd 71.2±5.3 1.21±0.09 1.34±0.07
Cd+Gly 85.0±6.2 1.65±0.17 1.83±0.19
Cd+Gly+钨
酸钠
Tungstate
60.2±5.6 1.23±0.12 1.20±0.14
甘氨酸 400 μmol·L−1, 钨酸钠 100 μmol·L−1。Gly 400 μmol·L−1,
Tungstate 100 μmol·L−1.

施脯氨酸显著提高了重金属超富集植物龙葵幼苗对
Cd 胁迫的耐受性[3]。而甘氨酸在植物响应重金属胁
迫中的研究未见报道。本研究表明, 外源甘氨酸可显
著改善幼苗在 Cd 胁迫下的生长状况, 提高了其 NR
活性, 改善了幼苗的氮营养, 从而促进了幼苗生长。
重金属胁迫引起的次生胁迫主要是渗透胁迫和
氧化胁迫[7]。因此, 应答机制也就分为渗透调节和抗
氧化保护。渗透调节主要是维持细胞的水势平衡 ,
防止细胞过度失水。细胞内一些无机离子、有机小
分子溶质、氨基酸、小肽和蛋白质等, 都起到维持
细胞正常渗透压的功能。外源甘氨酸可被植株快速
吸收, 并在体内聚集, 起到维持细胞渗透压的作用。
重金属胁迫导致的活性氧爆发是抑制植物生长的另
一主要原因。植物受到氧化伤害时, 植物细胞中产
生大量抗氧化保护酶、修复蛋白和一些抗氧化分子
如谷胱甘肽, 对重金属胁迫造成的氧化伤害进行修
复和解毒。然而, 过量的重金属离子毒害抑制了细
胞内抗氧化酶的活性。活性氧迅速升高引起细胞的
膜伤害, 这主要是由于降低了膜的流动性, 以及膜
脂过氧化造成的功能丧失。细胞的膜脂过氧化伤害
程度可通过分析膜脂过氧化产物 MDA 的含量来评
价。Cd胁迫降低了苜蓿幼苗中 SOD和 CAT的活性,
第 5期 孙 弘等: 外源甘氨酸对镉胁迫下苜蓿幼苗生长和氧化损伤的影响 1025


加剧了植物细胞的膜脂过氧化, 使 MDA 含量迅速
升高。氧化胁迫引起细胞中不饱和脂肪酸含量降低,
膜刚性增加, 导致细胞膜的破裂和细胞死亡。采用
Evans blue 染色表明, Cd 胁迫加剧了根尖细胞的死
亡, 抑制了植物生长, 最终导致植株死亡。采用外源
甘氨酸处理 , 显著降低了幼苗 MDA 含量和根尖
Evans blue 染色程度, 说明甘氨酸处理提高了幼苗
的抗氧化能力。进一步研究发现, 甘氨酸处理提高
了幼苗 SOD和CAT活性, 说明外源甘氨酸是通过提
高抗氧化酶的活性, 增强细胞内的自由基清除水平,
从而降低细胞的氧化伤害。下一步我们将采用分子
遗传学手段, 分析外源甘氨酸调控幼苗内抗氧化酶
活性改变的途径。
氮代谢在植物生长发育中起重要作用, 它几乎
参与调控了植物生长发育的所有过程。Cd处理不但
影响了硝酸盐的吸收和运输, 还显著降低了幼苗中
与氮代谢有密切关系的两个关键酶 NR 和 GS 活性,
造成植株氮代谢的紊乱。在植物体内, Cd 胁迫增加
了蛋白酶的活性, 加快了细胞内氨基酸和蛋白质的
降解, 引起铵的累积[5,16]。Wang等[5]发现, 重金属超
富集植物龙葵具有更强的氮代谢水平, 使植物具有
更高的 Cd抗性和累积能力。植物体内的 NR可催化
NO3−还原成 NO2−, 这一反应需要 NADH 作为专一
性辅酶, 提供还原力。Woo 等[17]认为, 甘氨酸通过
在线粒体中的氧化脱羧, 为 NO3−还原提供了 NADH,
从而提高 NR活性。本研究表明, 甘氨酸处理提高了
Cd 胁迫下苜蓿幼苗中 NR 活性; 采用 NR 抑制剂钨
酸钠, 抵消了甘氨酸对Cd胁迫幼苗生长的缓解作用,
证明甘氨酸缓解 Cd 胁迫对幼苗生长的抑制作用与
NR途径相关。下一步我们还将继续分析 NR活性的
提高在缓解幼苗 Cd胁迫的详细分子机制。
参考文献
[1] 郎明林 , 张玉秀 , 柴团耀 . 植物重金属超富集机理研究进
展[J]. 西北植物学报, 2003, 23(11): 2021−2030
[2] Xu J, Zhang Y X, Wei W, et al. BjDHN conferred the heavy
metal tolerance in plant[J]. Molecular Biotechnology, 2008,
38(2): 91−98
[3] Xu J, Yin H X, Li X. Protective effects of proline against
cadmium toxicity in micropropagated hyperaccumulator, So-
lanum nigrum L.[J]. Plant Cell Reports, 2009, 28: 325−333
[4] Chaoui A, Ferjani E E. Effects of cadmium and copper on an-
tioxidant capacities, lignification and auxin degradation in
leaves of pea (Pisum sativum L.) seedlings[J]. C R Biologies,
2005, 328: 23−31
[5] Wang L, Zhou Q X, Ding L L, et al. Effect of cadmium toxic-
ity on nitrogen metabolism in leaves of Solanum nigrum L. as
a newly found cadmium hyperaccumulator[J]. Journal of
Hazardous Materials, 2008, 154: 818−825
[6] Xu J, Zhang Y X, Guan Z Q, et al. Expression and function of
two dehydrins under environmental stress in Brassica juncea
L.[J]. Molecular Breeding, 2008, 21(4): 431−438
[7] Salt D E, Prince R C, Baker A J M. Zinc ligands in metal hy-
peraccumulator Thlaspi caerulescens as determinend using
X-ray absorption spectroscopy[J]. Environ Sic Technol, 1999,
33: 713−717
[8] 高秀瑞 , 陈贵林 . 甘氨酸部分替代硝态氮对不结球白菜和
生菜生长及硝酸盐积累的影响 [J]. 河北农业大学学报 ,
2003, 26(1): 40−43
[9] 杨伟 , 毕建杰 , 陈振德 . 甘氨酸对黄瓜幼苗硝酸盐吸收还
原和硝态及氨态氮积累的影响(简报)[J]. 植物生理学通讯,
1991, 27(3): 186−188
[10] 陈振德, 彭涛. 甘氨酸对小麦幼苗 NO3−吸收和还原的影响
[J]. 上海农业学报, l99l, 7(2): 57−61
[11] Li B L, Mei H S. Relationship between oat leaf senescence
and activated oxygen metabolism[J]. Acta Phytophysiologica
Sinica, 1989, 15: 6−12
[12] Baker C J, Mock N M. An improved method for monitoring
cell death in cell suspension and leaf disc assays using Evans
blue[J]. Plant Cell Tiss Org, 1994, 39: 7−12
[13] 西北农业大学. 植物生理学实验指导[M]. 西安: 陕西科学
出版社, 1986: 35−44
[14] 王爱国, 罗广华, 绍从本, 等. 大豆种子超氧化物歧化酶的
研究[J]. 植物学报, 1983, 9(1): 77−84
[15] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京: 高等教
育出版社, 2000: 125−128
[16] Chaffei C, Gouia H, Ghorbel M H. Nitrogen metabolism in
tomato plants under cadmium stress[J]. J Plant Nutr, 2003, 26:
1617−1634
[17] Woo K C, Jokinen M, Canvin T. Reduction of nitrate via a
dicarboxylate shuttle in a reconstituted system of supernatant
and mitochondria from spinach 1eaves[J]. Plant Physio1,
1980, 65: 433−436