全 文 ：中国生态农业学报 2010年 1月 第 18卷 第 1期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Jan. 2010, 18(1): 94−97


* 国家科技支撑计划项目(2007BAD52B06、2006BAD04A04、2006BAD01A19)和农业部行业专项(nyhyzx07-022)资助
** 通讯作者: 师尚礼(1964~), 男, 教授, 博士生导师, 主要从事牧草种质资源方面的研究。E-mail: shishl@gsau.edu.cn
李剑峰(1979~), 男, 博士研究生, 主要从事牧草种质资源和微生物育种及制剂方面的研究。E-mail: ljfsmart@qq.com
收稿日期: 2009-01-30 接受日期: 2009-04-13
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.00094
不同 Ca3(PO4)2含量及菌种保存温度下 SL01
菌株的解磷及生长能力*
李剑峰 1,2 师尚礼**1,2 张淑卿 1,2
(1. 甘肃农业大学草业学院 兰州 730070;
2. 草业生态系统教育部重点实验室 中−美草地畜牧业可持续发展研究中心 兰州 730070)
摘 要 试验比较了不同保存温度和培养基 Ca3(PO4)2含量下解磷根瘤菌 SL01的生长和解磷能力。结果表明:
固体培养条件下, 增大 Ca3(PO4)2添加量能促进菌落生长, 8 g·L−1处理菌落直径(d)为 5 g·L−1、3 g·L−1、1 g·L−1
和 0.5 g·L−1处理的 116.9%、127.7%、130.1%和 132.7%。0~8 g·L−1的 Ca3(PO4)2含量范围内, 菌株的解磷能
力无显著差异, 故更适于以溶磷圈直径 D 与菌落直径 d 的比值 D/d 来衡量菌株在固态环境如土壤中的解磷能
力; 其菌液最适宜于 15 ℃下保存, 4 ℃次之。不同保存温度下菌种的解磷能力为−18 >℃ −10 >4℃ >15℃ >℃ 28
>35℃ ℃; 不同保存温度下 SL01菌株的菌落直径为 4 >15℃ >℃ −18 >28℃ >℃ −10 >35℃ ; ℃ 菌液在不同温度
下保存 60 d后的活菌含量为 15 >4℃ >28℃ >℃ −10 >35℃ ℃>−18 ℃。
关键词 解磷根瘤菌 解磷能力 生长能力 保存温度 菌落直径
中图分类号: S154.4; S812; S41 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)01-0094-04
Growth and phosphate-dissolving ability of strain SL01 under different
storage temperatures and calcium phosphate levels
LI Jian-Feng1,2, SHI Shang-Li1,2, ZHANG Shu-Qing1,2
(1. College of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Key Laboratory of Grassland
Ecosystem of Ministry of Education & Sino-US Center for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China)
Abstract The growth rate and phosphate-dissolving ability of phosphate-dissolving rhizobium SL01 in different calcium phosphate
[Ca3(PO4)2] content of substrate and storage temperatures were determined. Based on solid culture, the results indicate enhanced
colony growth with increasing levels of Ca3(PO4)2. Colony diameter of treatment with 8.0 g·L−1 Ca3(PO4)2 is respectively 16.9%,
27.7%, 30.1% and 32.7% higher than that of 5.0 g·L−1, 3.0 g·L−1, 1.0 g·L−1 and 0.5 g·L−1 Ca3(PO4)2 treatments. At Ca3(PO4)2 range
of 0~8.0 g·L−1, the phosphate-dissolving ability of the strain is not obviously different. It is therefore more suitable to use D/d
(phosphate-dissolving ring diameter to colony diameter) ratio in measuring phosphate-dissolving ability of strains in solid surround-
ing such as soil. Bacteria liquid is best preserved under 15 , followed by 4℃ .℃ Phosphate-dissolving ability of SL01 under different
storage temperatures is −18 >℃ −10 > 4℃ > 15℃ > 28℃ > 35℃ ℃. The order of SL01 colony diameter under different storage
temperatures is 4 > 15℃ > ℃ −18 > 28℃ > ℃ −10 > 35℃ ℃. Order of viable bacteria amount of strain preserved for 60 d under
different temperatures is 15 > 4℃ > 28℃ > ℃ −10 > 35℃ ℃ > −18 .℃
Key words Phosphate dissolving rhizobium, Phosphate-dissolving ability, Growth ability, Storage temperature, Colony diameter
(Received Jan. 30, 2009; accepted April 13, 2009)
磷是植物生长发育不可或缺的重要元素, 我国
大部分区域土壤平均含磷量约 1.2 mg·g−1, 但其在
土壤溶液中的浓度一般仅有 0.005~1.0 mg·kg−1, 难
以供植物直接吸收利用 [1], 而施入土壤的化学磷肥
利用率很低, 通常只有 5%~25%[2]。为此人们采用多
种方法以提高自然界磷素的利用效率 [3], 利用微生
物调节土壤难溶性无机磷向可溶性磷的转化[4]、增
加土壤中的微生物量磷[5]是其中最重要的途径。目
第 1期 李剑峰等: 不同 Ca3(PO4)2含量及菌种保存温度下 SL01菌株的解磷及生长能力 95


前, 对微生物参与难溶态磷素利用的研究多局限在
芽孢杆菌(Bacillus megaterium)[6]和真菌、放线菌等
方面, 而对涉及解磷菌菌种保存温度和解磷能力关
系间的研究尚鲜有报道。祁娟等[7]在苜蓿种子中分
离得到 1 株可溶无机磷并能分泌生长素的根瘤菌
SL01, 其溶解无机磷的能力较强, 有很大的利用价
值和开发潜力, 但解磷根瘤菌同其他微生物一样具
有基因变异性, 随着菌种保存条件的变化, 菌株性
能有所变异, 生长和溶解无机磷的能力降低[8]。本研
究比较分析了固体培养基磷酸钙添加量、继代周期和
保存温度对SL01菌株生长和溶解磷酸钙能力的影响,
为解磷根瘤菌菌种保存和菌剂研制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株为解磷苜蓿根瘤菌 SL01, 由甘肃农业
大学草业生态系统重点试验室提供。PKO 无机磷
培养基组分为葡萄糖 10 g, (NH4)2SO4 0.5 g, NaCl 0.2
g, KCl 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4 0.03 g,
FeSO4 0.003 g, 酵母膏 0.5 g, 琼脂 10 g, 蒸馏水
1 000 mL, pH=7.0, Ca3(PO4)2过筛并单独灭菌后与培
养基混合[9]。YMA 培养基[10]组分为 KH2PO4 0.5 g,
酵母粉 1.0 g, 甘露醇 10.0 g, MgSO4·7H2O 0.2 g,
NaCl 0.1 g, pH=6.8~7.2, 蒸馏水 1 000 mL, 固体培
养基加琼脂 15 g。
1.2 不同Ca3(PO4)2含量下 SL01菌株的生长能力和
解磷能力
以 PKO培养基为基础, 设 8 g·L−1、5 g·L−1、
3 g·L−1、1 g·L−1以及 0.5 g·L−1的 Ca3(PO4)2添加
量, 以及 1个 3 g·L−1 Ca3(PO4)2并添加溴麝香草酚
蓝指示剂(观察菌株的产酸状况)处理。将 4 ℃下
YMA斜面保存的菌种活化 2 h后转接到各处理固体
平板上, 每处理设 3 个重复, 培养 14 d 后测量菌落
直径 d 和解磷透明圈直径 D, 以 D/d 值衡量解磷能
力的强弱[11]。
1.3 不同继代转接周期下 SL01菌株的生长及解磷能力
将 4 ℃下保存的 SL01菌种活化 2 h后接 1环于
YMA液体培养基中, 28 ℃ 120 r·min−1培养至菌液
OD600nm吸光度值为 0.5 时开始进行处理: 将菌液分
别置于 28 ℃、18 ℃、4 ℃和−18 ℃培养, 每隔 5 d、
15 d和 30 d以 2%的接种量转接入新的 YMA液体培
养基, 再次培养至菌液吸光度值为 0.5 时将菌液重
新置于各处理温度下保存。累计处理 60 d时将各处
理菌株以接种针点接至 PKO 无机磷培养基, 培养
4 d后记录菌落直径 d及解磷透明圈直径 D, 每处理
4个重复。
1.4 SL01液体菌剂在不同温度下保存 60 d后的活
菌含量和菌株的生长及解磷能力
将活化的 SL01菌株于 YMA液体培养基上接种
1环, 28 ℃ 140 r·min−1培养 20 h, 将菌液 OD600nm吸
光度值用YMA液体培养基调为 0.5后分别置于 35 ℃、
28 ℃、15 ℃、4 ℃、−10 ℃、−18 ℃下静置保存,
60 d后以无菌水稀释 1×103倍, 取 0.2 mL均匀涂抹在
YMA 固体培养基上, 用平板计数法测定各处理活菌
含量。每处理 3个重复, 以 4 ℃保存的处理为对照。
再将平板计数得到的单菌落用接种针在 PKO 无机磷
培养基上点接, 培养 10 d后记录菌落直径 d和解磷透
明圈直径 D, 每处理 4个重复。
1.5 数据分析
使用 DPS 数据分析软件和 EXCEL 软件进行数
据分析。
2 结果与分析
2.1 磷酸钙含量对菌株生长及解磷能力的影响
由表 1可知, SL01在不同 Ca3(PO4)2含量的 PKO
培养基上培养 14 d 后, 各处理的 SL01 菌落直径与
Ca3(PO4)2 含量呈显著正相关(R2 = 0.81), 回归方程
为 y = 0.219 7x + 4.970 9。8 g·L−1 Ca3(PO4)2处理下
菌落平均直径 (d)最大 , 达到 6.9 mm, 分别为 5
g·L−1、3 g·L−1、1 g·L−1和 0.5 g·L−1处理的 116.9%、
127.7%、130.1%和 132.7%, 差异达显著水平(P<0.05);
3 g·L−1并添加溴麝香草酚蓝指示剂的处理菌落直径
最小, 平均直径 4.7 mm, 仅为 8 g·L−1、5 g·L−1处
理的 68.1%和 79.7%, 差异显著(P<0.05), 而其他处理
间差异不显著, 说明高 Ca3(PO4)2 含量对菌落生长有
促进作用。解磷透明圈和菌落直径的比值 D/d 在 3
g·L−1并添加指示剂处理下达 2.21, 分别为 8 g·L−1、
5 g·L−1处理的 151.4%和 134.8%, 显著高于其他所有
处理(P<0.05)。其他处理间差异均不显著, 说明培养
基 Ca3(PO4)2含量对菌株的解磷能力无明显影响。添

表 1 不同 Ca3(PO4)2含量对菌株生长及解磷能力的影响
Tab. 1 Influence of calcium phosphate content on the
ability of phosphate-dissolving and growth of isolate
SL01 in solid medium
Ca3(PO4)2含量
Calcium
phosphate
content (g·L−1)
菌落直径 d
Colony
diameter
(mm)
解磷透明圈直径 D
Phosphate-dissolving
ring diameter
(mm)
D/d
8 6.9±0.36a 10.1±0.16 1.46±0.13b
5 5.9±0.65ab 9.7±0.82 1.64±0.09b
3 5.4±0.25bc 8.9±0.37 1.65±0.04b
1 5.3±0.76bc 8.8±0.58 1.66±0.08b
0.5 5.2±0.75bc 8.9±0.71 1.72±0.04b
3+指示剂
Indicator
4.7±0.34c 10.4±0.21 2.21±0.09a
同列不同字母表示各处理之间差异显著(P<0.05, LSD 法), 下
同。Different letters in one column mean significant difference at
P<0.05 level by LSD. The same below.
96 中国生态农业学报 2010 第 18卷


加溴麝香草酚蓝指示剂的培养基上, 菌落生长受到
抑制, 而 D/d却显著高出其他各处理 28.5%~51.4%。
2.2 继代周期在不同保存温度下对菌株生长和解
磷能力的影响
由表 2 可知, 在液体 YMA 培养基上, 28 ℃、
18 ℃、4 ℃保存温度下各转接周期处理间的菌落直
径 d 和解磷透明圈与菌落直径的比值 D/d 差异不显
著, 而在−18 ℃保存温度下 15 d·次−1和 30 d·次−1
处理菌落直径最大, 达到 4.31 mm和 3.92 mm, 分别为
5 d·次−1的 135.1%和 122.8%; 而 D/d达到 1.67 和
1.73, 分别为 5 d·次−1的 103.1%和 106.8%, 差异均
达显著水平(P<0.05)。说明−18 ℃低温保存时, 减少
继代次数对于维持菌株的解磷能力和生长能力有促
进作用。就保存温度而言, 不同转接周期处理都呈
现随保存温度降低, 保存菌株的菌落直径和 D/d 逐
渐增大的趋势, 转接周期为 5 d、15 d和 30 d的处理
在−18 ℃下菌落直径分别为 28 ℃处理的 127.6%、
175.9%和 151.9%, D/d 为 28 ℃处理的 112.5%、
121.1%和 131.1%, 差异显著(P<0.05), 说明降低保存
温度对维持菌株的解磷能力和生长能力有积极作用。
2.3 不同保存温度对液体菌剂中活菌量、菌株生长
和解磷能力的影响
本研究测定了 6 个不同温度下 YMA 液体菌剂
保存 60 d后的活菌含量、菌株生长及解磷能力, 结
果表明, 活菌含量随保存温度的降低而呈单峰曲线
变化(表 3)。保存 60 d后, 15 ℃下活菌含量最高, 达
6.70×108 cfu· mL−1, 分别为 28 ℃、35 ℃、−10 ℃
和−18 ℃处理的 1.21×102、1.60×104、1.47×104 和
3.96×104 倍 ; 4 ℃处理的活菌含量次之 , 但也达到
2.98×108 cfu·mL−1, 显著高于除 15 ℃的所有处理
(P<0.05); −18 ℃处理活菌个数最低, 仅为 1.69×104
cfu·mL−1, 但与 35 ℃和−10 ℃处理差异不显著, 说
明就活菌含量而言, 4~15 ℃是液体菌剂保存的最佳
温度。35 ℃下菌株在保存过程中繁殖过快, 菌种退
化并大量死亡, −10 ℃处理由于缓慢结冰产生冰晶体
积较大, 对菌株造成严重伤害, 导致菌株生长活性降
低和大量菌体死亡。菌落直径随保存温度降低的变化
趋势和活菌含量一致, 15 ℃和4 ℃处理菌株产生的菌
落直径最大, 分别为 6.03 mm和 6.47 mm, 显著高于其
他处理(P<0.05), 而−10 ℃和 35 ℃处理菌株产生的菌
落直径最小, 仅分别为 4 ℃处理的 69.86%和 68.01%。
菌种的解磷能力与保存温度间呈明显负相关, D/d呈随
温度降低逐渐增大的趋势, 回归方程为 y = −1.391 7x
+ 21.325, 相关系数 R2= 0.969。−18 ℃处理 D/d高达
1.95, 显著高于 35~4 ℃各处理 10.16%~57.25%(P<
0.05), 表明低温保存有利于保持菌株的解磷活性。

表 2 转接周期及保存温度对菌株生长及解磷能力的影响
Tab. 2 Influence of subculture cycle under different storage temperature on the ability of phosphate-dissolving and
growth of isolate SL01 in liquid medium
转接周期
Subculture cycle (d·cycle−1)
保存温度
Storage temperature (℃)
菌落直径 (d)
Colony diameter
(mm)
溶磷圈直径 (D)
Phosphate-dissolving ring diameter
(mm)
D/d
28 2.50±0.37c 3.52±0.21 1.44±0.12b
18 2.73±0.09bc 3.81±0.15 1.41±0.17b
4 2.42±0.17c 3.63±0.08 1.51±0.04ab
5


−18 3.19±0.15b 5.16±0.32 1.62±0.13a
28 2.45±0.22c 3.35±0.19 1.38±0.21b
18 2.63±0.15bc 3.76±0.37 1.43±0.16b
4 2.67±0.24bc 4.06±0.13 1.54±0.09ab
15


−18 4.31±0.27a 7.21±0.33 1.67±0.05a
28 2.58±0.51c 3.39±0.53 1.32±0.11bc
18 2.60±0.65bc 3.61±0.37 1.39±0.09bc
4 2.85±0.31bc 4.51±0.49 1.60±0.12ab
30


−18 3.92±0.55a 6.74±0.73 1.73±0.10a

表 3 保存温度对液体菌剂中活菌含量、菌株生长及解磷能力的影响
Tab. 3 Influence of storage temperature on the viable bacteria number and ability of phosphate-dissolving and growth of isolate
SL01 in liquid medium
保存温度
Storage temperature (℃)
活菌含量
Viable bacteria number
(cfu·mL−1)
菌落直径 (d)
Colony diameter (mm)
溶磷圈直径 (D)
Phosphate-dissolving ring diameter
(mm)
D/d
35 (4.18±0.23)×104d 4.40±0.26c 5.50±0.29 1.24±0.18d
28 (5.55±0.57)×106c 4.65±0.15bc 6.86±0.35 1.47±0.05c
15 (6.70±0.36)×108a 6.03±0.21a 9.43±0.11 1.56±0.06c
4 (2.98±0.25)×108b 6.47±0.32a 11.43±0.40 1.77±0.03b
−10 (4.57±0.58)×104d 4.52±0.46c 8.30±0.44 1.86±0.04ab
−18 (1.69±0.28)×104d 4.69±0.12bc 9.01±0.41 1.95±0.04a
第 1期 李剑峰等: 不同 Ca3(PO4)2含量及菌种保存温度下 SL01菌株的解磷及生长能力 97


3 结论和讨论
3.1 无机磷含量对菌株生长和解磷能力的影响
本研究结果表明, 环境中的 Ca3(PO4)2能促进菌
落生长 , 与 Lukito[12]和来璐等 [13]的研究结果一致 ,
即土壤微生物量随无机磷盐含量(0~8 g·L−1范围内)
的增高而明显提高。溴麝香草酚蓝酸碱指示剂对
PKO 培养基上的菌落生长有抑制作用, 但能明显促
进其解磷能力。添加了指示剂的培养基上菌落变为
橙红色, 说明菌落通过分泌酸性物质使得周围的 pH
值降低, 从而溶解难溶性磷酸盐, 这与赵小蓉等的
研究结果一致[14]。菌落解磷透明圈与菌落直径的比
值 D/d与 Ca3(PO4)2含量间无显著相关, 说明 8 g·L−1
的添加量并未达到菌落解磷的极限, 在 0~8 g·L−1
Ca3(PO4)2 含量范围内, 菌株分解无机磷的作用在空
间上仅限于菌落周围一定的区域, 而区域范围与无
机磷含量并不相关。由于植物生长中, 根系寄生和
根际游离的根瘤菌所能达到的土壤范围有限, 因此
衡量根瘤菌的解磷能力更应该比较菌落在土壤中可
分解无机磷的空间范围。故以 D/d值作为促生菌株解
磷能力的衡量标准, 对于生产更具有实际指导意义。
3.2 保存温度和转接周期对液体菌剂 SL01 菌株活
菌数量及其生长和解磷能力的影响
本研究中, SL01 活菌含量与保存温度间呈典型
的单峰曲线相关, 15 ℃保存 60 d的菌株菌落生长速
度最快, 菌落直径最大。15~4 ℃下保存 60 d的菌株
菌落直径显著高于其他处理, 是最适的菌种保存温
度。保存于 35 ℃的菌种活力较差, 这可能是由于菌
株在高温下生活力下降所致。低于 4 ℃, 则使液体
菌剂中的菌种长期处于逆境胁迫状态, 液体菌剂在
0~−10 ℃下缓慢结冰, 会产生较大的冰晶破坏菌体
的膜结构, 导致解冻后菌株的生活力大幅下降, 菌
落直径仅为 4 ℃处理的 69.86%。−18 ℃低温下菌剂
迅速结冻, 形成的冰晶较小, 对菌体膜结构的损伤
较轻, 生活力较高, 菌种的菌落直径比−10 ℃处理
高 3.76%, 也可能是低温诱导菌株产生了更强的代
谢活性, 常温下产生更多的有机酸所致。温度高于
−18 ℃时 , 继代周期的长短与保存菌株的生长及
解磷特性能力并不密切, 而低于−18 ℃保存时 , 15
d·次−1 的转接周期对菌株的解磷和生长能力均有促
进, 这一现象可能与低温下菌株的代谢和繁殖有关。
保存 60 d的 YMA液体根瘤菌剂中的活菌含量
随保存温度的降低呈单峰曲线变化, 15~4 ℃处理的
活菌数最高, 达 6.70~2.98×108个·mL−1, 可作为以
获得大量活菌为目标的最佳保存温度。普通解磷菌[15]
和根瘤菌[16]的最适生长温度为 35 ℃和 30 ℃左右,
该温度下液体菌剂中的菌株迅速繁殖, 导致营养的
快速消耗和次生代谢物的积累, 最终表现为活菌数
急剧降低, 生活力和解磷能力明显下降, 本研究结
果与此结论一致, 故菌种应尽量避免高温保存; 菌
株的解磷能力随菌种保存温度的增高而减弱, 呈典
型的负相关(R2=0.969), −18 ℃保存的菌种 D/d值达
1.95, 显著高于 35~4 ℃各处理 10.16%~57.25%
(P<0.05), 说明低温保存能提高菌株的解磷能力, 高
温保存则导致该能力退化。
综上所述, 菌种的生长和解磷活性取决于两个
方面, 一是解磷底物的刺激, 二是菌种的退化程度。
难溶性磷作为解磷底物, 对于解磷菌株的生长有促
进作用, 其具体机理尚不明确, 需进一步研究。菌种
的退化程度与菌种保存的温度和营养条件密切相
关, 高温和能产生缓慢结冰的低温均会导致菌种的
退化。这一结论对于根瘤菌和解磷菌株的保存和应
用具有指导意义。SL01菌株对低温和高温的耐受性
好 , 经多次传代后解磷能力稳定 , 生长迅速 , 可用
于解磷根瘤菌剂的研制, 具有很大开发潜力。
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