全 文 ： [收稿日期] 2007-09-24
[基金项目] 石河子大学高层次人才科研启动资金专项(RCZX200614)
[作者简介] 魏小春(1983-),男 ,在读硕士 ,研究方向:蔬菜生理。 E-mail:jw eixiaochu n@126.com
通讯作者:郑 群(1968-),男 ,石河子大学副教授 ,博士 ,从事蔬菜生理生态研究。 E-m ail:zq1508@sina.com
[ 文章编号] 1001-3601(2008)01-0009-0031-06
豆科植物组织和细胞培养研究进展
魏小春 , 刘俊杰 , 马 萍 , 齐树森 , 郑 群
(新疆石河子大学 园艺系 , 新疆 石河子 832000)
[ 摘 要] 综述了豆科植物组织和细胞培养研究的状况 ,以及在组织培养 、花药和花粉培养 、胚和胚乳培养 、原生质体培
养 、细胞悬浮培养 、转化体系的建立等方面取得的进展 , 对豆科植物组织和细胞培养的发展趋势进行了总结。
[ 关键词] 豆科植物;组织培养;花粉和花药培养;胚和胚乳培养;原生质体培养;细胞悬浮培养;转化体系[ 中图分类号] Q949.751.9 [ 文献标识码] A
Recent Research Advances of Tissue and Cell Culture in Legume
WEI Xiaochun , LIU Junjie , MA Ping , QI Shuseng , ZHENG Qun
(Horticultural Department , Shihezi University , Shihezi , Xinj iang 832000 , China)
Abstract:The pape r reviews the research situation in legume tissue and cell culture and resear ch advance s in tissue
culture , anther and pollen cultur e , embryo and endo sperm culture , protoplast cultur e , cell culture and establishment o f
transforma tion system and summarizes the development trend of legume tissue and cell culture.
Key words:legume;tissue culture;anther and po llen cultur e;embryo and endospe rm culture;pro toplast culture;cell
culture;t ransfo rmation sy stem
豆科植物约有 650 属 , 18 000种 ,广布全世界 。
在分类上 ,豆科植物位于菊科植物之后 ,为被子植物
的第二大科。豆科植物有许多重要的经济植物 ,如
豆类作物 、蔬菜 、饲草 、绿肥 、药用植物 、绿化观赏 、染
料 、树胶及树脂及材用树种等 ,另外还有一些农田杂
草 ,是农林牧业生产上很重要的一个科 。19世纪 30
年代 ,德国植物学家施莱登和动物学家施旺创立了
细胞学说 ,在此基础上 ,1902年 ,德国植物学家哈伯
兰特(Haberlandt)提出了细胞全能性的理论 ,即离
体的植物细胞具有发育上的全能性 ,在适合的条件
下能够发育成为完整的植株。这一理论为植物组织
培养的提出与发展提供了理论基础 。植物组织和细
胞培养学科的建立和发展 ,对植物科学的各个领域 ,
如细胞学 、胚胎学 、遗传学 、生理学 、生物化学 、植物
病理学 、发育生物学等学科的发展均有很大的促进
作用 ,并在科学研究和生产应用上开辟了令人振奋
的多个新领域。近年来发展很快 ,广泛应用于植物
的快速繁殖 、植物品种改良 、基因工程育种 、种质资
源保存 、次生代谢产物生产等方面 ,对现代农业和医
药等领域产生了深刻影响 。运用组织培养方法可以
在比较简单易观察的条件下研究细胞 、组织或器官
的繁殖 、生长和分化 ,以及各种外界因素对它们的影
响 ,从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题
开辟了广阔的前景 ,目前已有若干重要成果应用于
生产实践中。笔者通过对近 30 年来豆科植物组织
和细胞培养研究进展的概括 ,为教学科研提供一些
参考 。
1 豆科植物组织培养
利用植物茎尖培养 ,使感染病毒的植株重新获
得无病害的植株;通过组织培养中的器官和胚胎培
养的大量研究 ,在实践上已经用于加速植物的无性
繁殖。
1.1 大豆组织培养
大豆组织培养开始较晚 ,但进展很快。中国科
学院植物研究所与黑龙江省农业科学院合作由栽培
大豆胚轴获得再生幼苗 。吉林省农业科学院研究人
员从大豆下胚轴培养出再生植株 。陈云昭等通过大
豆组织培养从栽培大豆上胚轴小真叶获得再生植
株 。蒋兴屯等离体培养野生大豆的下胚轴和子叶 ,
经愈伤组织产生再生植株。杨振棠等通过培养大豆
复叶 ,诱导出愈伤组织 ,并分化出再生植株 。国外大
豆组织培养或再生植株的最早记载是 Osw ald[ 1] ,他
使用的外植体是栽培大豆种子芽 。Evans培养栽培
大豆子叶腋芽 ,形成丛苗。而 Kameya 等通过对 7
个种的大豆下胚轴进行培养后发现 , 仅从 G.
canesens和G.tamentel la两种多年生野生大豆中获
得再生植株 。Kim[ 2]等通过大豆子叶节中的分生组
织的增殖获得了再生植株 。Barw ale[ 3] 等用未成熟
种子的子叶 ,Wright[ 4] 等用大豆子叶节 、上胚轴和初
生叶通过大豆不定芽器官再生途径获得再生植株。
Gissler等利用不同因素对大豆未成熟子叶组织体
细胞胚的发生进行处理 ,从多种体细胞胚发生途径
得到了可驯化并具有大量荚和种子的可育植株。
Bailey[ 5]等测定了基因型对诱导和保存大豆增殖性
贵州农业科学 2008 , 36(1):31 ～ 36 Guizhou Ag ricultural Science s
胚性愈伤和产量 、萌发及向成熟体细胞胚转化的影
响。N adolska[ 6] 等成功地培养出不同育种系的大豆
子叶体细胞胚发生。Santarem[ 7] 等描述了大豆几个
栽培种未成熟子叶快速发生大量体细胞胚的改良方
法。Komatsuda[ 8] 等 , Jia Li等等进行了大豆体细胞
发生途径再生的基因型筛选工作 ,大部分都获得了
再生植株 。
1.2 花生组织培养
花生的组织培养工作起步较晚 。自 20世纪 50
年代末期 ,Stew ard等培养花生韧皮组织开始 ,花生
组织培养至今已有 50年的历史 , Heat ley 等 、Chen
等及梁连登等分别报道了茎尖培养获得再生小植
株。Pit tman等和 Kerry 等分别研究了花生叶片不
定芽的发生过程及其影响因子 。不少学者(Venkat-
achalam 等;李爱民等;Bhat ia 等等)利用胚轴和子
叶切段进行不定芽的培养 ,指出不同外植体来源对
花生离体培养芽分化影响很大。Sast ri等和 Ihson
等分别从子叶和胚的愈伤组织诱导产生出芽体。瞿
桢等报道了未成熟胚丛生芽和植株再生 。张书标等
用花生幼苗叶节为外植体 ,诱导产生大量的丛生芽 。
Sellar s等以未成熟胚为外植体 ,诱导出体细胞胚 。
Bansal等诱导出少量的花粉胚 ,但未能获得再生植
株。Baker[ 9]等离体培养幼叶产生体细胞胚 ,指出不
同大小叶片切段对体细胞胚的诱导率有明显影响;
并研究了不同激素类型对花生未成熟子叶体细胞胚
形成的影响 ,认为 2 , 4-D对体细胞胚的形成效果优
于 NAA 。也有学者认为 ,NAA 对花生体细胞胚的
诱导无效(Hazra 等)。George[ 10] 等报道了基因型
和外植体来源对体细胞胚形成的影响 ,结果认为 ,外
植体的基因型和外植体的来源对体细胞胚的形成影
响很大 ,未成熟胚轴是诱导产生体细胞胚的很好材
料 ,未成熟子叶的感应率和每个外植体产生的体细
胞胚平均数很低 。
1.3 苜蓿组织培养
Saunders
[ 11]等首先从苜蓿愈伤组织上获得了
再生植株 ,其它一些种的苜蓿也通过培养细胞和组
织获得了再生植株。 Johnson等和 Kao 等利用苜蓿
幼芽获得原生质体形成体细胞胚产生植株 。Xu 用
苜蓿根尖细胞原生质体得到再生植株 。Navak 和
Konecna 用叶柄诱导形成体细胞并分化出植株。李
聪等用苜蓿子叶接种 ,何茂泰等利用野生黄花苜蓿
的花药分化出完整植株 。Finstad[ 12] 等鉴定了苜蓿
叶柄衍生的愈伤培养物在体细胞胚发生的感受期 ,
结果表明其存在一种天然的感受性 ,而一些植物生
长素(2 ,4-D)可触发诱导 。Lai等在苜蓿体细胞胚
成熟过程中增加营养能够提高籽苗的活力。Ka-
mp
[ 13]等通过改善苜蓿酸铝耐受性的生物技术得到
了用于胚发生诱导的大量健壮愈伤。 Lecouteux 等
进行了提高苜蓿干燥体细胞胚籽苗活力的尝试 。
Senaratna等发现 ,紫苜蓿种衣抑制体细胞胚早熟萌
发 ,并缺少耐干性。Marí a 等培养出天蓝苜蓿再生
植株。时永杰等对苜蓿子叶 、下胚轴 、茎 、花茎 、叶 、
花序 、子房 、花药等进行离体培养 ,诱导分化成苗 。
1.4 蚕豆组织培养
国外蚕豆组培研究始于 20世纪 70 ～ 80年代 ,
研究者认为茎尖 、上胚轴 、茎基节作外植体 ,在适宜
的培养条件下 ,诱芽和生根的效果较好 ,继代多次仍
然保持旺盛的芽分化能力。 Jejkloua , Thgan ,
Sag rgh等 ,在黑暗条件下发芽 14 d成苗的子叶节和
茎基节为外植体培养得到的再生苗 ,后代性状与其
原始群体种子繁殖的后代表现一致。Griga[ 14] 等以
合子胚 、茎尖为外植体进行培养 ,获得了开花的再生
植株。Sayegh以茎尖 、茎基节为外植体 ,培养 1周
后出现芽 ,生根培养 3 周后生根率 55%,第 5周达
73%。在国内 ,20世纪 80年代初 ,上海农学院黄德
俐等采用秋蚕豆品种三白豆和田鸡青的下胚轴 、子
叶和去子叶胚为外植体 ,经过培养获得了愈伤组织
和 11个绿苗;同期西南农业大学徐正华等报道 ,利
用四川成胡 10号蚕豆品种的上胚轴或下胚轴作外
植体 ,经培养直接获得蚕豆绿苗 5株 。
1.5 其它豆科植物组织培养
Villareal等培养出了含羞草属 Mimosa tenui-
f lora 愈伤组织。Arrillaga 等从幼嫩洋槐外植体子
叶 、叶片直接诱导出不定芽 ,并经过驯化可以成株。
李伟[ 15]等分别用山槐腋芽 、胚轴和子叶得到小植
株 ,成活率为 77.6%。Sankhla[ 16] 等比较了利用赤
霉素生物合成抑制剂对合欢的外植体再生苗的影响
后 ,得出了赤霉素状态(生物合成抑制剂或赤霉素)
对产苗数起着重要作用。Sinha 等研究了利用γ-辐
射对木田菁离体愈伤生长和再生的影响 ,得出低剂
量辐射后再生的苗能成功地发根并形成完整的小植
株 。Zhao 等诱导 4种田菁属植物的根 、下胚轴和子
叶而再生成苗。White等从白车轴草子叶大量直接
获得再生植株 ,并经过炼苗后 ,再生植株可正常开花
结籽。Ganapathi等通过建立苗尖培养物得到丛生
苗 ,经包囊后所有的苗都可发育 ,因此 ,包囊的苗尖
可能用做人工种子 。Marsh 等诱导黎豆和木豆的子
叶节 、子叶和叶形成愈伤组织 ,并发根成苗 。Malik
等直接从山黧豆属种子培养物中诱导出高频器官发
生和整个植株再生 。Thatikunta等利用无菌木豆 3
周龄叶外植体形成了苗芽 。Barna 等将未成熟的鹰
嘴豆小叶和子叶经体细胞胚胎发生后再生成植株。
Sagare等通过诱导鹰嘴豆未成熟子叶和未成熟胚
轴体细胞胚形成再生植株 。Yamada[ 17] 等筛选出能
形成许多拟分生组织的白车轴草愈伤培养系 ,经玻
璃化作用冷冻保存分生组织愈伤 ,并再生成株 ,植株
再生率达 90%。Griga[ 18] 等通过对愈伤培养 、器官
发生和体细胞胚胎发生而形成的豌豆的农学价值分
析 ,得出:与非组培植株相比 ,品质和数量性状改变
并不大。Hardy 等用南美羽扇豆的无菌种子进行微
·32· 贵 州 农 业 科 学 2008 , 36 卷
繁殖成功 ,并发现了发根率与苗伸长程度的相关性 。
罗吉凤等[ 19] 利用贵重经济林木刺云实种子苗的茎
尖 、叶 、茎 、子叶 、下胚轴和根等各切段培养出了再生
植株 。梁玉玲等[ 20] 研究了胀果甘草愈伤组织的培
养 ,Kovalenko等建立了光果甘草毛状根培养体系 。
而对乌拉尔甘草的研究较少 ,仅有裴雁曦等研究了
植物生长调节剂对甘草愈伤组织诱导的影响 。邓百
万等[ 21] 对鹰嘴紫云英 、苜蓿 、红豆草 、甘肃棘豆 、红
三叶草 、白三叶草 、胡卢巴和扁蓿豆等 6种豆科植物
进行组织培养诱导成功。孙爱新[ 22] 、赵杨等[ 23]也对
新型的工业胶种子瓜尔豆的愈伤组织培养进行了研
究。郭连钢等[ 24] 通过对内蒙古自治区野生豆科锦
鸡儿属植物-柠条的组织培养 ,从未成熟胚上诱导形
成愈伤组织和芽 ,或诱导产生小植株。
豇豆类蔬菜通常存在抗逆性较差 、组织再生能
力弱 、人工组织培养难度较大等问题 ,所以有关豇豆
组织培养的研究报道较少 。Al-Khayri等利用豇豆
栽培种 Coronet离体萌发籽苗苗尖再生成苗。
2 豆科植物胚和胚乳培养
利用胚培养技术获得不育胚的植株 ,其目的是
使幼胚不经正常的种子发育 、萌发的过程而在离体
条件下发育成小苗 ,从而克服胚败育现象。利用胚
胎培养技术能够克服杂种不育 ,利用胚珠或子房培
养可以进行试管授粉。而作为三倍体的胚乳的培
养 ,在经济上更有其重要价值 。
1983年 ,Christianson等从一个遗传型的未成
熟胚培养获得再生植株 。在一些其他的研究中 ,获
得了体细胞胚 ,但进展到鱼雷期就终止发育 。Lipp-
mann等报道了大豆未成熟胚的体细胞胚胎发生 。
Barw ale等通过大豆幼胚培养 ,经体细胞胚胎发生
或器官发生 ,高频率地再生植株 ,几乎所有被试基因
型都能成功。Baker , Eapen等从花生成熟胚成功地
诱导出体细胞胚。 Lecouteux 等利用脱落酸 、蔗糖
的低温胁迫使苜蓿体细胞胚成熟 ,胚的质量与其总
的蛋白含量相关 ,并讨论了与人造种子相关的胚的
质量 。Tian等对长日光周期适应性中国大豆体细
胞胚发生作用的离体反应及谱系分析后得出 ,子叶
反应率为 18%～ 98%,反应型依赖于表型。Beat-
tie[ 25] 等诱导白三叶草未成熟胚产生不定芽 ,成苗率
77%。Chengal rayan 等培养花生成熟胚至体外开
花。Feng 等建立了用于营救种间杂种胚的技术 。
S agare 等详细的阐述了体细胞胚发生 ,组织研究证
实与愈伤期交错 ,从未成熟子叶和未成熟胚轴间接
产生体细胞胚 ,从成熟胚轴则直接产生体细胞胚 。
Williams用看护胚乳拯救杂种胚的方法获得了白三
叶草离体再生株 。Delautour 等用看护胚乳技术拯
救四倍体狭叶百脉根×百脉根杂种 ,由于胚已充分
成熟 ,不需要胚乳移植 ,杂种部分可育。狭叶×巨型
百脉根杂种 ,利用看护胚乳培养心形和鱼雷形胚成
功 。
3 豆科植物的花药与花粉培养
花药培养成功 ,一方面可以作为单倍体育种的
有效技术 ,另一方面对于认识植物细胞的全能性和
控制花粉的发育途径有重要的理论意义。通过花药
培养技术进行单培体的研究 ,已经取得惊人的进展。
早在 20 世纪 50 年代初期 , Tulecke 首先成功
地培养了几种裸子植物的成熟花粉粒 ,并观察到一
些花粉能够不按正常发育过程而形成愈伤组织 。他
还用被子植物进行了实验 ,但失败了。Nitsch关于
离体果实培养的工作 ,促进了对植物的幼小果实 、子
房 、胚珠 、种子 、胚胎及花部各器官的培养研究。
1963年 , Yamada等首先报道由紫露草属植物的花
药培养中分离得到了单倍体组织 。值得特别提出的
是 Guha 和 Maheshw ari将毛叶曼佗罗的成熟花药
培养在适当的培养基上 ,从药室中长出了胚状体 ,并
进一步确证了这些胚状体起源于花粉 ,并从胚状体
获得了单倍体植株 。这一研究结果使细胞全能性学
说得到了广泛的证实 ,也给高等植物的突变体和遗
传育种开辟了新的研究途径。我国科学工作者从
1970年才开始该项研究 。而豆科植物的花药培养
研究工作较少 ,成功的例子不多;徐速等获得苜蓿单
倍体植株。
大豆花药培养最早是由 Ivers[ 26] 等人开展起来
的 ,通过大豆花药培养 ,从药隔组织形成愈伤组织 ,
并形成类苗器官 ,只获得了二倍体愈伤组织 。母秋
华等从大豆花药培养中得到愈伤组织 ,但没有证明
这些愈伤组织是否来源于花粉。1979年 ,黑龙江省
农业科学院获得了大豆花粉植株 。简玉瑜等通过花
药培养获得了芽状物 ,并逐渐愈伤组织化 。尹光初
等用花药培养的方法 ,获得了花粉愈伤组织 ,进而分
化出完整的花粉植株。刘德璞等进行了大豆花粉培
养 ,观察到大豆花粉的分裂 ,并获得了大豆花粉愈伤
组织。Kadlec等获得了愈伤 、胚状体类似物;叶兴
国等人通过变动氨态氮和硝态氮比例 ,增加有机氮
等方法分化了一个根 、芽齐全的小植株 。由于大豆
花药培养的难度大 ,再生植株困难 , 40 多年来的进
展一直很缓慢 。Vijay 等培养木豆花药诱导胚胎发
生 ,并进一步发育成完整小植株 。Zago rska等在用
低温和低剂量γ射线处理后得到苜蓿单雄生殖苗。
何茂泰等从野生黄花苜蓿 、赵桂兰等从大豆花药 、苟
克俭等从甘草花药 、曾银位等[ 27]和李俊宽等[ 28] 从花
生花药中也都获得再生植株 。
4 豆科植物细胞悬浮培养
悬浮细胞培养增殖速度快 ,能提供大量的均匀
的植物细胞 。在生产药物或其它有用的天然产物等
方面 ,有些已初见效果 。
20世纪 40年代末到 50年代初 ,由于在植物生
·33· 第 1 期 魏小春 等 豆科植物组织和细胞培养研究进展
理及实验形态研究方面产生了许多问题 ,使植物组
织培养的研究进入了一个新的活跃时期 。Skoog 和
崔徵在烟草茎切断和髓培养以及器官形成的研究中
发现腺嘌呤或腺苷是可以解除培养基中生长素对芽
形成的主要条件之一 。经过 Stew ard等人对胡萝卜
根外植体的培养 ,于 1958年他们在悬浮培养中成功
地诱导形成了胚状体 。1959 年 , Melchers 和 Berq-
mann培养了金鱼草单倍体苗的组织。在几次继代
培养中能保持单倍体状态 ,但以后倍性则增加 。单
倍体组织培养或悬浮培养对于研究突变具有特别的
意义 。Stew ard 等的工作及 Skoog 等的研究 ,为组
织培养中的器官形成和胚胎发生的研究奠定了基
础 ,使早年提出的细胞全能性假说 ,得到了科学的证
实。20世纪 50年代 ,组培技术又有了较大的发展 。
使悬浮培养细胞可以通过继代培养进行繁殖 。
Muir提出的“看护培养”以及 Berqmann 的琼脂平
板培养法 ,使获得单细胞无性系的一些技术得到发
展。根据 Tamaki的研究 ,甘草属的欧亚甘草(Gly-
cy rrhiza glabra)的悬浮培养物能合成不少甘草甜
素(占干重的 3%～ 4%);并且以培养物的提取液处
理纸烟草的烟叶要比甘草根处理的烟草要香 。经研
究证明 ,在日本用作轻泻剂的决明(Cassia tora)其
愈伤组织培养物中所含的醌类 ,诸如大黄酚 、大黄素
和大黄素甲醚(占干重约 6%)比整株种子的含量多
10倍以上。张根发[ 29] 等利用光棘豆悬浮细胞原生
质体及草木樨状黄芪单细胞培养出再生植株 。刘淑
兰等利用苜蓿无菌苗的子叶 、下胚轴悬浮培养后诱
导出胚状体并得到再生植株。张春荣等[ 30 , 31] 利用
激素处理野葛细胞悬浮培养 ,更进一步的研究了葛
根素合成的影响因素以及工业化方式。
5 豆科植物原生质体培养
通过对原生质体融合的研究 ,已获得体细胞杂
种植物。诱导原生质体融合 ,进行细胞杂交 ,可能是
克服远缘杂交中某些障碍的重要手段。
Cooking[ 32] 等开始用真菌的纤维素酶来分离植
物的原生质体并获得成功 。现已可由多种植物的不
同组织得到原生质体 ,这种分离的原生质体可重新
长壁 ,并进行分裂 ,在一些材料中形成细胞团 。因
此 ,原生质体培养已成为遗传工程研究的好材料 。
原生质体融合的研究中 ,通过 PEG 、高 Ca 、高 pH 、
NaNO 3等方法 ,已在多种植物原生质体之间看到融
合。这无疑会给高等植物的遗传育种带来深远的影
响。
豆科植物在国民经济生活中占重要位置 。
New ell和 Hammat t首先在多年生野生大豆(G.ca-
nescens ,G.clandestina)原生质体培养上获得成功 。
1980年高国楠等人首先从豆科植物苜蓿的叶片中
分离和培养叶肉原生质体 ,并通过胚状体再生植株
获得成功 ,大豆 、豌豆 、赤豆等也相继获得由原生质
培养的植株 。许智宏等用根尖为材料 ,李学宝等人
以未成熟子叶为材料经原生质体培养获得植株 。继
而卫志明 、许智宏[ 33] 等用栽培大豆未成熟种子的子
叶分离原生质体经培养得到了再生植株。Wang 等
通过水稻和大豆 、苜蓿以及百脉根的原生质体融合
得到杂种愈伤。张谦等通过研究挨斯基红豆草下胚
轴愈伤组织原生质体的培养 ,得到的苗分化出根并
得到再生植株。Brandt[ 34] 等利用鹰嘴豆顶端分生
组织和子叶离体再生成正常植株并能开花结籽。
Mallikarjuna 等很好的利用了胚胎拯救来进行木豆
野生种和栽培种的杂交 。Zhao 等分离出田菁子叶
原生质体 ,并诱导分化成苗 ,苗繁殖率 58%,生根率
100%。Rose[ 35] 等通过苜蓿原生质体培养得到具有
卡那霉素抗性愈伤组织诱导成的植株 。Ves-
sabutr[ 36]等开发了快速繁殖百脉根原生质体的方
法 。Li等开发了一种花生原生质体融合和植株繁
殖的方法。Selvi等研究了绿豆的离体繁殖(叶 、下
胚轴和种子)以及原生质体培养(叶肉和下胚轴细
胞)。Zafar[ 37] 等通过苜蓿外植体(子叶 、下胚轴和
根)和原生质体(无菌苗叶片)诱导愈伤组织再生成
植株。以往为豌豆建立的原生质体再生体系不适用
于转化 ,Petra报道了一种将高再生率同高转化能力
结合在一起的 ,通过器官发生的豌豆原生质体再生
系统。而大豆(周蓉等;卫志明等;张贤泽等;肖文
言[ 3 8])、天蓝苜蓿(张相歧[ 39] 等)、日本小豆(T akashi
等)、花生(周蓉等)、决明(周延清等)、蚕豆(卫志明
等)、野生大豆(卫志明)、红豆草(罗希明等)、苜蓿和
百脉根的原生质体培养也相继有人报道 。李德红
等[ 4 0] 以黄化绿豆幼苗下胚轴原生质体为材料 ,探讨
了钙信使在激动素诱导原生质体体积变化中的作
用 。
6 豆科植物转化体系的建立
外源基因导入大豆 ,首例报道见于 1984年 。而
转基因大豆植株诞生于 1988 年 ,由 Monsato 公司
报道 ,这是遗传工程应用于大豆改良上的一个里程
碑 。此后 ,Mccabe等利用基因枪转化大豆未成熟胚
的生长点 , Christou 等利用基因枪转化大豆茎尖;
Finge r等用 Biolistics 基因枪转化胚性悬浮细胞;
Sato等用 Bio listics基因枪转化未成熟胚茎尖及分
裂的大豆悬浮细胞培养物;Remande 等建立了向日
葵和大豆的转化和再生系统 ,从而开发了将胚珠导
入技术应用与大豆的再生系统;Baker 等建立了可
重复 、高效的用于大豆转化研究的繁殖系统。S tew-
art 等利用基因枪转化大豆体细胞胚均获得成功。
在国内 ,卫志明等用 PEG 法 ,将外源基因导入到大
豆的原生质体中获得了 27棵转基因植株 ,其转化效
率达到了 0.6%,这是通过原生质体途径转化大豆
外源基因的首例报导 。燕飞等[ 41] 利用发根农杆菌
转化胀果甘草的研究 ,为规模性培养胀果甘草的有
·34· 贵 州 农 业 科 学 2008 , 36 卷
效成分提供数据基础。张振霞等[ 42] 对豆科牧草苜
蓿 、百脉根和三叶草的基因工程进行了研究综述 ,总
结了通过基因工程技术对豆科牧草进行改良和培
育。由于豆科植物蒺藜苜蓿的基因组较小 ,二倍体 ,
遗传学简单 ,遗传转化相对容易 ,再生时间较短 ,因
此成为豆科重要的模式植物之一[ 43 , 44] 。刘艳芝
等[ 45]以豆科植物百脉根子叶为转化受体 ,通过根癌
农杆菌介导方法将外源目的基因 Bar 基因和 Gus
基因导入 ,经筛选分化 、再生 ,得到具有 Basta 抗性
的转基因植株。俞金蓉等[ 46] 对紫花苜蓿的生物技
术研究进行了详细的总结 ,从组织培养 、遗传转化 、
分子杂交 、分子标记等方面阐述了国内外的研究现
状及发展趋势。韦正乙等[ 47] 以 Bar 基因为标记基
因 ,以从酵母中克隆的耐盐基因 HAL1 为目的基
因 ,构建了植物表达载体 pCHAL1 。以子叶为外植
体 ,用农杆菌介导法转化豆科植物百脉根。抗性再
生苗经 PCR 方法鉴定 , HAL1 基因阳性率为
46.7%。初步证明 , HA L1基因已整合到百脉根基
因组中 ,且转基因植株的表型正常 。
7 展望
豆科植物植株再生相当困难。近年来 ,植物组
织和细胞培养技术迅猛发展 ,其应用价值也日益提
高。叶用豆类 ,如三寸草比籽用豆科植物更加容易
在离体培养中再生。与其它科的植物不同 ,少数再
生的豆科植物可能是由于植物激素的作用。对于籽
用豆类难以再生植株 。一般要降低生长素浓度或提
高细胞分裂素浓度。组织培养中植物发育的深入研
究 ,重新肯定了器官建成和体细胞胚胎发生的基本
模式 ,和促进其形成的因子 ,以及增进了对其固有复
杂性的了解。
未来的重点应放在及时设计从长期培养物再生
植株的系统。高等植物的遗传工程将依赖从单个细
胞 ,比如原生质体再生植株的能力 ,因此 ,以后的研
究应强调建立和保持细胞培养物染色体的稳定性 。
这又有可能扩大从细胞培养物再生的作物种类。从
细胞培养的再生植株是一个可供利用的遗传变异的
新来源。只有当可从细胞培养有效地再生植株时 ,
这种体细胞发生的变异才能成为有用的变异源。没
有重要农作物的恒定再生 ,植物细胞培养在农业上
的应用将是有限的 。细胞培养中能够产生体细胞
胚 ,使得那些较难通过器官发生途径再生植株的植
物有了新的途径 。在诱导休眠 、人造种子 、冷贮藏 、
干燥贮藏 、降温保存等几个方面可有效地利用体细
胞胚 。
尽管已经取得一些较大的成就 ,豆科植物原生
质体培养仍有困难。无疑试管繁殖技术将成为未来
森林 、绿化树种和水果类植物理想基因型的无性繁
殖方法。我们相信对于未来在这个领域所蕴藏的潜
力将是无穷无尽的。单倍体在加速育成品种方面具
有尤其重要的作用 。尽管取得了相当大的进展 ,至
今主要困难是 ,不同作物植株的花粉培养所产生的
单倍体的频率低 。因而 ,应研究内外因素对雄核发
育的影响 ,一种理想的体系是离体花粉和它们的原
生质体的直接培养 。这不但能大规模生产单倍体和
纯合植株 ,而且会促进诱导期突变 、转化和生化遗传
的研究 。利用单倍体培养物的突变能产生抗病 、抗
旱 、抗虫的高产植株 。体细胞杂种群体比常规有性
杂种有更大变异。早已在体细胞杂种植株的群体内
建立了一个已观察到的广泛的染色体数目 ,它导致
种间核 DNA 的均一混合物。另外 ,广泛的均一核
质组合已随原生质体融合产生了 。不亲和杂交中 ,
有生活力胚数随胚年龄而减少。培养早期胚发育是
有益的 。植物对人工培养的反应是受遗传控制的。
这种能力似乎可整合任何基因型 。其遗传模式类似
“修饰基因” 。胚研究新方向应是鉴别不同作物的
“高反应”基因型 ,或经杂交和选择创造新基因型 ,用
此作为转移“人工培养可培养性”特征转移给商品栽
培品种 ,以利于将来遗传改良 ,并列入种子资源库备
用 。
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(责任编辑:高红卫)
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