全 文 ：景天科植物基因组 DNA的高效提取方法
赵为 ,邓科君 ,杨足君＊ ,周建平 ,任正隆　(电子科技大学生命科学与技术学院 ,四川成都 610054)
摘要　采用CTAB 法 ,低浓度的乙醇与NaCl沉淀DNA ,再用正丁醇进一步萃取多糖 ,建立了景天科特种植物的DNA提取方法 ,获得的
DNA经琼脂糖电泳和紫外分析仪检测 ,浓度和质量均较高。用线粒体 nad7基因的特异引物对该法提取的大花红景天DNA进行扩增 ,获
得了长为 791bp片段的目标序列。结果表明:该法有利于去除景天科植物材料中多糖、多酚类和 RNA等物质 ,获得的高质量基因组DNA
完全可以满足各种分子生物学研究的要求。
关键词　景天科植物;DNA提取;Nad7基因
中图分类号　Q781　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2006)22-5804-02
An Effective Method of DNA Extraction from Crassulaceae Plant
ZHAO Wei et al　(College of Life Science and Technology , University of Electronic Science and Technology , Chengdu , Sichuan 610054)
Abstract　An effectivemethod for extracting DNA from special crassulaceae plants was constructed by basic CTAB method followed by low concentrated
ethanol and NaCl , as well as the amylose removed by butanol.High concentration and good purity DNA was obtained after measured by UV spectropho-
tometer and agarose ge1 electrophoresis.A PCRamplification by mitochondrial Nad7 gene conserved primer pairwas carried out using the isolated Rhodiola
crenulate DNA and a target 791 bp band was produced.The results indicated that the present DNA isolation method was efficient to remove the polyphe-
nol , amylase and RNA contamination , and generate a high quality genomic DNA , which would meet the needs of the following molecular biological analy-
sis.
Key words　Crassulaceae;DNA extraction;Nad7 gene
　　核酸是构成生物体中基本遗传物质的主要化合物。从
核酸分子水平系统 、深入地研究是认识各种生命现象的基
础 ,而提取出高质量的DNA 是开展这些研究的前提。目前
对动物 、植物和微生物的DNA提取研究相当多 ,但是由于物
种之间的差异 ,DNA提取方法各有不同[ 1-5] 。特别是对于一
些次生代谢产物含量高的特异遗传资源 ,较难获得高质量
DNA已成为其开展分子水平研究的限制因素 。
景天科植物为双子叶植物 , 35属 , 1 600种 ,广泛分布于
全球 ,主产地为南非 。我国约有景天科植物 10属 ,247种 ,全
国各地都有分布[ 6] 。景天科植物是多年生的肉质植物 ,外形
美观 ,大量作为观赏植物;同时 ,也有部分植物作为药用植
物 ,比如红景天(Rhodiola L.)属中的唐古特红景天(R.
tangutica)、大花红景天(R.crenulate)(藏名均叫 “苏曼玛
保”)、小丛红景天(R.dumulosa)及狭叶红景天(R.kirilowii
var.latifolia)(藏名“尕都尔”),有活血止血 、化瘀消肿之功
效 ,治疗跌打损伤 、吐血衄血咳血 、月经不调及痢疾等 ,在藏
族医药中将其花 、根入药 ,主治肺病 、神经麻痹症等[ 7] 。
目前针对景天科植物的 DNA提取研究十分缺乏 。为
此 ,该文利用珍贵藏药红景天和观赏用的景天科植物为材
料 ,建立了一种经济高效的 DNA提取方法 ,并对获得的DNA
开展了PCR克隆测序鉴定。
1　材料与方法
1.1　植物材料　大花红景天(R.crenulate)、长鞭红景天(R.
fastigiata)、高山红景天(R.sachalinensis)采自四川省甘孜藏
族自治州;景天科的观赏植物观音座莲(Archangiopteris henry-
i)、红石莲(Echeveria clegans)、红花莲(Echeveria carnicolor)、大
玉珠帘 、小玉珠帘(Sedum morganianum)购买于成都市花市。
1.2　主要试剂　DNA 提取液为 2%CTAB 、1.4 mol/L NaCl、
基金项目　教育部春晖计划项目(Z2004251008)。
作者简介　赵为(1985-),男 ,四川成都人,本科生,专业:药用植物生物
技术。 ＊通讯作者。
收稿日期　2006-07-17
20mmol/L EDTA (pH 8.0)、100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、2%
β-巯基乙醇;氯仿/异戊醇(24∶1),氯仿 ,无水乙醇 , 0.3 mol/L
NaCl ,正丁醇。
1.3　DNA提取方法　取新鲜植物材料 0.2～ 0.3g ,在液氮中
研磨成粉并快速转移到 1.5 ml 离心管中 ,加入 60 ℃预热的
DNA提取液 1ml ,剧烈振荡 ,混匀 , 60 ℃水浴 40min ,其间轻柔
混匀 1 ～ 2次;加入 2/3体积的氯仿/异戊醇(24∶1), 10 000
r/min离心 5min ,取上清液置于另一个离心管中 ,再加入等体
积的氯仿抽提 ,11000 r/min离心 10min ,取出上清液加入等体
积的无水乙醇沉淀 ,冰上放置 30 min , 13 000 r/min离心 15
min ,小心去掉上清液 ,用 70%的酒精润洗 2次 ,晾干 ,溶于
300μl TE中 ,加入 50μl 的 RNase。待溶解后加入 0.3 mol/L
NaCl 1 ml ,等体积的无水乙醇沉淀 ,冰上放置 20 min , 13 000
r/min离心 15min ,倒掉上清液 ,加入 2ml正丁醇 ,55 ℃水浴 10
min ,小心去掉上清液 ,沉淀用 70%酒精润洗 2次 ,晾干 ,溶于
250μl TE中 , -20 ℃保存 ,备用 。
1.4　DNA纯度鉴定　取提取的DNA样品 5μl ,用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测 ,同时用岛津核酸蛋白测定仪进行测定 。
1.5　PCR分析　用线粒体基因 nad7内含子 2的特异引物对
所提取的DNA进行PCR扩增 ,引物序列为 nad7-2F , 5 -GATT-
TACCTTATTCTGATCG -3 ;nad7-3R , 5 -TGTTCTTGGGCCAT-
CATAGA -3 [ 7] 。PCR扩增反应体系为 25μl ,包括 10×PCR
Buffer 2.5μl , 25 mmol/l MgCl2 1.5μl , 10μmol/l 引物各 1μl ,
2mmol/l dNTP 1μl , ddH2O 15.7μl , 5U/μl Tag酶 0.3μl和模板
DNA 2μl ,最后加入一小滴矿物油。扩增反应在 BIO-RAD公
司生产的MyCycleTM Thermal Cycler 中进行 ,94 ℃预变性 3min;
然后 ,94 ℃变性 1min ,55 ℃复性 1min , 72 ℃延伸 2min ,42个
循环;最后 ,72 ℃延伸 10 min 。扩增产物用 1%琼脂糖胶电泳
分离 ,在GDS-Gel Dol 2000凝胶成像系统下扫描照相 。
1.6　PCR扩增片段克隆测序　将PCR扩增产物从琼脂糖胶
中回收 ,将回收的DNA与 pMD18T载体连接 ,转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞 ,并挑取阳性克隆送交北京三博远志生物
公司进行测序。DNA 序列分析运用了 DNAMAN 软件和
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2006, 34(22):5804-5805　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　孙能森
Genebank中的NCBI BLAST服务程序。
2　结果与分析
2.1　提取DNA的纯度　通过 1%琼脂糖凝胶电泳分析所获
得的全部样品DNA均为单一条带 ,无降解的 DNA片段。用
岛津核酸蛋白测定仪测定提取样品DNA的 A260/A280值 ,结果
见表 1。表 1表明 ,所得的 A260/A280值均高于 1.8 ,说明该方
法提取的 DNA具有较高的纯度。
　　表 1 提取 DNA的测定结果
材料名 A260/A280 浓度∥μg/μl
1 大花红景天 2.066 1.56
2 长鞭红景天 2.000 7.76
3 观音座莲 2.053 5.46
4 红石莲 2.065 7.51
5 红花莲 2.022 9.06
6 大玉珠帘 2.039 3.19
7 小玉珠帘 2.010 6.17
8 高山红景天 2.154 6.24
2.2　PCR分析　根据文献报道设计了 nad7内含子 2引物 ,
对供试材料进行DNA扩增。从图 1可以看出 ,以上述方法提
取的DNA为模板 ,从红景天属植物中扩增出了一条约 700 bp
的清晰条带 ,从观赏的景天科植物中扩增出了约 1 000 bp的
清晰条带。
注:1～ 7材料序号同表 1。
图1　景天科几种植物 DNA基因组nad7内含子 2的 PCR扩增
注:箭头之内为内含子。
图2　大花红景天Nad7内含子2的核苷酸序列
2.3　序列分析　对大花红景天的 PCR产物进行回收 、克隆
和测序 ,得到了长度为 791bp的序列 ,序列见图 2 ,登录NCBI ,
获得Genbank号为 DQ508743 。经 NCBI 比对分析 ,证实该序
列为目标Nad7基因的区域。已报道的 10余个高等植物的
Nad7基因相应序列长度多为 1 135 bp以上。从图 1可以看
出 ,红景天 nad7内含子 2与同科植物也存在着差异 ,说明红
景天 nad7内含子 2存在特殊性。
3　讨论
基因组 DNA的提取技术是遗传学与分子生物学研究中
的基本技术。现有多种 DNA 提取方法:CTAB 法[ 1] 、高盐低
pH法[ 2] 、SDS法[ 3] 、苯酚法[ 8] 和提取试剂盒的使用[ 9]等 。但
是 ,对于多数叶厚汁多 、含有大量多糖类和其他次生代谢产
物的景天科植物来说 ,采用常规的方法很难提取出高质量的
DNA ,因而需要改良常规的分离方法 。研究表明 ,在CTAB 法
提取 DNA过程中加入 β -巯基乙醇 ,可防止叶片中的多酚物
质氧化而使DNA呈褐色;接着用低浓度的乙醇和低浓度的
NaCl沉淀DNA ,有利于 DNA 与多糖和其他次生代谢产物的
分离[ 10] ,并且用正丁醇进一步萃取多糖 ,可以纯化DNA 。用
紫外分光光度计结合凝胶电泳分析检测所得的 DNA说明该
方法能有效地去除植物叶片中的多糖 、多酚类和 RNA等物
质 ,并且该方法提取的景天科植物基因组 DNA的纯度和浓
度均能满足进一步的分子生物学研究 ,如 PCR 、酶切和 South-
ern分析等。
该研究利用高质量的DNA对珍贵藏药红景天属 2种植
物和几个观赏景天科植物进行PCR分析。用Nad7基因内含
子 2的保守引物扩增 ,发现在红景天中长度为 791 bp ,而其他
景天科物种的长度为 1100 bp左右。与基因库的序列比对分
析 ,发现在多数被子植物中其长度均在 1 kb以上。红景天内
含子 DNA序列的特殊长度可能与其长期隔离的生态环境即
高原生境上抗辐射或特殊高原适应性有关。
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科技论文写作规范———讨论
着重于研究中新的发现和重要方面 ,以及从中得出的结论 。不必重复在结果中已评述过的资料 ,也不要用模棱两可的
语言 ,或随意扩大范围 ,讨论与文中无多大关联的内容 。
580534卷22期　　　　　　　　　　　　　　赵 为等　景天科植物基因组 DNA的高效提取方法